用于检测高危型HPV的试剂盒.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103173564 A (43)申请公布日 2013.06.26 CN 103173564 A *CN103173564A* (21)申请号 201110432629.X (22)申请日 2011.12.21 C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 广州好芝生物科技有限公司 地址 510663 广东省广州市广州开发区科学 城科学大道 182 号创新大厦 C2901 室 (72)发明人 曾庆 张中满 张颖芬 罗晓兰 (74)专利代理机构 广州三环专利代理有限公司 44202 代理人 王基才 (54) 发明名称 用于检测。

2、高危型 HPV 的试剂盒 (57) 摘要 本发明公开了一种特异性检测样品中是否存 在 HPV16 亚型和 18 亚型的试剂盒， 所述试剂盒包 括 ： (i) 如 SEQ ID NO:1 和 2 所示的用于 PCR 扩 增 HPV16 亚型 DNA 的第一引物对 ； (ii) 如 SEQ ID NO:3 和 4 所示的用于 PCR 扩增 HPV18 亚型 DNA 的 第二引物对 ； 以及(iii)如SEQ ID NO:5和6所示 的用于与 PCR 扩增产物杂交的一对探针或与 SEQ ID NO:5和6所示的序列互补的序列的一对探针。 本发明在一个实验点上同时检测 16 型和 18 型 HPVDN。

3、A， 只要检测样本里包含 HPV16 型和 / 或 18 型 DNA 并达到一定的检测限， 检测结果即为阳性。 试剂盒的反应简单， 灵敏度高， 通量高， 并且可减 少实验操作时间和杂交试剂用量， 适用于 HPV16、 18 型感染的临床筛查。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103173564 A CN 103173564 A *CN103173564A* 1/1 页 2 1. 一种特异性检测样品中是否存在 HPV16 亚型或 1。

4、8 亚型的试剂盒， 其特征在于 ： 所 述试剂盒包括 ： (i) 如 SEQ ID NO:1 和 2 所示的用于 PCR 扩增 HPV16 亚型 DNA 的第一引物 对 ； (ii) 如 SEQ ID NO:3 和 4 所示的用于 PCR 扩增 HPV18 亚型 DNA 的第二引物对 ； 以及 (iii) 如 SEQ ID NO:5 和 6 所示的用于与 PCR 扩增产物杂交的一对探针或与 SEQ ID NO:5 和 6 所示的序列互补的序列的一对探针。 2.根据权利要求1所述的试剂盒， 其特征在于 ： 所述试剂盒还包含(iv) 如SEQ ID NO: 7 和 8 所示的用于 PCR 扩增人类。

5、 - 球蛋白基因的片段的引物对 ； 以及如 SEQ ID NO: 9 所 示的用于与人类 - 球蛋白扩增产物特异性结合的探针。 3.根据权利要求1或2所述的试剂盒， 其特征在于 ： 所述引物均在5 端标记有生物素。 4. 根据权利要求 2 所述的试剂盒， 其特征在于 ： 所述试剂盒中还包含 (v) 如 SEQ ID NO: 10 所示的一段 3 端经生物素修饰的随机寡核苷酸探针。 5. 根据权利要求 4 所述的试剂盒， 其特征在于 ： 所述探针均在 5 端连接有氨基。 6. 根据权利要求 1 所述的试剂盒， 其特征在于 ： 所述样品为宫颈脱落细胞、 液基细胞学 标本或石蜡组织切片。 7. 根据。

6、权利要求 6 所述的试剂盒， 其特征在于 ： 所述样品为宫颈脱落细胞。 8. 根据权利要求 1 所述的试剂盒， 其特征在于 ： 所述 PCR 扩增所用的模板 DNA 为 5 ng 至 100 ng。 9. 根据权利要求 7 所述的试剂盒， 其特征在于 ： 所述 PCR 的扩增条件为 95 9 min ； 95 20 s、 55 30 s 、 72 30 s， 共 40 个循环 ； 72 5 min ； 4保存。 10.根据权利要求8所述的试剂盒， 其特征在于 ： 所述PCR扩增的各步变温速率为1/ s。 权 利 要 求 书 CN 103173564 A 2 1/5 页 3 用于检测高危型 HP。

7、V 的试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及一种用于检测高危型 HPV 的试剂盒和方法， 尤其是一种用于检测 HPV16 亚型和 HPV18 亚型的试剂盒和方法。 背景技术 0002 临床研究表明， 人类乳头状瘤病毒 (HPV) 是目前为止唯一明确的致癌病毒， 其持 续性感染将导致宫颈癌变和子宫颈上皮内瘤变。经过近 30 年的大量研究表明， 宫颈的高危 型 HPV 持续感染是引起宫颈癌及癌前病变的直接原因。预防高危型 HPV 感染就可以预防宫 颈癌前病变， 从而避免晚期癌症发生。高危型 HPV 中， 其中， HPV16(53%)、 HPV18(15%) 等的 感染是引起宫颈癌变的重要因素， 因。

8、此进行该病毒的筛查是预防子宫疾病和宫颈癌的最有 效方法。 0003 目前， 临床上应用的 HPV DNA 检测方法主要有以下几种 ： 杂交捕获检测法、 PCR 检 测法、 PCR 结合杂交检测法和 ELISA 方法。 0004 杂交捕获检测法的代表产品为 QIAGEN(Gaithersburg, Inc.) 公司的高危型人乳 头瘤病毒检测试剂盒(Hybrid Capture2 High-Risk HPV DNA Test)。 此种方法检测价格昂 贵， 无法在基层医院普及应用， 且该产品只能对 13 种高危型 HPV 的 DNA 进行定性检测， 检测 覆盖病毒型别较少， 在 HPV 筛查检测中应。

9、用有一定的局限性。 0005 近年来发展了实时荧光PCR(Real-time PCR)检测方法。 实时荧光PCR技术使PCR 扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件下进行， 并通过微机控制， 实现了对 PCR 扩增 产物进行实时动态检测和自动分析结果， PCR 与杂交共享的方法避免了单纯使用 PCR 所造 成的假阳性， 进一步提高了检测的特异性。但此种方法检测 HPV 的型别一般只包括一部分 常见高危型别的 HPV， 检测型别覆盖范围较小， 且配套设备价格昂贵， 同样无法在基层医院 普及。 0006 PCR 结合杂交检测法进行基因诊断灵敏、 快捷， 结果可靠。核酸杂交法的灵敏度和 特异性均显着。

10、高于传统的检测方法， 并且可应用特异性探针对 HPV 分型， 已有的商业化检 测试剂盒产品包括人乳头瘤病毒基因分型检测试剂盒(PCR-反向点杂交法)和人乳头状瘤 病毒核酸扩增分型检测试剂盒。这些试剂盒在检测的同时还对所检测到的病毒进行分型， 方便临床诊断， 但由于 HPV 16 和 18 两种亚型是最主要的高危病毒亚型， 因此对于每份样 品如果都使用能够区分出各种亚型的试剂盒或基因芯片来检测的话， 无疑会造成资源的浪 费。 0007 此外， 还有欧洲 Innogenetics 的 INNO-LiPA HPV 分型试剂盒、 罗氏 (Roche) 的 Line Blot HPV 试剂盒， 是以条形。

11、膜作传统杂交分型， 也相当费时而手段繁复。以 ELISA 类 型分析方法如罗氏(Roche)的 AMPLICOR HPV MWP 试剂盒因为稳定性、 灵敏度等问题， 未能 得到广泛应用。 0008 有鉴于此， 需要提供一种更加便利、 实用、 稳定和节约型的检测方法和试剂盒。 说 明 书 CN 103173564 A 3 2/5 页 4 发明内容 0009 本发明一方面提供了一种特异性检测样品中是否存在HPV 16亚型或18亚型的试 剂盒， 所述试剂盒包括 ： (i) 如 SEQ ID NO:1 和 2 所示的用于扩增 HPV16 亚型 DNA 的第一引 物对 ； (ii) 如SEQ ID NO。

12、:3和4所示的用于扩增HPV18亚型DNA的第二引物对 ； 以及(iii) 如 SEQ ID NO:5 和 6 所示的用于与扩增产物杂交的一对探针或与 SEQ ID NO:5 和 6 所示的 序列互补的序列的一对探针。 0010 在优选的实施方式中， 本发明的试剂盒中还包含 (iv) 如 SEQ ID NO: 7 和 8 所示 的用于扩增人类-球蛋白基因的片段的引物对 ； 以及如SEQ ID NO: 9所示的用于与人类 - 球蛋白扩增产物特异性结合的探针。 0011 在优选的实施方式中， 所述引物均在 5 端标记有生物素。 0012 在优选的实施方式中， 所述探针均在 5 端连接有氨基。 00。

13、13 在优选的实施方式中， 本发明的试剂盒中还包含 (v) 如 SEQ ID NO: 10 所示的一 段 3 端经生物素修饰的随机寡核苷酸探针。 0014 在优选的实施方式中， 所述样品为宫颈脱落细胞、 液基细胞学标本或石蜡组织切 片。 0015 在优选的实施方式中， 所述 PCR 扩增所用的模板 DNA 为 5 ng 至 100 ng。 0016 在优选的实施方式中， 所述 PCR 的扩增条件为 95 9 min ； 95 20 s、 55 30 s 、 72 30 s， 共 40 个循环 ； 72 5 min ； 4 保存。 0017 在优选的实施方式中， 所述 PCR 扩增的各步变温速率。

14、为 1 /s。 0018 本发明另一方面提供了一种检测样品中是否存在 HPV 16 亚型和 18 亚型的方法， 所述方法包括 ： (a) 提取样品的 DNA ； (b) 使用 SEQ ID NO: 1 至 4 的引物对所提取的 DNA 进 行 PCR 扩增 ； (c) 利用导流杂交技术使用 SEQ ID NO:5 和 6 的探针与 PCR 扩增的产物进行 杂交 ； 以及(d)通过显色反应识别是否发生杂交反应从而确定样品中是否存在HPV 16亚型 和 18 亚型。 0019 在优选的实施方式中， 步骤 (b) 还包括使用 SEQ ID NO: 7 和 8 所示的用于扩增人 类 - 球蛋白基因的片。

15、段的引物对， 并在步骤 (c) 中使用如 SEQ ID NO: 9 所示的用于与人 类 - 球蛋白扩增产物特异性结合的探针。 0020 在优选的实施方式中， 步骤 (c) 还包括使用 SEQ ID NO: 10 所示的一段 3 端经生 物素修饰的随机寡核苷酸探针作为对照。 0021 本发明方法和试剂盒采用 PCR 结合杂交检测法， PCR 技术扩增 HPV DNA， 扩增产物 通过导流杂交技术与低密度 DNA 芯片进行反向点杂交， 检测结果转化成肉眼可识读信号。 此方法和试剂盒用于检测样本中是否含有高危型 ( 包括 16 型和 18 型 )HPV DNA， 但对 HPV 不作具体分型。本发明在。

16、一个实验点上同时检测 16 型和 18 型 HPVDNA， 只要检测样本里包 含 HPV16 型和 / 或 18 型 DNA， 并达到一定的检测限， 检测结果即为阳性。试剂盒的反应简 单， 灵敏度高， 通量高， 并且减少实验操作时间和杂交试剂用量， 适用于 HPV16、 18 型感染的 临床筛查。 附图说明 0022 下面结合附图和具体实施方式， 对本发明及其有益技术效果进行进一步说明。 说 明 书 CN 103173564 A 4 3/5 页 5 0023 图 1 显示 HPV 检测阴性和阳性结果判读信号位置。 0024 图 2 是本发明的一个实施例中 HPV16、 18 的临床样本检测结果。

17、。 0025 图 3 是本发明的一个实施例中试剂盒的检测结果。 0026 图 4 是本发明的另一个实施例中试剂盒的检测结果。 具体实施方式 0027 本发明利用 DNA 扩增和 “导流” 反向点杂交技术来实现。首先， 利用生物素标记的 引物来扩增 HPV 基因组特异片段 ； 然后， 通过 “导流” 杂交方法， 使生物素标记的扩增片段被 特异性寡核苷酸探针杂交捕获， 而后进行信号放大， 以识别检测结果。 实施例 0028 本发明提供一种检测高危型 HPV 的试剂盒及其检测方法， 所述方法主要包括以下 步骤 ： (a) 提取样品的 DNA ； (b) 使用 SEQ ID NO: 1 至 4 的引物。

18、对所提取的 DNA 进行 PCR 扩 增 ； (c) 利用导流杂交技术使用 SEQ ID NO:5 和 6 的探针与 PCR 扩增的产物进行杂交 ； 以及 (d)通过显色反应识别是否发生杂交反应从而确定样品中是否存在HPV 16亚型和18亚型。 以下以宫颈脱落细胞为例， 具体说明本发明的方法。 但应理解的是， 本发明的试剂盒和方法 仍可适用于其他临床样品。 0029 (I) 样品 / 标本采集及保存 以无菌棉拭子或宫颈刷刷取患者的宫颈脱落细胞， 以及用于活检的组织标本或疣组 织， 置于低温冰箱 (-70或 -20 ) 保存。 0030 (II) DNA 提取 加入 1ml 无菌生理盐水， 充分。

19、震荡摇匀， 吸取全部液体转至 1.5ml 离心管中， 12000rpm 离心 5 分钟， 去上清， 沉淀用 QIAampc Blood Mini 试剂盒 (QIAGEN) 按照 Blood and body Fluid Spin 操作规程进行 DNA 的提取。将提纯 DNA 存放在 -20 -15备用。 0031 (III) 目的 DNA 的扩增 每个 PCR 反应的总体积是 25L， 反应体系如下表 1 所示。 0032 表 1. PCR 反应体系 组分名称用量 (L) Taq 酶 (5U/L)0.5 10PCRbuffer2.5 MgCl2(25mM)4 dNTP 混合物 ( 各 2.5m。

20、M) 2 ACF(10M)0.5 ACR(10M)0.5 HPV16F(15M)0.5 HPV16R(15M)0.5 HPV18F(15M)0.5 HPV18R(15M)0.5 模板 DNA1-5L ddH2O加至 25L 其中， DNA 模板使用范围为 5ng 100ng。PCR 引物序列 ： 特异性引物包括 ACF 引物 (SEQ ID NO:7)、 ACR 引物 (SEQ ID NO:8)、 HPV16F 引物 (SEQ ID NO:1)、 HPV16R 引物 (SEQ 说 明 书 CN 103173564 A 5 4/5 页 6 ID NO:2)、 HPV18F 引物 (SEQ ID 。

21、NO:3)， HPV18R(SEQ ID NO:4)。其中， ACF 引物、 ACR 引物是 用于扩增人类-球蛋白基因中一段约200 bp的片段 ； HPV16F引物、 HPV16R引物、 HPV18F 引物， HPV18R 是扩增 HPV DNA L1 区一段 450 bp 左右的片段。 0033 解冻 PCR 反应液各组分， 在移液前混匀并离心各 PCR 试剂。按上表在冰浴上配制 PCR 反应体系， 充分混匀。快速离心使液体集中在管底。将 PCR 管放进 PCR 仪中， 按如下设 置运行 PCR 程序。扩增程序如下 ： (PCR 各步变温速率为 1 /s) (IV) “导流” 杂交 杂交和。

22、显色过程中所使用的各试剂组成成分如下表 2 所示。 0034 表 2. 导流杂交使用的各试剂成分 试剂名称 组分 杂交液2SSC、 0.1%SDS 封闭液1% 脱脂奶粉 酶联物SAV-AP、 StabilZyme 洗液TBS、 0.1%Tween20 显色液BCIP/NBT 终止液0.2%TrisBase、 0.1%0.5MEDTA 杂交膜20M 探针 (0.4L)、 BiodyneC 膜 将杂交液置于 41水浴进行预热， 其他杂交试剂各组分平衡至室温 (20 25 )。 将 PCR 产物置于水浴或 PCR 仪上， 95热变性 5 分钟， 迅速将其取出放入冰水浴中快速冷却 至少 2 分钟。参考。

23、 “导流” 杂交仪使用手册设置杂交仪。按杂交仪使用手册将杂交膜铺于 杂交仪的杂交室内， 组装完毕进行升温， 当温度升至 41时， 取 100L 预热好的杂交液到 每个样本孔， 合盖防止热量散发， 进行预杂交至少 2 分钟。 0035 取 100L 已预热的杂交液到已变性的 PCR 产物中， 混匀。开泵吸除预杂交液， 关 泵。将以上步骤中准备好的各 DNA 样本 (125L) 加到各样本孔中 ( 一个样本对应一个样 本孔 )， 合盖 41孵育 1 分钟。开泵让样本通过膜。在开泵状态下， 用 150L 的杂交液洗 膜， 一共洗 2 次。关泵。 0036 杂交膜为 Biodyne C 膜先经 0.1。

24、M HCl 室温孵化 2 分钟， 再转入 20%(W/V)EDC 溶液 中孵化15分钟， 然后用超纯水浸泡3次， 每次1分钟， 取出室温晾干， 于28保存备用。 已活化的 Biodyne C 膜， 按从上至下次序分别点 HC、 AC、 HPV 探针， 点完探针晾干后， 将膜浸 入 0.1M NaOH 溶液孵化 10 分钟， 再用超纯水浸泡 3 次， 每次 1 分钟。取出室温完全晾干后 包装成 HPV 杂交膜， 储存于 2 8。 0037 特异性探针包括HC探针(SEQ ID NO:10)、 AC探针(SEQ ID NO:9)和HPV探针(SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6)。三。

25、种探针合成时均经 5 端氨基修饰， 有助于固定在 Biodyne C 说 明 书 CN 103173564 A 6 5/5 页 7 膜上。其中 AC 探针是一段特异性寡核苷酸序列， 可以和人类 - 球蛋白扩增产物特异性结 合 ； HC探针是3 端经生物素修饰的一段随机寡核苷酸序列， 用于控制杂交过程 ； HPV探针可 以与 HPV16、 18 扩增产物进行特异性结合。 0038 设置杂交仪温度为 25， 等待温度达到设置温度。每孔加封闭液 100L 孵育 5 分钟。开泵完全吸除封闭液， 关泵。在 25 (3 ) 时， 加 100L 酶联物， 孵育 3 分钟。 将温度设置为 36， 开泵， 彻底。

26、吸除酶联物溶液。用 150L 洗液洗膜 2 次， 关泵。每孔加 100L 封闭液， 孵育 1 分钟。开泵， 完全吸除封闭液， 关泵。当温度达到 36 (1 )， 各 孔加 100L 显色液。合盖孵育直到显色。开泵， 吸除显色液。保持开泵状态， 用 150L 洗 液洗膜 1 次， 关泵。加 100L 终止液， 合盖孵育 1 分钟， 开泵， 吸除终止液。关泵。移走分 隔器， 并用洁净干燥的镊子将膜取出放到吸水纸上， 判读检测结果。 0039 (V) 结果判读 图1和表3显示的是HPV 检测结果示意图和结果判读。 膜杂交结果可以由图和表格直 接比较分析得出。( 清晰可见的点代表阳性结果。1 号信号位。

27、置 ： 杂交控制 (HC)， 2 号信号 位置 ： 扩增控制 (AC)， 3 号信号位置 ： 16/18 型 HPV 检测信号。) 表 3. HPV 结果判读 信号点 ( 位置 )阴性 HPV 阳性 HPV 扩增量不足、 失败或空白对照 (NTC) 杂交控制 (1)+ 扩增控制 (2)+- HPV 检测信号 (3)-+- 实施例 1 HPV16、 18 检测试剂盒的使用 (1) 标本采集及保存 ： 以无菌棉拭子或宫颈刷刷取患者的宫颈脱落细胞， 以及用于活 检的组织标本或疣组织， 置于低温冰箱 (-70或 -20 ) 保存。 0040 (2) 宫颈刷、 宫颈拭子 ： 加入 1ml 无菌生理盐水，。

28、 充分震荡摇匀， 吸取全部液体转 至 1.5ml 离心管中， 12000rpm 离心 5 分钟， 去上清， 沉淀用 QIAampc Blood Mini 试剂盒 (QIAGEN) 按照 Blood and body Fluid Spin 操作规程进行 DNA 的提取。将提纯 DNA 存放 在 -20 -15备用。 0041 (3)PCR 扩增和杂交检测 用上述方法进行DNA PCR扩增和杂交， 用含HPV16、 18的临床样本进行检测， HC、 AC、 HPV 都为阳性， 说明可以检测出 HPV16 和 HPV18。结果如图 2 所示。 0042 实施例 2. 本发明试剂盒和方法的特异性实验 。

29、用不含HPV16、 18， 但含其他常见的19种HPV型别(包括6、 11、 31、 33、 35、 39、 42、 43、 44、 45、 51、 52、 53、 56、 58、 59、 66、 68、 81 型 ) 临床样本进行检测， HC、 AC 阳性， HPV 点阴性， 说明本 检测特异性很好。结果见图 3 所示。 0043 实施例 3. 本发明试剂盒和方法的特异性实验 用不含 HPV16、 18， 但含其他病原体的 ( 支原体、 衣原体、 淋球菌 ) 阴性样本进行检测， HC、 AC 显色， HPV 点不显色， 说明本试剂盒的不会出现假阳性。结果见图 4 所示。 0044 本发明已结合具体实施例和实验证据进行描述， 但应理解的是， 本领域技术人员 在已公开的实施例的基础上可对本发明进行各种修改或等同替换， 而不违背本发明的精 神， 这些修改和等同替换也被视为本发明的范围之内。 说 明 书 CN 103173564 A 7 1/2 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103173564 A 8 2/2 页 9 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103173564 A 9 。