适用于PCR的棉花基因组DNA快速、批量制备方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102925430 A (43)申请公布日 2013.02.13 CN 102925430 A *CN102925430A* (21)申请号 201210514827.5 (22)申请日 2012.12.05 C12N 15/10(2006.01) (71)申请人中国科学院新疆生态与地理研究所地址 830011 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市北京南路 40 号附 3 号 (72)发明人张道远李小双李海燕 (74)专利代理机构乌鲁木齐中科新兴专利事务所 65106 代理人张莉 (54) 发明名称适用于PCR的棉花基因组DNA快速、批量制备方法 (57。

2、) 摘要本发明公开了一种适用于 PCR 的棉花基因组 DNA 快速、批量制备方法，涉及作物育种领域转基因作物的分子检测。该方法是由取棉花植株顶部的幼嫩叶片装入离心管中，加入提取液和钢珠，对样品进行破碎处理，然后水浴，加抽提液抽提，用异丙醇沉淀 DNA，再用乙醇洗涤，沉淀溶于水即为提取的DNA。本发明解决了棉花基因组DNA提取步骤复杂、耗时耗力的问题，提供了一种能够快速、批量的提取满足PCR检测需求的DNA的方法，能够应用于转基因棉花育种和安全性申报等环节中的分子生物学检测。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页说明书 8 页附图 2 页。

3、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书 1 页说明书 8 页附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种适用于 PCR 的棉花基因组 DNA 快速、批量制备方法，其特征在于按下列步骤进行： a、取健康的棉花叶片0.05-0.15g放入2mL离心管内，加入600L的提取液为NaCl、三羟甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸钠、聚乙烯聚吡咯烷酮、 - 巯基乙醇和 RNase A 的混合物，并加入两粒钢珠； b、将步骤 a 装有样品的离心管放入细胞破碎仪内，于 30HZ 的频率破碎 5min 处理，将处理后的离心管放入温度 65水浴锅中水浴 10。

4、min ； c、取出离心管，在室温下加入 700L 氯仿 : 异戊醇的抽提液抽提一次， 7000rpm 离心 6min， d、吸上清于新的离心管中，加等体积的异丙醇混匀，室温放置 10min， 12000rpm 离心 6min，弃上清，得到 DNA 粗提沉淀； e、将所得 DNA 粗提沉淀用 1mL 体积浓度为 75% 的乙醇洗涤， 12000rpm 离心 3min，弃上清液，得到 DNA 沉淀，再加 60L 灭菌双蒸水，温度 -20保存即可。 2. 根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于步骤 a 中所述的提取液为 NaCl 500mmol/ L、三羟甲基氨基。

5、甲烷 50mmol/L， pH=8.0、十二烷基硫酸钠 2%、聚乙烯聚吡咯烷酮 6%、 - 巯基乙醇 1% 和终浓度为 20g/mL 的 RNase A 的混合物。 3. 根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于步骤 a 中钢珠的粒径为 4-6mm。 4. 根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于步骤 a 中的棉花叶为从大田棉花植株顶部取幼嫩叶片装入 2mL 离心管投入液氮罐中带回实验室储存于 -80冰箱，或从任何室内栽培的棉花植株上取幼嫩叶片装入 2mL 离心管投入液氮中并存于 -80冰箱。 5. 根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于步骤 c 中抽提液体积比氯仿 : 异。

6、戊醇 =24:1。权利要求书 CN 102925430 A 2 1/8 页 3 适用于 PCR 的棉花基因组 DNA 快速、批量制备方法技术领域 0001 本发明涉及一种用于 PCR 的棉花基因组 DNA 快速、批量制备方法。背景技术 0002 棉花是我国乃至世界范围内重要的经济作物，目前我国是世界上最大的棉花生产国。近年来，随着分子生物学技术与遗传育种技术的不断发展，一大批具有抗生物胁迫（抗虫）和抗非生物胁迫（抗除草剂、抗旱）的基因成功转入棉花。这些优质的基因资源为作物丰产和减少环境污染做出了重大的贡献。然而在培育新品种时，每一代转基因棉花的大田检。

7、测工作一直是困扰育种家和分子生物学研究者的一大难题。因为该环节工作量大，费时费力。经常需要短时间内从大田种植的几千株甚至上万株棉花中鉴定出转基因阳性株。这就需要一种简便、高效、快速的鉴定转基因大田试验材料的分子生物学方法。而且，根据我国转基因农作物安全性申报的要求，转基因棉花安全性申报也需要进行分子生物学检测。目前对转基因作物的检测方法可分为蛋白检测方法和核酸检测方法，而核酸检测方法中的聚合酶链式反应（PCR）技术由于其高灵敏度、高特异性、操作简便已经成为转基因植物及其产品检测的主要方法。 0003 进行PCR检测的前提是快速大量的提取棉花的基因组DNA。目前。

8、，对于小麦、玉米、水稻、大豆和油菜等均已建立起高效快速提取基因组 DNA 的技术。但对于棉花来说，由于棉花富含棉酚、多糖、单宁等次生代谢产物，该类物质在细胞破碎时极易氧化，并能与核酸和蛋白结合形成复合物，影响高质量棉花 DNA 的提取，进而影响后续 PCR、酶切等一系列分子生物学操作。比如传统的 CTAB 法利用高盐溶液沉淀蛋白和酸性多糖，低盐溶液沉淀核酸的原理去除蛋白和糖类物质，但这样便增加了加入不同浓度 NaCl 并抽提、离心将其去除的操作，同时为了提高得率往往需要长时间的沉淀、冰浴等步骤。而 SDS 法以及基于该法改进的各种方法则利用 SDS。

9、充分裂解细胞释放核酸物质，并用氯仿：异戊醇反复抽提的方法来纯化 DNA，但是该法对棉花这种富含次级代谢产物的物种来说提取效率很低。很多改进的 SDS 法加入抗氧化物质来抑制酚类物质的氧化以提高产率，但效果并不理想。有学者提出 CTAB-SDS 结合的改良方法提取棉花基因组 DNA，虽然得到了大量的高质量的基因组 DNA，但仍步骤复杂、耗时较长，不适于转基因棉花的快速 PCR 检测。另外，以往的取材方法多为取功能叶后包入纸袋或塑料袋中带回实验室，然后直接放入冰箱冷冻直至使用。这样的取材方法增加了材料在离体、运输、实验前装管编号等环节的操作时间以及样品反复冻融的。

10、次数，导致 DNA 降解，进一步增加了棉花高质量基因组 DNA 提取的难度。 0004 PCR 技术可以实现在体外对目标 DNA 进行上百万次的扩增，因此是目前最准确的检测转基因作物及其产品的方法之一。该技术对模板 DNA 的纯度要求并不是十分严格，而且需要的量也并不是很多。因此，能够找到一种快速提取并能满足 PCR 扩增需求的棉花基因组 DNA 的方法是解决转基因棉花育种中阳性株检测工作量大问题的关键。发明内容说明书 CN 102925430 A 3 2/8 页 4 0005 本发明目的在于，提供一种适用于 PCR 的棉花基因组 DNA 快速、批量制备方法，该。

11、方法将棉花植株顶部的幼嫩叶片装入离心管中，加入提取液和钢珠，对样品进行破碎处理，然后水浴，加抽提液抽提，用异丙醇沉淀 DNA，再用乙醇洗一遍，沉淀溶于水即为提取的 DNA。本发明解决了棉花基因组 DNA 提取步骤复杂、耗时耗力的问题，提供了一种能够快速、批量的提取满足 PCR 检测需求的 DNA 的方法，采用该方法能够从棉花叶片中高效、快速、简便的提取满足 PCR 检测的模板 DNA，能够应用于转基因棉花育种和安全性申报等环节中的分子生物学检测。 0006 本发明所述的适用于 PCR 的棉花基因组 DNA 快速、批量制备方法，按下列步骤进行： 0007。

12、 a、取健康的棉花叶片 0.05-0.15g 放入 2mL 离心管内，加入 600L 的提取液为 NaCl、三羟甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸钠、聚乙烯聚吡咯烷酮、 - 巯基乙醇和 RNase A 的混合物，并加入两粒钢珠； 0008 b、将步骤 a 装有样品的离心管放入细胞破碎仪内，于 30HZ 的频率破碎 5min 处理，将处理后的离心管放入温度 65水浴锅中水浴 10min ； 0009 c、取出离心管，在室温下加入700L氯仿:异戊醇的抽提液抽提一次， 7000rpm离心 6min， 0010 d、吸上清于新的离心管中，加等体积的异丙醇混匀，室温放置 10。

13、min， 12000rpm 离心 6min，弃上清，得到 DNA 粗提沉淀； 0011 e、将所得 DNA 粗提沉淀用 1mL 体积浓度为 75% 的乙醇洗涤， 12000rpm 离心 3min，弃上清液，得到 DNA 沉淀，再加 60L 灭菌双蒸水，温度 -20保存即可。 0012 步骤a中所述的提取液为NaCl 500mmol/L、三羟甲基氨基甲烷50mmol/L， pH=8.0、十二烷基硫酸钠 2%、聚乙烯聚吡咯烷酮 6%、 - 巯基乙醇 1% 和终浓度为 20g/mL 的 RNase A 的混合物。 0013 步骤 a 中钢珠的粒径为 4-6mm。 0014 步。

14、骤a中的棉花叶为从大田棉花植株顶部取幼嫩叶片装入2mL离心管投入液氮罐中带回实验室储存于 -80冰箱，或从任何室内栽培的棉花植株上取幼嫩叶片装入 2mL 离心管投入液氮中并存于 -80冰箱。 0015 步骤 c 中抽提液体积比氯仿 : 异戊醇 =24:1。 0016 本发明所述的适用于PCR的棉花基因组DNA快速、批量制备方法，该方法中的提取液中 - 巯基乙醇属于易挥发成分，该成分能够阻止酚类物质的褐化，所以在使用前根据叶片的老幼程度加入占混合液体积比 1%-3% 的用量。本发明的基本原理为：提取液中聚乙烯聚吡咯烷酮（PVP）和 - 巯基乙醇，能有效的去除多酚；。

15、十二烷基硫酸钠（SDS）能够溶解细胞膜上的脂质与蛋白，分离核酸和蛋白；氯仿抽提能够去除大部分的色素、蛋白、酚类、多糖等物质。DNA 的沉淀只采用异丙醇， DNA 的洗涤采用 60%-80% 的乙醇。与其他 DNA 提取的方法相比，本发明所得 DNA 可于温度 -20长期保存备用也可直接使用。 0017 利用本发明在提取棉花基因组总DNA的实施例中均获得了大量的DNA,提取的DNA 颜色为嫩黄色至浅褐色（依叶片的老幼程度）。经核酸分析仪检测， OD260/280 均在 1.7-2.0 之间，光吸收曲线均表现较好的峰值，提取的 DNA 含有轻微的蛋白和杂质的污染。。

16、经琼脂糖凝胶电泳上检测表明，该方法提取的棉花总 DNA 有清晰主带，同时将所提 DNA 经 PCR 检测，说明书 CN 102925430 A 4 3/8 页 5 均得到清晰、大小正确的扩增条带；说明该方法提取的 DNA 能够满足 PCR 检测的要求。 0018 本发明所述方法与现有的棉花 DNA 提取方法相比，具有如下优点： 0019 快速、简便：本发明利用机械方法破碎细胞，一次破碎 48 份样品， 15min 内即可完成 96 份样品的破碎。与传统的 CTAB、 SDS 法相比，步骤简单，可在 2 小时内完成 96 份样品的提取，一人一天可提取 40。

17、0 份样品，而传统方法完成 96 份样品的提取一般都在 5-6 小时； 0020 成本低：本发明减少了以往棉花提取过程中繁琐的去杂步骤，减少了试剂的使用种类，仅采用提取液、氯仿 : 异戊醇、异丙醇和乙醇等几种试剂就可以完成全部的步骤； 0021 DNA 得率高： 0.05g 棉花叶片采用本方法可获得浓度为 60-100g DNA, 可做 500-700 次 PCR 扩增的模板； 0022 DNA质量符合PCR检测的需求：以本发明所述方法提取的棉花DNA为模板进行PCR 扩增，均得到清晰、大小正确的扩增条带； 0023 所需材料少，取材范围广：本发明对棉花。

18、生长周期中幼苗期、开花期和结铃期的顶端幼嫩叶片以及植株中部的功能叶均适用，但对处于生长后期的老叶和植株底部的衰老叶片提取效果不如幼嫩叶片的好； 0024 提供了一种适合大田样品采样、运输和储存的方法：取棉花植株顶部的幼嫩叶片装入 2mL 离心管，投入液氮罐带回实验室，储存于 -80冰箱中。检测时直接取出离心管使用，避免了以往采集装袋、运输和实验前分装管对材料的反复冻融； 0025 本发明所述方法获得的 DNA 同传统方法获得的 DNA 一样，可稀释短期使用也可长期储存。附图说明 0026 图 1 为本发明中提取棉花基因组总 DNA 的电泳图，其中 M， D。

19、L2000DNA marker ；泳道 1-3 为对照 1 所得的匀浆上清中 DNA ；泳道 4-6 为对照 2 所得抽提液中 DNA ；泳道 7-9 为本发明所得 DNA ；泳道 10-12 为对照 3 提取的 DNA ； 0027 图 2 为本发明提取的 DNA 和由对照 3 提取的 DNA, 经核酸分析仪测定得出的含量对比图，其中 1-5 为随机挑选的 5 份样品的测定值； 1 为本发明所得核酸含量， 2 为对照 3 所得核酸含量； 0028 图 3 为本发明提取转 ScALDH 基因棉花与受体株的 DNA 经 PCR 扩增后实施的效果图，其中 M,DL2000。

20、 DNA marker ；泳道 1 为质粒阳性对照；泳道 2-5 为对照 1 提取的 DNA 为模板的 PCR 结果；泳道 6-9 为对照 2 提取的 DNA 为模板的 PCR 结果；泳道 10-13 为本发明提取的 DNA 为模板的 PCR 结果；泳道 14-17 为对照 3 提取的 DNA 为模板的 PCR 结果，其中 5、 9、 13、 17 为受体转基因阴性株； 0029 图 4 为本发明提取转 EsDREB 基因棉花与受体株的 DNA 经 PCR 扩增后实施的效果图，其中 M,DL2000 DNA marker ；泳道 1 为质粒阳性对照；泳道 2。

21、-5 为对照 1 提取的 DNA 为模板的 PCR 结果；泳道 6-9 为对照 2 提取的 DNA 为模板的 PCR 结果；泳道 10-13 为本发明提取的 DNA 为模板的 PCR 结果；泳道 14-17 为对照 3 提取的 DNA 为模板的 PCR 结果，其中 5、 9、 13、 17 为受体转基因阴性株； 0030 图5为本发明提取转TcLEA基因棉花与受体株的DNA经PCR扩增后实施的效果图，其中 M,DL2000 DNA marker ；泳道 1 为质粒阳性对照；泳道 2-5 为对照 1 提取的 DNA 为模板说明书 CN 102925430 A 5。

22、 4/8 页 6 的 PCR 结果；泳道 6-9 为对照 2 提取的 DNA 为模板的 PCR 结果；泳道 10-13 为本发明提取的 DNA 为模板的 PCR 结果；泳道 14-17 为对照 3 提取的 DNA 为模板的 PCR 结果，其中 5、 9、 13、 17 为受体转基因阴性株。具体实施方式 0031 实施例 1（本发明所述方法：） 0032 样品的采集：棉花叶为从大田棉花植株顶部取幼嫩叶片装入 2mL 离心管投入液氮罐中带回实验室储存于 -80冰箱，或从任何室内栽培的棉花新鲜采集的材料；取 0.05-0.15g 本实验室大田种植并由卡那霉素检测阳性的。

23、转 ScALDH 基因（1450bp）、 EsDREB 基因（750bp）、 TcLEA 基因（310bp）棉花株系和对照株系幼嫩叶片放入 2mL 离心管（生工生物工程（上海）股份有限公司生产），立即投入液氮罐中带回实验室储存于温度 -80冰箱； 0033 转基因棉花基因组 DNA 的提取： 0034 取健康储存的棉花叶片放入 2mL 离心管内，加入 600L 的提取液为 NaCl 500mmol/L、三羟甲基氨基甲烷 50mmol/L， pH=8.0、十二烷基硫酸钠 2% 和聚乙烯聚吡咯烷酮 6%、 - 巯基乙醇 1% 和终浓度为 20g/mL 的 RNas。

24、e A 的混合物，并加入两粒钢珠（细胞破碎仪自带），粒径为 4-6mm ； 0035 将装有样品的离心管放入细胞破碎仪内，于30HZ的频率破碎5min处理，将处理后的离心管放入温度 65水浴锅中水浴 10min ； 0036 取出离心管，在室温下加入 700L 体积比氯仿 : 异戊醇 =24:1 的抽提液抽提一次， 7000rpm 离心 6min ； 0037 吸上清于新的离心管中，加等体积的异丙醇混匀，室温放置 10min， 12000rpm 离心 6min，弃上清，得到 DNA 粗提沉淀 , 在吸上清时尽量轻柔，不要触动蛋白层，避免吸到杂质； 0038 将。

25、所得 DNA 粗提沉淀用 1mL 体积浓度为 75% 的乙醇洗涤， 12000rpm 离心 3min，弃上清液得沉淀，倒置离心管于通风处，晾干，附着于管壁底部的沉淀为 DNA，再加 60L 灭菌双蒸水，温度 -20保存即可； 0039 提取 DNA 的 PCR 检测： 0040 将实施例 1 所述方法提取的 DNA 为模板，以阳性质粒为阳性对照，进行 PCR 扩增反应。所用引物分别为： 0041 ScALDH(DL-f:5CCATGACGGGGGAAGTGAAGGAGTATC3和 DL-r ： 5 :CTAGGGACTCCCACGTTGCGCATG3 )， EsDR。

26、EB(DL-f:5 TTC TTCCTC AAATGCCTTCTGG3 和 0042 DL-r:5 ATGCAAAACTTACATCAAGACAATG3 )TcLEA(DL-f:5 CAGAGAGAGAAAGAGAGAGCG G T3 和 DL-r:5 CTTGTTCGCATTGCTGGTAGTCA3 )。扩增体系及反应体系如下：说明书 CN 102925430 A 6 5/8 页 7 0043 0044 加入 ddH2O 使终体积为 20L, 反应条件：温度 95、时间 5min ；温度 94、时间 30s，温度 60/52/56、时间 45s，温度 72、时间 1。

27、min（35 个循环）；温度 72、时间 7min，温度 4冷却，分别取扩增产物 8L 在 1% 琼脂糖凝胶上进行电泳检测；实验结果：用本发明所述方法提取三种转基因棉花基因组总 DNA 沉淀颜色均为嫩黄色；经核酸分析仪检测， OD260/280 均在 1.7-2.0 之间，光吸收曲线峰值良好， DNA 浓度在 1000-2000ng/L 之间，将提取的DNA在1%琼脂糖凝胶电泳上检测表明：本发明所述方法提取的棉花总DNA有清晰主带，有少量的 RNA 污染，电泳结果见附图 1， 7-9 泳道；同时利用本发明三种大小不同的转基因阳性株都扩增出目的大小正。

28、确的片段，受体株均无可见条带；扩增条带虽然没有用试剂盒提取的亮，但足以辨别转基因与非转基因，说明本发明所述方法提取的 DNA 能够满足转基因棉花 PCR 检测的要求，结果见图 3、图 4、图 5 的 10、 11、 12、 13 泳道。 0045 实施例 2（与本发明的对照） 0046 本实施例中所用的样品与采集方法与实施例 1 中相同； 0047 对照方法 1 ： 0048 转基因棉花基因组 DNA 的提取： 0049 取装有棉花叶片的2mL离心管，向离心管内加600L提取液为NaCl500mmol/L、三羟甲基氨基甲烷（Tris-Cl） 50mmol/L、。

29、pH=8.0、十二烷基硫酸钠（SDS） 2%、聚乙烯聚吡咯烷酮（PVP） 6%、 - 巯基乙醇 1% 和终浓度为 50g/mL 的 RNase A，并加入两粒钢珠（细胞破碎仪自带），粒径为 4-6mm ； 0050 将离心管放入混合研磨机中，于 30HZ 的频率破碎 5min，实现对叶片的破碎，将处理后的离心管放入温度 65水浴锅中水浴 10min， 7000rpm 离心 2min，取 400L 上清转移至新的离心管中，置温度 -20保存； 0051 采用与实施例 1 相同的 PCR 体系和条件对对照方法 1 提取的三种转基因植株的基因组 DNA 进行扩增。

30、。 0052 实验结果：用对照方法1提取三种转基因棉花基因组总DNA含杂质较多，用核酸分析仪检测时杂质的吸收峰影响检测结果， 260/280 在 1.25-1.5 之间，将提取的 DNA 在 1% 琼脂糖凝胶电泳上检测表明：对照方法1提取的棉花总DNA无条带，电泳结果见附图1， 1-3泳道； PCR 扩增的结果为转基因阳性株与受体株均无目的条带，电泳结果见图 3、图 4、图 5 的 2、 3、 4、 5 泳道。 0053 对照方法 2 0054 转基因棉花基因组 DNA 的提取：说明书 CN 102925430 A 7 6/8 页 8 0055 取装有棉花叶。

31、片的 2mL 离心管，室温放置 5min, 向离心管内加 600L 提取液为 NaCl500mmol/L、三羟甲基氨基甲烷（Tris-Cl） 50mmol/L、 pH=8.0、十二烷基硫酸钠（SDS） 2%、聚乙烯聚吡咯烷酮（PVP） 6%、 - 巯基乙醇 1% 和终浓度为 50g/mL 的 RNase A，并加入两粒钢珠（细胞破碎仪自带），粒径为 4-6mm ； 0056 将所得的离心管放入混合研磨机，于 30HZ 的频率破碎 5min，实现对叶片的破碎，将处理后的离心管放入温度 65水浴锅中水浴 10min ； 0057 取出离心管，在室温下加入 700L 。

32、体积比氯仿 : 异戊醇（24:1）抽提液，剧烈震荡 1min， 7000rpm 离心 6min ； 0058 吸 400L 上清于新的离心管中，于温度 -20保存； 0059 采用与实施例 1 相同的 PCR 体系和条件对对照 2 法提取的三种转基因植株的基因组 DNA 进行扩增； 0060 实验结果：用对照2方法提取三种转基因棉花基因组总DNA溶液呈现为褐色，含杂质较多，核酸分析仪检测 260/280 在 1.5-1.7 之间；将提取的 DNA 在 1% 琼脂糖凝胶电泳上检测表明，对照 2 方法提取的棉花总 DNA 无清晰主带， RNA 污染较严重；电泳结。

33、果见附图 1， 4-6 泳道； PCR 扩增的结果为转基因阳性株与受体株均无可见目的条带，电泳结果见图 3、图 4、图 5 的 6、 7、 8、 9 泳道。 0061 对照方法 3 0062 转基因棉花基因组 DNA 的提取采用康为世纪的棉花 DNA 提取试剂盒提取 (Cat No:CW2088)，具体方法参见该试剂盒说明书； 0063 采用与实施例 1 相同的 PCR 体系和条件对对照 3 方法提取的三种转基因植株的基因组 DNA 进行扩增； 0064 实验结果：用对照 3 方法提取三种转基因棉花基于组总 DNA 沉淀颜色为乳白色；经核酸分析仪检测， OD260/28。

34、0 均在 1.9-2.0 之间， DNA 浓度在 300-900ng/L ；将提取的 DNA 在 1% 琼脂糖凝胶电泳上检测表明，对照 3 方法提取的棉花总 DNA 有清晰主带，有微量 RNA污染，电泳结果见附图1， 10-12泳道； PCR扩增的结果为转基因阳性株有清晰的、亮度较好目的主带，受体株无扩增条带；电泳结果见图 3、图 4、图 5 的 14、 15、 16、 17 泳道。 0065 本发明所述方法与对照 1、 2 和 3 方法提取的 DNA 经核酸分析仪检测的结果： 0066 0067 从核酸分析仪得出的数据不难看出，利用本发明提取的 DNA 浓度都在。

35、1000ng/L 以上，虽然 OD260/280 显示存在杂质污染，但从电泳结果和 PCR 检测的结果来看，本发明所述方法提取的DNA条带最亮，而且PCR扩增阳性株也得到明显的大小正确的目的条带，说明本方法能够检测出转基因与非转基因植株。 0068 本发明所述方法与实验室常用 DNA 提取方法的比较： 0069 说明书 CN 102925430 A 8 7/8 页 9 0070 0071 将本发明与实验室常用的各种改良的提取棉花 DNA 的方法相比，本发明所述方法快速简便的优点就显得尤为突出；本发明利用机械方法破碎细胞，减少了以往棉花提取过程中繁琐的步骤，同时。

36、一步到位的采样方法减少了批量实验时装管、编号的程序，少数但关键步骤的选择使获得的 DNA 能够满足 PCR 的要求；利用本发明所述方法一人一天可提取 400 份样品，是现用方法 6-10 倍的工作量；用本发明 0.05g 棉花叶片就可获得浓度为 60-100g DNA,稀释后可做500-700次PCR扩增的模板，这说明本发明不失为一种快速、可说明书 CN 102925430 A 9 8/8 页 10 靠的提取棉花基因组 DNA 的方法。说明书 CN 102925430 A 10 1/2 页 11 图 1 图 2 图 3 说明书附图 CN 102925430 A 11 2/2 页 12 图 4 图 5 说明书附图 CN 102925430 A 12 。

摘要
申请专利号：	CN201210514827.5	申请日：	2012.12.05
公开号：	CN102925430A	公开日：	2013.02.13
当前法律状态：	撤回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):C12N 15/10申请公布日:20130213\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C12N 15/10申请日:20121205\|\|\|公开
IPC分类号：	C12N15/10	主分类号：	C12N15/10
申请人：	中国科学院新疆生态与地理研究所
发明人：	张道远; 李小双; 李海燕
地址：	830011 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市北京南路40号附3号
优先权：
专利代理机构：	乌鲁木齐中科新兴专利事务所 65106	代理人：	张莉
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内容摘要

本发明公开了一种适用于PCR的棉花基因组DNA快速、批量制备方法，涉及作物育种领域转基因作物的分子检测。该方法是由取棉花植株顶部的幼嫩叶片装入离心管中，加入提取液和钢珠，对样品进行破碎处理，然后水浴，加抽提液抽提，用异丙醇沉淀DNA，再用乙醇洗涤，沉淀溶于水即为提取的DNA。本发明解决了棉花基因组DNA提取步骤复杂、耗时耗力的问题，提供了一种能够快速、批量的提取满足PCR检测需求的DNA的方法，能够应用于转基因棉花育种和安全性申报等环节中的分子生物学检测。

权利要求书

权利要求书一种适用于PCR的棉花基因组DNA快速、批量制备方法，其特征在于按下列步骤进行：
a、取健康的棉花叶片0.05‑0.15g放入2mL离心管内，加入600μL的提取液为NaCl、三羟甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸钠、聚乙烯聚吡咯烷酮、β‑巯基乙醇和RNase A的混合物，并加入两粒钢珠；
b、将步骤a装有样品的离心管放入细胞破碎仪内，于30HZ的频率破碎5min处理，将处理后的离心管放入温度65℃水浴锅中水浴10min；
c、取出离心管，在室温下加入700μL氯仿:异戊醇的抽提液抽提一次，7000rpm离心6min，
d、吸上清于新的离心管中，加等体积的异丙醇混匀，室温放置10min，12000rpm离心6min，弃上清，得到DNA粗提沉淀；
e、将所得DNA粗提沉淀用1mL体积浓度为75%的乙醇洗涤，12000rpm离心3min，弃上清液，得到DNA沉淀，再加60μL灭菌双蒸水，温度‑20℃保存即可。
根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a中所述的提取液为NaCl 500mmol/L、三羟甲基氨基甲烷50mmol/L，pH=8.0、十二烷基硫酸钠2%、聚乙烯聚吡咯烷酮6%、β‑巯基乙醇1%和终浓度为20μg/mL的RNase A的混合物。
根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a中钢珠的粒径为4‑6mm。
根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a中的棉花叶为从大田棉花植株顶部取幼嫩叶片装入2mL离心管投入液氮罐中带回实验室储存于‑80℃冰箱，或从任何室内栽培的棉花植株上取幼嫩叶片装入2mL离心管投入液氮中并存于‑80℃冰箱。
根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤c中抽提液体积比氯仿:异戊醇=24:1。

说明书

说明书适用于PCR的棉花基因组DNA快速、批量制备方法
技术领域
本发明涉及一种用于PCR的棉花基因组DNA快速、批量制备方法。
背景技术
棉花是我国乃至世界范围内重要的经济作物，目前我国是世界上最大的棉花生产国。近年来，随着分子生物学技术与遗传育种技术的不断发展，一大批具有抗生物胁迫（抗虫）和抗非生物胁迫（抗除草剂、抗旱）的基因成功转入棉花。这些优质的基因资源为作物丰产和减少环境污染做出了重大的贡献。然而在培育新品种时，每一代转基因棉花的大田检测工作一直是困扰育种家和分子生物学研究者的一大难题。因为该环节工作量大，费时费力。经常需要短时间内从大田种植的几千株甚至上万株棉花中鉴定出转基因阳性株。这就需要一种简便、高效、快速的鉴定转基因大田试验材料的分子生物学方法。而且，根据我国转基因农作物安全性申报的要求，转基因棉花安全性申报也需要进行分子生物学检测。目前对转基因作物的检测方法可分为蛋白检测方法和核酸检测方法，而核酸检测方法中的聚合酶链式反应（PCR）技术由于其高灵敏度、高特异性、操作简便已经成为转基因植物及其产品检测的主要方法。
进行PCR检测的前提是快速大量的提取棉花的基因组DNA。目前，对于小麦、玉米、水稻、大豆和油菜等均已建立起高效快速提取基因组DNA的技术。但对于棉花来说，由于棉花富含棉酚、多糖、单宁等次生代谢产物，该类物质在细胞破碎时极易氧化，并能与核酸和蛋白结合形成复合物，影响高质量棉花DNA的提取，进而影响后续PCR、酶切等一系列分子生物学操作。比如传统的CTAB法利用高盐溶液沉淀蛋白和酸性多糖，低盐溶液沉淀核酸的原理去除蛋白和糖类物质，但这样便增加了加入不同浓度NaCl并抽提、离心将其去除的操作，同时为了提高得率往往需要长时间的沉淀、冰浴等步骤。而SDS法以及基于该法改进的各种方法则利用SDS充分裂解细胞释放核酸物质，并用氯仿：异戊醇反复抽提的方法来纯化DNA，但是该法对棉花这种富含次级代谢产物的物种来说提取效率很低。很多改进的SDS法加入抗氧化物质来抑制酚类物质的氧化以提高产率，但效果并不理想。有学者提出CTAB‑SDS结合的改良方法提取棉花基因组DNA，虽然得到了大量的高质量的基因组DNA，但仍步骤复杂、耗时较长，不适于转基因棉花的快速PCR检测。另外，以往的取材方法多为取功能叶后包入纸袋或塑料袋中带回实验室，然后直接放入冰箱冷冻直至使用。这样的取材方法增加了材料在离体、运输、实验前装管编号等环节的操作时间以及样品反复冻融的次数，导致DNA降解，进一步增加了棉花高质量基因组DNA提取的难度。
PCR技术可以实现在体外对目标DNA进行上百万次的扩增，因此是目前最准确的检测转基因作物及其产品的方法之一。该技术对模板DNA的纯度要求并不是十分严格，而且需要的量也并不是很多。因此，能够找到一种快速提取并能满足PCR扩增需求的棉花基因组DNA的方法是解决转基因棉花育种中阳性株检测工作量大问题的关键。
发明内容
本发明目的在于，提供一种适用于PCR的棉花基因组DNA快速、批量制备方法，该方法将棉花植株顶部的幼嫩叶片装入离心管中，加入提取液和钢珠，对样品进行破碎处理，然后水浴，加抽提液抽提，用异丙醇沉淀DNA，再用乙醇洗一遍，沉淀溶于水即为提取的DNA。本发明解决了棉花基因组DNA提取步骤复杂、耗时耗力的问题，提供了一种能够快速、批量的提取满足PCR检测需求的DNA的方法，采用该方法能够从棉花叶片中高效、快速、简便的提取满足PCR检测的模板DNA，能够应用于转基因棉花育种和安全性申报等环节中的分子生物学检测。
本发明所述的适用于PCR的棉花基因组DNA快速、批量制备方法，按下列步骤进行：
a、取健康的棉花叶片0.05‑0.15g放入2mL离心管内，加入600μL的提取液为NaCl、三羟甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸钠、聚乙烯聚吡咯烷酮、β‑巯基乙醇和RNase A的混合物，并加入两粒钢珠；
b、将步骤a装有样品的离心管放入细胞破碎仪内，于30HZ的频率破碎5min处理，将处理后的离心管放入温度65℃水浴锅中水浴10min；
c、取出离心管，在室温下加入700μL氯仿:异戊醇的抽提液抽提一次，7000rpm离心6min，
d、吸上清于新的离心管中，加等体积的异丙醇混匀，室温放置10min，12000rpm离心6min，弃上清，得到DNA粗提沉淀；
e、将所得DNA粗提沉淀用1mL体积浓度为75%的乙醇洗涤，12000rpm离心3min，弃上清液，得到DNA沉淀，再加60μL灭菌双蒸水，温度‑20℃保存即可。
步骤a中所述的提取液为NaCl 500mmol/L、三羟甲基氨基甲烷50mmol/L，pH=8.0、十二烷基硫酸钠2%、聚乙烯聚吡咯烷酮6%、β‑巯基乙醇1%和终浓度为20μg/mL的RNase A的混合物。
步骤a中钢珠的粒径为4‑6mm。
步骤a中的棉花叶为从大田棉花植株顶部取幼嫩叶片装入2mL离心管投入液氮罐中带回实验室储存于‑80℃冰箱，或从任何室内栽培的棉花植株上取幼嫩叶片装入2mL离心管投入液氮中并存于‑80℃冰箱。
步骤c中抽提液体积比氯仿:异戊醇=24:1。
本发明所述的适用于PCR的棉花基因组DNA快速、批量制备方法，该方法中的提取液中β‑巯基乙醇属于易挥发成分，该成分能够阻止酚类物质的褐化，所以在使用前根据叶片的老幼程度加入占混合液体积比1%‑3%的用量。本发明的基本原理为：提取液中聚乙烯聚吡咯烷酮（PVP）和β‑巯基乙醇，能有效的去除多酚；十二烷基硫酸钠（SDS）能够溶解细胞膜上的脂质与蛋白，分离核酸和蛋白；氯仿抽提能够去除大部分的色素、蛋白、酚类、多糖等物质。DNA的沉淀只采用异丙醇，DNA的洗涤采用60%‑80%的乙醇。与其他DNA提取的方法相比，本发明所得DNA可于温度‑20℃长期保存备用也可直接使用。
利用本发明在提取棉花基因组总DNA的实施例中均获得了大量的DNA,提取的DNA颜色为嫩黄色至浅褐色（依叶片的老幼程度）。经核酸分析仪检测，OD260/280均在1.7‑2.0之间，光吸收曲线均表现较好的峰值，提取的DNA含有轻微的蛋白和杂质的污染。经琼脂糖凝胶电泳上检测表明，该方法提取的棉花总DNA有清晰主带，同时将所提DNA经PCR检测，均得到清晰、大小正确的扩增条带；说明该方法提取的DNA能够满足PCR检测的要求。
本发明所述方法与现有的棉花DNA提取方法相比，具有如下优点：
快速、简便：本发明利用机械方法破碎细胞，一次破碎48份样品，15min内即可完成96份样品的破碎。与传统的CTAB、SDS法相比，步骤简单，可在2小时内完成96份样品的提取，一人一天可提取400份样品，而传统方法完成96份样品的提取一般都在5‑6小时；
成本低：本发明减少了以往棉花提取过程中繁琐的去杂步骤，减少了试剂的使用种类，仅采用提取液、氯仿:异戊醇、异丙醇和乙醇等几种试剂就可以完成全部的步骤；
DNA得率高：0.05g棉花叶片采用本方法可获得浓度为60‑100μg DNA,可做500‑700次PCR扩增的模板；
DNA质量符合PCR检测的需求：以本发明所述方法提取的棉花DNA为模板进行PCR扩增，均得到清晰、大小正确的扩增条带；
所需材料少，取材范围广：本发明对棉花生长周期中幼苗期、开花期和结铃期的顶端幼嫩叶片以及植株中部的功能叶均适用，但对处于生长后期的老叶和植株底部的衰老叶片提取效果不如幼嫩叶片的好；
提供了一种适合大田样品采样、运输和储存的方法：取棉花植株顶部的幼嫩叶片装入2mL离心管，投入液氮罐带回实验室，储存于‑80℃冰箱中。检测时直接取出离心管使用，避免了以往采集装袋、运输和实验前分装管对材料的反复冻融；
本发明所述方法获得的DNA同传统方法获得的DNA一样，可稀释短期使用也可长期储存。
附图说明
图1为本发明中提取棉花基因组总DNA的电泳图，其中M，DL2000DNA marker；泳道1‑3为对照1所得的匀浆上清中DNA；泳道4‑6为对照2所得抽提液中DNA；泳道7‑9为本发明所得DNA；泳道10‑12为对照3提取的DNA；
图2为本发明提取的DNA和由对照3提取的DNA,经核酸分析仪测定得出的含量对比图，其中1‑5为随机挑选的5份样品的测定值；1为本发明所得核酸含量，2为对照3所得核酸含量；
图3为本发明提取转ScALDH基因棉花与受体株的DNA经PCR扩增后实施的效果图，其中M,DL2000 DNA marker；泳道1为质粒阳性对照；泳道2‑5为对照1提取的DNA为模板的PCR结果；泳道6‑9为对照2提取的DNA为模板的PCR结果；泳道10‑13为本发明提取的DNA为模板的PCR结果；泳道14‑17为对照3提取的DNA为模板的PCR结果，其中5、9、13、17为受体转基因阴性株；
图4为本发明提取转EsDREB基因棉花与受体株的DNA经PCR扩增后实施的效果图，其中M,DL2000 DNA marker；泳道1为质粒阳性对照；泳道2‑5为对照1提取的DNA为模板的PCR结果；泳道6‑9为对照2提取的DNA为模板的PCR结果；泳道10‑13为本发明提取的DNA为模板的PCR结果；泳道14‑17为对照3提取的DNA为模板的PCR结果，其中5、9、13、17为受体转基因阴性株；
图5为本发明提取转TcLEA基因棉花与受体株的DNA经PCR扩增后实施的效果图，其中M,DL2000 DNA marker；泳道1为质粒阳性对照；泳道2‑5为对照1提取的DNA为模板的PCR结果；泳道6‑9为对照2提取的DNA为模板的PCR结果；泳道10‑13为本发明提取的DNA为模板的PCR结果；泳道14‑17为对照3提取的DNA为模板的PCR结果，其中5、9、13、17为受体转基因阴性株。
具体实施方式
实施例1（本发明所述方法：）
样品的采集：棉花叶为从大田棉花植株顶部取幼嫩叶片装入2mL离心管投入液氮罐中带回实验室储存于‑80℃冰箱，或从任何室内栽培的棉花新鲜采集的材料；取0.05‑0.15g本实验室大田种植并由卡那霉素检测阳性的转ScALDH基因（1450bp）、EsDREB基因（750bp）、TcLEA基因（310bp）棉花株系和对照株系幼嫩叶片放入2mL离心管（生工生物工程（上海）股份有限公司生产），立即投入液氮罐中带回实验室储存于温度‑80℃冰箱；
转基因棉花基因组DNA的提取：
取健康储存的棉花叶片放入2mL离心管内，加入600μL的提取液为NaCl 500mmol/L、三羟甲基氨基甲烷50mmol/L，pH=8.0、十二烷基硫酸钠2%和聚乙烯聚吡咯烷酮6%、β‑巯基乙醇1%和终浓度为20μg/mL的RNase A的混合物，并加入两粒钢珠（细胞破碎仪自带），粒径为4‑6mm；
将装有样品的离心管放入细胞破碎仪内，于30HZ的频率破碎5min处理，将处理后的离心管放入温度65℃水浴锅中水浴10min；
取出离心管，在室温下加入700μL体积比氯仿:异戊醇=24:1的抽提液抽提一次，7000rpm离心6min；
吸上清于新的离心管中，加等体积的异丙醇混匀，室温放置10min，12000rpm离心6min，弃上清，得到DNA粗提沉淀,在吸上清时尽量轻柔，不要触动蛋白层，避免吸到杂质；
将所得DNA粗提沉淀用1mL体积浓度为75%的乙醇洗涤，12000rpm离心3min，弃上清液得沉淀，倒置离心管于通风处，晾干，附着于管壁底部的沉淀为DNA，再加60μL灭菌双蒸水，温度‑20℃保存即可；
提取DNA的PCR检测：
将实施例1所述方法提取的DNA为模板，以阳性质粒为阳性对照，进行PCR扩增反应。所用引物分别为：
ScALDH(DL‑f:5’CCATGACGGGGGAAGTGAAGGAGTATC3’和DL‑r：5’:CTAGGGACTCCCACGTTGCGCATG3’)，EsDREB(DL‑f:5’TTC TTCCTC AAATGCCTTCTGG3’和
DL‑r:5’ATGCAAAACTTACATCAAGACAATG3’)TcLEA(DL‑f:5’CAGAGAGAGAAAGAGAGAGCGG T3’和DL‑r:5’CTTGTTCGCATTGCTGGTAGTCA3’)。扩增体系及反应体系如下：

加入ddH2O使终体积为20μL,反应条件：温度95℃、时间5min；温度94℃、时间30s，温度60/52/56℃、时间45s，温度72℃、时间1min（35个循环）；温度72℃、时间7min，温度4℃冷却，分别取扩增产物8μL在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测；实验结果：用本发明所述方法提取三种转基因棉花基因组总DNA沉淀颜色均为嫩黄色；经核酸分析仪检测，OD260/280均在1.7‑2.0之间，光吸收曲线峰值良好，DNA浓度在1000‑2000ng/μL之间，将提取的DNA在1%琼脂糖凝胶电泳上检测表明：本发明所述方法提取的棉花总DNA有清晰主带，有少量的RNA污染，电泳结果见附图1，7‑9泳道；同时利用本发明三种大小不同的转基因阳性株都扩增出目的大小正确的片段，受体株均无可见条带；扩增条带虽然没有用试剂盒提取的亮，但足以辨别转基因与非转基因，说明本发明所述方法提取的DNA能够满足转基因棉花PCR检测的要求，结果见图3、图4、图5的10、11、12、13泳道。
实施例2（与本发明的对照）
本实施例中所用的样品与采集方法与实施例1中相同；
对照方法1：
转基因棉花基因组DNA的提取：
取装有棉花叶片的2mL离心管，向离心管内加600μL提取液为NaCl500mmol/L、三羟甲基氨基甲烷（Tris‑Cl）50mmol/L、pH=8.0、十二烷基硫酸钠（SDS）2%、聚乙烯聚吡咯烷酮（PVP）6%、β‑巯基乙醇1%和终浓度为50μg/mL的RNase A，并加入两粒钢珠（细胞破碎仪自带），粒径为4‑6mm；
将离心管放入混合研磨机中，于30HZ的频率破碎5min，实现对叶片的破碎，将处理后的离心管放入温度65℃水浴锅中水浴10min，7000rpm离心2min，取400μL上清转移至新的离心管中，置温度‑20℃保存；
采用与实施例1相同的PCR体系和条件对对照方法1提取的三种转基因植株的基因组DNA进行扩增。
实验结果：用对照方法1提取三种转基因棉花基因组总DNA含杂质较多，用核酸分析仪检测时杂质的吸收峰影响检测结果，260/280在1.25‑1.5之间，将提取的DNA在1%琼脂糖凝胶电泳上检测表明：对照方法1提取的棉花总DNA无条带，电泳结果见附图1，1‑3泳道；PCR扩增的结果为转基因阳性株与受体株均无目的条带，电泳结果见图3、图4、图5的2、3、4、5泳道。
对照方法2
转基因棉花基因组DNA的提取：
取装有棉花叶片的2mL离心管，室温放置5min,向离心管内加600μL提取液为NaCl500mmol/L、三羟甲基氨基甲烷（Tris‑Cl）50mmol/L、pH=8.0、十二烷基硫酸钠（SDS）2%、聚乙烯聚吡咯烷酮（PVP）6%、β‑巯基乙醇1%和终浓度为50μg/mL的RNase A，并加入两粒钢珠（细胞破碎仪自带），粒径为4‑6mm；
将所得的离心管放入混合研磨机，于30HZ的频率破碎5min，实现对叶片的破碎，将处理后的离心管放入温度65℃水浴锅中水浴10min；
取出离心管，在室温下加入700μL体积比氯仿:异戊醇（24:1）抽提液，剧烈震荡1min，7000rpm离心6min；
吸400μL上清于新的离心管中，于温度‑20℃保存；
采用与实施例1相同的PCR体系和条件对对照2法提取的三种转基因植株的基因组DNA进行扩增；
实验结果：用对照2方法提取三种转基因棉花基因组总DNA溶液呈现为褐色，含杂质较多，核酸分析仪检测260/280在1.5‑1.7之间；将提取的DNA在1%琼脂糖凝胶电泳上检测表明，对照2方法提取的棉花总DNA无清晰主带，RNA污染较严重；电泳结果见附图1，4‑6泳道；PCR扩增的结果为转基因阳性株与受体株均无可见目的条带，电泳结果见图3、图4、图5的6、7、8、9泳道。
对照方法3
转基因棉花基因组DNA的提取采用康为世纪的棉花DNA提取试剂盒提取(Cat No:CW2088)，具体方法参见该试剂盒说明书；
采用与实施例1相同的PCR体系和条件对对照3方法提取的三种转基因植株的基因组DNA进行扩增；
实验结果：用对照3方法提取三种转基因棉花基于组总DNA沉淀颜色为乳白色；经核酸分析仪检测，OD260/280均在1.9‑2.0之间，DNA浓度在300‑900ng/μL；将提取的DNA在1%琼脂糖凝胶电泳上检测表明，对照3方法提取的棉花总DNA有清晰主带，有微量RNA污染，电泳结果见附图1，10‑12泳道；PCR扩增的结果为转基因阳性株有清晰的、亮度较好目的主带，受体株无扩增条带；电泳结果见图3、图4、图5的14、15、16、17泳道。
本发明所述方法与对照1、2和3方法提取的DNA经核酸分析仪检测的结果：

从核酸分析仪得出的数据不难看出，利用本发明提取的DNA浓度都在1000ng/μL以上，虽然OD260/280显示存在杂质污染，但从电泳结果和PCR检测的结果来看，本发明所述方法提取的DNA条带最亮，而且PCR扩增阳性株也得到明显的大小正确的目的条带，说明本方法能够检测出转基因与非转基因植株。
本发明所述方法与实验室常用DNA提取方法的比较：

将本发明与实验室常用的各种改良的提取棉花DNA的方法相比，本发明所述方法快速简便的优点就显得尤为突出；本发明利用机械方法破碎细胞，减少了以往棉花提取过程中繁琐的步骤，同时一步到位的采样方法减少了批量实验时装管、编号的程序，少数但关键步骤的选择使获得的DNA能够满足PCR的要求；利用本发明所述方法一人一天可提取400份样品，是现用方法6‑10倍的工作量；用本发明0.05g棉花叶片就可获得浓度为60‑100μg DNA,稀释后可做500‑700次PCR扩增的模板，这说明本发明不失为一种快速、可靠的提取棉花基因组DNA的方法。