小鼠抗人CEA单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103173417 A (43)申请公布日 2013.06.26 CN 103173417 A *CN103173417A* (21)申请号 201310041303.3 (22)申请日 2013.02.04 CGMCC No.6911 2012.11.27 C12N 5/20(2006.01) C07K 16/32(2006.01) C12N 15/13(2006.01) (71)申请人 天津三箭生物技术有限公司 地址 300457 天津市滨海新区塘沽经济技 术开发区第四大街 80 号天大科技园 C5-106/311 (72)发明人 张林刚 郗日沫 尹芝南 (54)。

2、 发明名称 小鼠抗人 CEA 单克隆抗体及分泌该单克隆抗 体的杂交瘤细胞株 (57) 摘要 一种小鼠抗人 CEA 单克隆抗体及分泌该单克 隆抗体的杂交瘤细胞株。所述的分泌 CEA 单克隆 抗体的杂交瘤细胞株克隆号为 10E1， 保藏编号为 CGMCC No.6911。本发明还提供了所述杂交瘤细 胞株10E1产生的单克隆抗体。 该抗体包括重链可 变区和轻链可变区， 重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO ： 9， 轻链可变区氨基酸序列为 SEQ ID NO ： 10。本发明还提供了一种 DNA 分子 SEQ ID NO ： 7， 它编码重链可变区氨基酸序列 SEQ ID NO ： 9 ； 一 。

3、种DNA分子SEQ ID NO ： 8， 它编码轻链可变区氨基 酸序列SEQ ID NO ： 10。 该抗体可用于科研或临床 免疫组化检测 CEA 表达。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 5 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 序列表5页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103173417 A CN 103173417 A *CN103173417A* 1/1 页 2 1. 一种以原核表达的 CEA 蛋白免疫小鼠获得的分泌 CEA 单克隆抗体的杂交瘤细胞株 10E。

4、1， 保藏编号为 CGMCC No.6911。 2. 一种由权利要求 1 所述的杂交瘤细胞株 10E1 产生的单克隆抗体。 3. 根据权利要求 2 所述的单克隆抗体， 包括重链可变区和轻链可变区， 重链可变区氨 基酸序列为 SEQ ID NO ： 9， 轻链可变区氨基酸序列为 SEQ ID NO ： 10。 4.一种DNA分子SEQ ID NO ： 7， 它编码权利要求3中所述的重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO ： 9。 5.一种DNA分子SEQ ID NO ： 8， 它编码权利要求3中所述的轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO ： 10。 权 利 要 求 书 CN 103173417。

5、 A 2 1/5 页 3 小鼠抗人 CEA 单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细 胞株 技术领域 0001 本发明涉及以原核表达的CEA蛋白免疫小鼠获得的分泌CEA单克隆抗体的杂交瘤 细胞株 10E1， 属于生物工程技术领域。 背景技术 0002 CEA(carcino-embryonic antigen) 最早从胎儿结肠癌组织中发现， 是胚胎性致癌 抗原， 故名为 “癌胚抗原” 。CEA 的编码基因位于 19 号染色体， 其表达产物是相对分子质量 为 150kDa 300kDa 的糖蛋白。研究表明 CEA 的组分并不单一， 而是一种富含多糖的蛋白 复合物， 其含量 45为蛋白质， 含有岩藻。

6、糖、 甘露糖、 半乳糖以及唾液酸等。 0003 CEA是由胎儿胃肠道上皮组织、 胰和肝细胞所合成。 胎儿早期的消化管及某些组织 均含有合成 CEA 的能力， 但孕六个月以后 CEA 含量逐渐减少， 出生后含量极低， 但在某些恶 性肿瘤患者的血清中可发现其含量有异常升高。因为由细胞分泌产生的 CEA 进入局部体液 及血液中， 所以在直、 结肠癌、 肝癌、 肾癌、 乳腺癌、 食管癌等肿瘤患者的血清及胸、 腹水、 消 化液内均可能出现 CEA 含量异常升高的现象， 肺癌患者胸水的 CEA 含量往往高于血清中含 量。CEA 轻度增加也见于某些良性消化道疾病如肠梗阻、 胆道梗阻、 胰腺炎、 肝硬化、 结。

7、肠息 肉、 溃疡性结肠炎以及吸烟者和老年人。 0004 CEA 是一种常见的肿瘤相关抗原和国际上公认的肿瘤标志物， 它在大多数人体内 胚层来源的肿瘤中都有表达。癌胚抗原 (CEA) 主要存在于直、 结肠癌组织， 也存在于肝癌、 胰腺癌、 肾癌、 乳腺癌、 食管癌、 卵巢癌等肿瘤组织中， 在正常结肠组织中也有少量 CEA 存 在。胎儿肠粘膜内， 结肠癌、 胃癌、 肺癌、 胆管癌等均可见 CEA 指标明显升高。 0005 CEA 测定主要用于结肠癌、 直肠癌、 胃癌、 胰癌、 肝细胞癌、 肺癌、 乳癌以及甲状腺髓 质癌的临床监测， 同时绒毛膜癌、 骨癌、 前列腺癌和卵巢癌等肿瘤中亦可见 CEA， 。

8、但对这些肿 瘤病并无早期诊断价值。 原发性结肠癌、 直肠癌在早期未转移时， CEA阳性率为4580 左右， 已转移的患者其 CEA 的浓度和阳性检出率均升高， 故 CEA 的测定可作为结肠癌、 直肠 癌转移及观察疗效的依据之一。并且 CEA 对肿瘤的诊断预后复发判断有意义， 肿瘤患者经 治疗后 CEA 指标会下降， 若出现升高现象则表明肿瘤预后不良或复发。 0006 目前， 国内外已经获得了多种 CEA 的单克隆抗体， 可用于标记腺上皮来源的腺癌。 但一直以来都需要表达量更多， 亲和性更好， 稀释度更高， 具有更多优良特性的单克隆抗 体。获得活性高的 CEA 的单克隆抗体对于肿瘤发生发展中、 。

9、肿瘤的诊断治疗和预后评价临 床诊断和科学研究具有重要意义。 发明内容 0007 本发明的目的是提供一种高亲和性的、 可用于科研或临床免疫组化检测 CEA 表达 的小鼠抗人 CEA 单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。 0008 为了实现本发明的上述目的， 本发明提供了如下的技术方案 ： 说 明 书 CN 103173417 A 3 2/5 页 4 0009 (1) 根据 CEA 的基因序列 (NM_004363.2) 的编码框， 设计一对特异引物， Trizol Reagent 试剂提取人脂肪组织总 RNA， 将总 RNA 逆转录成 cDNA 并以 cDNA 为模板 PCR 扩增 CE。

10、A 基因， 构建重组表达载体 PET28a-CEA， 转化大肠杆菌 BL21 感受态， IPTG 诱导蛋白表达 并亲和纯化蛋白作为抗原。 0010 (2) 采用经典的细胞融合技术制备 CEA 单克隆抗体。亲和层析纯化抗体蛋白， SDS-PAGE 测定抗体纯度， 直接 ELISA 法测定纯化抗体的滴度。 0011 (3) 通过免疫组织化学分析 CEA 单克隆抗体染色人人结肠腺癌石蜡切片。 0012 (4)根据抗体基因的恒定区序列合成特异性引物， PCR扩增单克隆抗体CEA重链可 变区和轻链可变区， 回收目的片段， 克隆到pGEM-T载体中， 转化大肠杆菌TGl细胞后筛选阳 性克隆， 抽提质粒后测。

11、序确定了单克隆抗体 CEA 的重链和轻链可变区序列。 0013 本发明提供的以原核表达的 CEA 蛋白为抗原、 免疫小鼠获得的分泌 CEA 单克隆抗 体的杂交瘤细胞株， 名称为10E1， 分类命名为小鼠抗人CEA杂交瘤细胞系， 该细胞株10E1已 于 2012 年 11 月 27 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ( 地址 ： 北京 市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研究所 )， 保藏编号为 CGMCC No.6911。 0014 本发明还提供了所述杂交瘤细胞株 10E1， CGMCC No.6911 产生的单克隆抗体。该 抗体包括重链可变区和轻链可变区，。

12、 重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO ： 9， 轻链可变区氨 基酸序列为 SEQ ID NO ： 10。 0015 本发明还提供了一种 DNA 分子 SEQ ID NO ： 7 和 DNA 分子 SEQ ID NO ： 8， DNA 分子 SEQ ID NO ： 7编码重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO ： 9 ； DNA分子SEQ ID NO ： 8编码轻链可 变区氨基酸序列 SEQ ID NO ： 10。 0016 本发明的优点和有益效果 ： 0017 本发明应用重组人的 CEA 蛋白为免疫抗原， 免疫 Balb/c 小鼠， 采用经典的细胞融 合技术， 通过ELISA筛选， 获得。

13、一株能稳定分泌抗CEA的杂交瘤细胞株， 命名为10E1， 亚型鉴 定为IgG1， 将杂交瘤细胞株扩大培养后收集上清， 采用Protein A亲和层析法对CEA单抗进 行纯化。SDS-PAGE 结果显示， 纯化后抗体纯度在 95以上 ； ELISA 滴度测定结果显示， 单抗 的滴度均在 1 10000 以上。人结肠腺癌石蜡切片经抗 CEA 抗体免疫组化染色， 可于光镜 下观察到细胞膜或胞浆中出现明显棕黄色颗粒， 背景清晰， 无非特异性着色。 从实验结果上 来看， 本发明制备了高效价， 高特异性的 CEA 单克隆抗体， 用该抗体检测证实， 其对细胞中 的 CEA 蛋白具有高识别能力， 可用于科研或。

14、临床免疫组化检测 CEA 表达。 附图说明 0018 图 1SDS-PAGE 分析纯化后的 CEA 单克隆抗体。 0019 图 2ELISA 法测定 CEA 单克隆抗体滴度。 0020 图 3 是免疫组织化学检测分析 CEA 单克隆抗体染色人结肠腺癌石蜡切片。 具体实施方式 0021 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常施方法。 0022 实施例 1 ： 杂交瘤细胞株 10E1 及其产生的单克隆抗体的获得 0023 1、 抗原制备 说 明 书 CN 103173417 A 4 3/5 页 5 0024 (1) 获得目的基因 0025 在该实施例中， 根据 CEA 的基因序列 (NM_0043。

15、63.2) 的编码框， 设计 1 对特异引 物 ： 0026 引物 1 ： 5 -AATGGATCCATGGAGTCT CCCTCGGCCC-3 (SEQ ID NO ： 1) 0027 引物 2 ： 5 -ATCCTCGAGCTATATCAGA GCAACC-3； (SEQ ID NO ： 2)Trizol Reagent 试剂提取人脂肪组织总 RNA， 将总 RNA 逆转录成 cDNA 并以 cDNA 为模板 PCR 扩增 CEA 基因。 0028 (2) 构建重组表达载体 0029 将步骤 (1) 获得的 PCR 产物双酶切后回收， 在 T4DNA 连接酶作用下连接入表达载 体 PET2。

16、8a， 构建重组质粒 PET28a-CEA。 0030 (3) 获得含重组表达质粒的表达菌种 0031 将步骤(2)获得的连接产物转化大肠杆菌BL21感受态， 用含有硫酸卡那霉素的固 体培养基筛选， 挑取单斑， 碱裂解法小量抽提质粒， 双酶切初步鉴定。测序验证目的基因的 插入方向及阅读框架均正确， 进入下步操作。以此重组质粒 DNA 转化表达宿主菌的感受态 细胞。 0032 (4) 诱导表达和蛋白纯化 0033 将步骤 (2) 提取的质粒转化 BL21 感受态， 用含有硫酸卡那霉素的固体培养基筛 选， 挑选单克隆至 10ml 含有硫酸卡那霉素的 LB 液体培养基中培养， 37， 220rpm 。

17、培养 10h， 取 5ml 液体培养基转移至 250ml 的大瓶中继续培养， 培养至 OD 值为 0.8， 加入 0.2mM IPTG 诱导表达， 16诱导过夜， 收集菌液超声， 取上清用 Ni-NTA 琼脂糖亲和层析法纯化 CEA 蛋 白。 0034 2、 单抗的制备和纯化 0035 (1)、 免疫动物 0036 一般选用 6-8 周龄雌性 Balb/c 小鼠， 按照预先制定的免疫方案进行三次免疫注 射。 0037 首次免疫。纯化的重组蛋白 CEA( 用适量生理盐水稀释 )+ 完全弗氏佐剂， 100g/ 只， 颈背部皮下多点注射 ； 0038 二次免疫 ( 间隔两周 )。纯化的重组蛋白 CE。

18、A( 用适量生理盐水稀释 )+ 不完全弗 氏 佐剂， 100g/ 只， 颈背部皮下多点注射 ； 0039 三次免疫 ( 间隔两周 )。纯化的重组蛋白 CEA( 用适量生理盐水稀释 )， 不完全弗 氏佐剂， 100g/ 只， 颈背部皮下多点注射 ； 0040 三次免疫后 7 10 天采血， 用建立的 ELISA 法检测效价， 选择效价最高者用于细 胞融合。 0041 加强免疫 ( 融合前 3 天 )， 用纯化的重组蛋白 50g 腹腔注射。3 天后， 取脾脏融 合。 0042 (2)、 细胞融合 0043 采用眼球摘除放血法处死小鼠， 无菌操作取出脾脏， 在平皿内挤压研磨， 制备脾 细胞悬液。将准。

19、备好的同系骨髓瘤细胞 SP2/0 与小鼠脾细胞按一定比例混合 (1 5 1 10)， 并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下， 各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发 生融合， 形成杂交瘤细胞。采用 HAT 选择性培养基， 进行杂交瘤细胞的选择性培养和筛选。 说 明 书 CN 103173417 A 5 4/5 页 6 0044 用ELISA方法检测杂交瘤细胞培养上清 ： 以纯化的CEA蛋白(10g/ml)包被酶标 板， 每孔 100l， 4包板过夜。甩掉包被液， 加入 200l5的脱脂奶粉， 37封闭 1h 后， 洗涤 3 次， 加杂交瘤细胞培养检测上清 100l( 阴性对照为 PBS100l)， 。

20、37孵育 1 小时。 洗涤 3 遍后， 加酶标记二抗 ( 羊抗鼠 IgG-HRP)， 37孵育 1 小时， 去掉酶标二抗， 洗涤 3 遍， 加底物显色剂 50l， 室温静置 5 分钟， 加终止液 50l。用酶标仪检测 450nm 波长处的 OD 值。OD 值明显高于阴性对照 2 倍以上者定为阳性。最后筛选得到一株分泌性能最佳的抗 CEA 杂交瘤细胞株， 命名为 10E1， 亚型鉴定为 IgG1。 0045 将选出的阳性杂交瘤细胞株 10E1 克隆化培养 ( 有限稀释法 )， 获得能产生高效价 单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆。将杂交瘤细胞株扩大培养， 并冻存保种。所述的阳性杂交 瘤细胞为抗人 CEA。

21、 杂交瘤细胞系 10E1， 该细胞系已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心， 保藏号为 CGMCC No.6911。 0046 (3) 单克隆抗体的大量制备与纯化 0047 将步骤 (2) 获得的细胞株 10E1 接种至 Balb/c 小鼠腹腔， 制备腹水， 然后从腹水中 提取抗体。 0048 单克隆抗体 CEA 的纯化 ： 采用 Protein A 亲和层析法。首先制备 protein A 亲和 柱， 用 PBS 平衡柱子后， 取抗 CEA 的腹水过柱， 然后用 PBS 洗至 OD 值接近于零， 以 50mmol/ LPH2.5的甘氨酸-HCl溶液(PH)洗脱， 收集峰值区的洗。

22、脱液， 经透析浓缩后备用。 SDS-PAGE 结果显示， 纯化后抗体纯度在 95以上 ( 参见图 1)。 0049 (4) 直接 ELISA 法测定纯化抗体的滴度 0050 以纯化的 CEA 蛋白 (10g/ml) 包被酶标板， 每孔 100l， 4包板过夜。甩掉包 被液， 加入 200l5的脱脂奶粉， 37封闭 1h 后， 洗涤 3 次， 将纯化的抗体按 1 200， 1 400， 1 800， 1 1600， 1 3200， 1 6400， 1 12800 进行稀释， 以每孔 100l 加入 酶标板中 ( 阴性对照为 PBS100l)， 37孵育 1 小时。洗涤 3 遍后， 加酶标记二抗 。

23、( 羊抗鼠 IgG-HRP)， 37孵育 1 小时， 去掉酶标二抗， 洗涤 3 遍， 加底物显色剂 50l， 室温静置 5 分 钟， 加终 止液 50l。用酶标仪检测 450nm 波长处的 OD 值。ELISA 滴度测定结果显示， 单 抗的滴度均在 1 10000 以上 ( 参见图 2)。 0051 实施例 2 ： 单克隆抗体免疫组化应用检测 0052 用 CEA 单抗， 按常规法作病理切片， 对人结肠腺癌石蜡切片进行免疫组化染色。 0053 具体方法为 ： 0054 (1) 脱蜡 0055 切片依次置于二甲苯 I、 II、 III 脱蜡每次 5 分钟， 移至无水乙醇 I、 II 中各浸泡 4。

24、 分钟， 移至 95酒精中浸泡 4 分钟， 移至 85酒精中浸泡 4 分钟， 再移至 70酒精中浸泡 4 分钟， 流水冲洗 2 分钟。 0056 (2) 抗原修复 0057 将已冲洗干净组织切片放入高压锅内， 加入约 3000ml 左右的柠檬酸盐抗原修复 液 (pH6.0)， 高火加热煮沸后调至低火保持沸腾喷气 3 分钟， 关掉电磁炉开关， 两分钟后将 高压锅移至冷水中冷却， 待高压锅内抗原修复液完全冷却后， 打开高压锅将组织切片用流 水冲洗干净移至蒸馏水中浸泡 2 分钟。 0058 (3) 阻断 说 明 书 CN 103173417 A 6 5/5 页 7 0059 3 H2O2中浸泡 10。

25、 分钟， 流水冲洗蒸馏水冲洗。取出切片， 擦干组织周围的水， 用 免疫组化笔在组织块周围画一圆圈注意圈接头要接好， 防止抗体跑出圈外造成假阴性。 PBS 缓冲液冲洗。 0060 (4) 滴加一抗 0061 甩去待测组织切片上多余的 PBS， 滴加一抗， 其中一抗为实施例 1 步骤 (3) 制备并 纯化的 CEA 单克隆抗体， 稀释度为 1 2000。放置在孵育盒内 4冰箱中过夜孵育约 12 小 时。 0062 (5) 滴加二抗 0063 将孵育盒从冰箱取出， 恢复至室温后取出切片， 用 PBS 洗 3 次， 每次 5 分钟。滴加 通用型二抗 -HRP 聚合物。将切片放入孵育湿盒中， 盖上盖子，。

26、 连孵育盒一起放入 37恒温 箱中孵育 30 分钟。 0064 (6) 显色、 衬染、 封片 0065 取出切片， 擦掉组织周围的多余的PBS， 加入DAB显色液中显色35分钟， 在显微 镜下控制染色的强度。待强度适中后将切片置自来水中终止显色， 再用流水冲洗 5 10 分 钟， 苏木素染液复染 1 分钟， 0.5盐酸酒精分化 3 秒钟， 流水冲洗 5 10 分钟， 脱水、 透明、 封片、 镜检。 0066 结果判定 ： 按照国外学者对组织中 CEA 的判定标准， CEA 蛋白阳性反应为出现明显 棕黄色颗粒， 定位于细胞膜或胞浆。人结肠腺癌组织 ( 参见图 3) 经抗 CEA 抗体免疫组化染 。

27、色， 可于光镜下观察到细胞膜或胞浆内出现明显棕黄色颗粒， 背景清晰， 无非特 异性着色， 说明此 CEA 小鼠单克隆抗体可以特异性的应用于免疫组织化学实验。 0067 实施例 3 ： 单克隆抗体可变区测序 0068 根据抗体基因的恒定区序列合成以下引物 ： 0069 zh07 5 -GGGGATATCCACCATGGRATGSAGCTGKGTMATSCTCTT-3 (SEQ ID NO ： 3) 0070 zhr11 5 -GACHGATGGGGSTGTYGTGCTAGCTGNRGAGACDGTGA-3 (SEQ ID NO ： 4) 0071 zl01 5 -GGGGATATCCACCATG。

28、GAGACAGACACACTCCTGCTAT-3 (SEQ ID NO ： 5) 0072 zlr05 5 -GGATACAGTTGGTGCAGTCGACTTACGTTTKATTTCCARCTT-3 (SEQ ID NO ： 6) 0073 Trizol Reagent 试剂分别提取 5106杂交瘤细胞 10E1 的总 RNA， 将总 RNA 逆转 录成 cDNA。用 zh08 和 zhr11 为引物进行 PCR 扩增单克隆抗体 CEA 重链可变区， 用 zl01 和 zlr05 为引物进行 PCR 扩增单克隆抗体 CEA 轻链可变区， PCR 反应均采用热启动， 反应条件 ： 94 5 分钟。

29、 ； 94 45 秒， 60 45 秒， 72 1 分 10 秒， 30 个循环 ； 72 7 分钟。PCR 产物经 1琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化目的片段 ( 轻链长度 391bp， 重链长度 420bp)。克隆到 pGEM-T(Promega)载体中， 转化大肠杆菌TGl细胞后在IPTGIX-gal平板上进行筛选， 取白色 菌斑接种于含有氨韦青霉素的 LB 液体培养基中扩增。筛选阳性克隆， 用 QIAGEN 的质粒抽 提试剂盒抽提质粒并进行测序， 确定了单克隆抗体 CEA 的重链和轻链可变区序列。 0074 单克隆抗体 CEA 可变区的 DNA 序列和氨基酸序列 ： 0075 单克隆抗体 。

30、CEA 重链可变区 DNA 序列 (5 3， 405bp)(SEQ ID NO ： 7) ； 0076 单克隆抗体 CEA 的轻链可变区 DNA 序列 (5 3， 394bp)(SEQ 1D NO ： 8) ； 0077 单克隆抗体 CEA 重链可变区的推断氨基酸序列 (133 氨基酸 )(SEQ ID NO ： 9) ； 0078 单克隆抗体 CEA 轻链可变区的推断氨基酸序列 (130 氨基酸 )(SEQ10ID NO ： 10)。 说 明 书 CN 103173417 A 7 1/5 页 8 0001 0002 序 列 表 CN 103173417 A 8 2/5 页 9 0003 序 列 表 CN 103173417 A 9 3/5 页 10 0004 序 列 表 CN 103173417 A 10 4/5 页 11 0005 序 列 表 CN 103173417 A 11 5/5 页 12 序 列 表 CN 103173417 A 12 1/1 页 13 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103173417 A 13 。