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1、(10)申请公布号 CN 104293913 A (43)申请公布日 2015.01.21 CN 104293913 A (21)申请号 201410429506.4 (22)申请日 2014.08.28 C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 广州和实生物技术有限公司 地址 510665 广东省广州市经济技术开发区 科学城荔枝山路 6 号 1 号楼 510 室 (72)发明人 陈华云 陈嘉昌 肖湘文 丁渭 刘淑园 汤链 张天海 (74)专利代理机构 广州嘉权专利商标事务所有 限公司 44205 代理人 郑莹 (54) 发明名称 多点突变单管快速检测方法及试剂盒 (57) 摘要 。
2、本发明公开了多点突变单管快速检测方法及 试剂盒。多点突变单管快速检测方法， 包括 ： 1） 设 计 ARMS 引物及对应的下游引物、 中介连接引物、 通用荧光探针及其淬灭探针 ； 2） 将 ARMS 引物及 对应的下游引物、 中介连接引物、 通用荧光探针及 其淬灭探针与热启动快速 Taq 酶系统混合， 扩增 ； 3） 检测反应体系的荧光变化， 确定是否存在点突 变。本发明的发明， 操作简单， 可以定性检测出多 点突变的存在。本发明的检测方法中使用的引物 设计难度低， 大幅降低了引物合成的成本 ； 克服 了现有 ARMS 技术的局限性， 大大提高了其检测通 量 ； 实现了 1 管反应取代了之前的。
3、多管检测， 节省 人力物力。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 7 页 序列表 10 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书7页 序列表10页 附图2页 (10)申请公布号 CN 104293913 A CN 104293913 A 1/2 页 2 1. 多点突变单管快速检测方法， 包括如下步骤 ： 1) 设计针对不同点突变的 ARMS 引物及对应的下游引物、 中介连接引物、 通用荧光探针 及其淬灭探针 ； 其中， 中介连接引物由通用序列部分和特异序列部分构成， 通用序列部分与 通用荧光探针部分序列互补， 特异序列。
4、部分与点突变下游的部分序列互补 ； 2) 将 ARMS 引物及对应的下游引物、 中介连接引物、 通用荧光探针及其淬灭探针与热启 动快速 Taq 酶系统混合， 扩增 ； 检测反应体系的荧光变化， 确定是否存在点突变。 2. 根据权利要求 1 所述的多点突变单管快速检测方法， 其特征在于 ： 通用荧光探针上 连接荧光基团的核苷酸和淬灭探针上连接淬灭基团的核苷酸在互补配对后的间距不超过 4 个核苷酸。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的多点突变单管快速检测方法， 其特征在于 ： 中介连接引 物中与突变位点下游的部分序列互补的核酸数量不少于 5 bp。 4. 根据权利要求 3 所述的多点突变单管快。
5、速检测方法， 其特征在于 ： 中介连接引物中 与突变位点下游的部分序列互补的核酸数量为 15 30bp。 5. 根据权利要求 1、 2 或 4 所述的多点突变单管快速检测方法， 其特征在于 ： 中介连接 引物中与通用荧光探针部分核酸互补配对的核酸数量不少于 5 bp。 6. 根据权利要求 5 所述的多点突变单管快速检测方法， 其特征在于 ： 中介连接引物中 与通用荧光探针部分核酸互补配对的核酸数量为 15 45bp。 7. 根据权利要求 1、 2、 4 或 6 所述的多点突变单管快速检测方法， 其特征在于 ： 通用荧 光探针的一端连接有保护核酸序列。 8. 一种 EGFR 多点突变单管快速检测。
6、试剂盒， 包括 DNA 提取液， 热启动快速 Taq 酶系统 和 EGFR 突变检测引物， 其特征在于 ： 所述 EGFR 突变检测引物由多组 ARMS 引物及对应的下 游引物、 中介连接引物、 通用荧光探针及其淬灭探针组成 ； 其中 ： 中介连接引物的一端序列与待 EGFR 突变位点下游的部分序列互补， 另一端序列与通 用荧光探针部分核酸互补配对。 9.根据权利要求8所述的EGFR多点突变单管快速检测试剂盒， 其特征在于 ： ARMS引物 的序列如下 ： ARMS 引物 1 ： TTCAAAAAGATCAAAGTGCTGA ARMS 引物 2 ： TTCAAAAAGATCAAAGTGCTGT。
7、 ARMS 引物 3 ： CAAAAAGATCAAAGTGCTGGC ARMS 引物 4 ： TTCCCGTCGCTATCAAAACATC ARMS 引物 5 ： TTCCCGTCGCTATCAAAACATC ARMS 引物 6 ： TTCCCGTCGCTATCAAAACATC ARMS 引物 7 ： TCCCGTCGCTATCAAGTCT ARMS 引物 8 ： CCGTCGCTATCAAGGTACA ARMS 引物 9 ： CGTCGCTATCAAGGCATCTC ARMS 引物 10 ： TCCCGTCGCTATCAAGTCT ARMS 引物 11 ： CCGTCGCTATCAAGGAG。
8、C ARMS 引物 12 ： CCGTCGCTATCAAGGAGC 权 利 要 求 书 CN 104293913 A 2 2/2 页 3 ARMS 引物 13 ： CCGTCGCTATCAAGGATCC ARMS 引物 14 ： CCGTCGCTATCAAGGAAGC ARMS 引物 15 ： CCGTCGCTATCAAGGAACC ARMS 引物 16 ： CCGTCGCTATCAAGGAACC ARMS 引物 17 ： CGTCGCTATCAAGGAATCTC ARMS 引物 18 ： CCGTCGCTATCAAGGAACC ARMS 引物 19 ： CCGTCGCTATCAAGGAACA。
9、G ARMS 引物 20 ： GTCGCTATCAAGGAATCATC ARMS 引物 21 ： CGTCGCTATCAAGGAATCTC ARMS 引物 22 ： GTCGCTATCAAGGAATTCGA ARMS 引物 23 ： AGCCTACGTGATGGCCAT ARMS 引物 24 ： CCAGCGTGGCCAGCGT ARMS 引物 25 ： CCAGCGTGGACGGTAAC ARMS 引物 26 ： GACAATTCCCACCACGTGT ARMS 引物 27 ： CACCGTGCAGCTCATCAT ARMS 引物 28 ： AGATCACAGACTTTGGGCG ARMS 。
10、引物 29 ： GTTGGGCTGGCCAAACA ； ARMS 引物 1 和 2 对应的下游引物为 Y1 ： AGACCATGAGAGGCCCTG ； ARMS 引物 3 对应的下游引物为 Y2 ： AGATGATGGAAATATACAGCTTGC ； ARMS 引物 4 19 对应的下游引物为 Y3 ： TGTGGAGATGAGCAGGGT ； ARMS 引物 20 27 对应的下游引物为 Y4 ： TTGTCTTTGTGTTCCCGGA ； ARMS 引物 28 和 9 对应的下游引物为 Y5 ： GGCTGACCTAAAGCCACC ； ARMS 引物 1 3 对应的中介引物为 Z1 。
11、： ACCTCGTTCTGGGCTCTACTCCGGTGCGTTCGGCACGGT GTATA ； ARMS引物422对应的中介引物为Z2 ： ACCTCGTTCTGGGCTCTACTCCATGGCTCTGAACCTCA ； ARMS 引物 23 27 对应的中介引物为 Z3 ： ACCTCGTTCTGGGCTCTACCTGCCTCCTGGACTATG ； ARMS 引物 28 和 9 对应的中介引物为 Z4 ： ACCTCGTTCTGGGCTCTACCCATGCAGAAGGAGGCAA。 10. 根据权利要求 8 或 9 所述的 EGFR 多点突变单管快速检测试剂盒， 其特征在于 ： 通 用。
12、荧光探针的序列为 ： TC(dT- FAM)GCGGTGTTGGTGTAGAGCCCAGAACGAGGTTTTTTTTTTTTTTTTT T， 对应的淬灭序列为 ： 5 -BHQ-CCGCAGA-3 。 权 利 要 求 书 CN 104293913 A 3 1/7 页 4 多点突变单管快速检测方法及试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及一种突变检测试剂盒， 特别涉及一种 EGFR 多点突变单管快速检测试 剂盒。 背景技术 0002 点突变与许多肿瘤有着密切的关系， 已有研究表明， 某些基团位点的点突变会使 肿瘤的发生率大幅提高。以表皮生长因子受体 (EGFR) 为例， EGFR 是一种人细胞膜。
13、表面的 糖蛋白受体， 该基因位于人类7号染色体， 由28个外显子组成。 EGFR具有酪氨酸激酶活性， 是原癌基因 c-erbB1 的表达产物， 其酪氨酸激酶功能区由外显子 18-24 编码。EGFR 主要通 过 RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK 信号通路和 PI3K-PDK 信号通路将胞外信号转化为胞内信号， 从 而对细胞的生长、 增殖、 分化和凋亡产生作用。 0003 肺癌是我国发病率和死亡率最高的肿瘤， 其中非小细胞肺癌 (non-small cell lung cancer， NSCLC) 约占所有肺癌的 80， 而我国 NSCLC 患者中 50以上存在 EGFR 基因 体细胞突。
14、变。现有研究表明 EGFR 基因突变存在多种形式， 部分突变与 EGFR 酪氨酸激酶抑 制剂如吉非替尼和厄洛替尼的有效相关， 部分突变与 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂的耐药相关。 因此， 在使用酪氨酸激酶抑制剂进行靶向治疗前， 2011 年 NCCN非小细胞肺癌临床实践指 南 ( 中国版 ) 推荐进行 EGFR 基因突变检测， 从而基于患者肿瘤 DNA 中 EGFR 基因的突变状 态来指导临床制定合适的治疗方案。 0004 由于 EGFR 基因药物敏感的突变点众多， 常见的如下表所示 ： 说 明 书 CN 104293913 A 4 2/7 页 5 目前普遍认为需检测 28 个突变位点。现有市面。
15、上的荧光 PCR 检测试剂盒普遍使用 7 个 PCR 管进行检测， 分析过程繁琐而且没有必要。同时整个检测流程较慢， 至少需要 2 天才 能出结果。 0005 有必要开发出一种更为快速高效的多点突变的检测试剂盒， 特别是一种更为快速 高效的 EGFR 多点突变的检测试剂盒。 发明内容 0006 本发明的目的在于提供一种高效的多点突变单管快速检测方法及 EGFR 多点突变 单管快速检测试剂盒。 0007 本发明所采取的技术方案是 ： 多点突变单管快速检测方法， 包括如下步骤 ： 1) 设计针对不同点突变的 ARMS 引物及对应的下游引物、 中介连接引物、 通用荧光探针 及其淬灭探针 ； 其中， 。
16、中介连接引物由通用序列部分和特异序列部分构成， 通用序列部分与 通用荧光探针部分序列互补， 特异序列部分与点突变下游的部分序列互补 ； 2) 将 ARMS 引物及对应的下游引物、 中介连接引物、 通用荧光探针及其淬灭探针与热启 动快速 Taq 酶系统混合， 扩增 ； 3) 检测反应体系的荧光变化， 确定是否存在点突变。 0008 ARMS 引物对应的下游引物、 中介连接引物、 通用荧光探针优为简并的， 即一条下游 引物、 中介连接引物、 通用荧光探针可以对应于多条。 0009 作为上述方法的进一步改进， 通用荧光探针上连接荧光基团的核苷酸和淬灭探针 上连接淬灭基团的核苷酸在互补配对后的间距不超。
17、过4个核苷酸， 进一步的， 不超过3个、 2 个、 1 个或连接在相互配对的两个核苷酸上。 0010 作为上述方法的进一步改进， 中介连接引物中与突变位点下游的部分序列互补的 核酸数量不少于 5bp， 不少于 10bp， 特别的， 互补的核酸数量为 15 30bp。 0011 作为上述方法的进一步改进， 中介连接引物中与通用荧光探针部分核酸互补配对 的核酸数量不少于 5bp， 不少于 10bp， 特别的， 互补的核酸数量为 15 45bp。 0012 作为上述方法的进一步改进， 通用荧光探针的一端连接有保护核酸序列。 0013 一种 EGFR 多点突变单管快速检测试剂盒， 包括 DNA 提取液。
18、， 热启动快速 Taq 酶系 统和 EGFR 突变检测引物， 其特征在于 ： 所述 EGFR 突变检测引物由多组 ARMS 引物及对应的 下游引物、 中介连接引物、 通用荧光探针及其淬灭探针组成 ； 其中 ： 中介连接引物的一端序列与待 EGFR 突变位点下游的部分序列互补， 另一端序列与通 说 明 书 CN 104293913 A 5 3/7 页 6 用荧光探针部分核酸互补配对。 0014 优选的， 上述 EGFR 多点突变单管快速检测试剂盒中使用的中介连接引物中与 EGFR 突变位点下游的部分序列互补的核酸数量不少于 5bp， 不少于 10bp， 特别的， 互补的核 酸数量为 15 30b。
19、p。 0015 优选的， 上述 EGFR 多点突变单管快速检测试剂盒中使用的中介连接引物中与通 用荧光探针部分核酸互补配对的核酸数量不少于 5bp， 不少于 10bp， 特别的， 互补的核酸数 量为 15 45bp。 0016 特别的， 上述 EGFR 多点突变单管快速检测试剂盒中使用的 ARMS 引物的序列如 下 ： ARMS 引物 1 ： TTCAAAAAGATCAAAGTGCTGA(SEQ ID NO ： 1) ARMS 引物 2 ： TTCAAAAAGATCAAAGTGCTGT(SEQ ID NO ： 2) ARMS 引物 3 ： CAAAAAGATCAAAGTGCTGGC(SEQ I。
20、D NO ： 3) ARMS 引物 4 ： TTCCCGTCGCTATCAAAACATC(SEQ ID NO ： 4) ARMS 引物 5 ： TTCCCGTCGCTATCAAAACATC(SEQ ID NO ： 5) ARMS 引物 6 ： TTCCCGTCGCTATCAAAACATC(SEQ ID NO ： 6) ARMS 引物 7 ： TCCCGTCGCTATCAAGTCT(SEQ ID NO ： 7) ARMS 引物 8 ： CCGTCGCTATCAAGGTACA(SEQ ID NO ： 8) ARMS 引物 9 ： CGTCGCTATCAAGGCATCTC(SEQ ID NO ： 9。
21、) ARMS 引物 10 ： TCCCGTCGCTATCAAGTCT(SEQ ID NO ： 10) ARMS 引物 11 ： CCGTCGCTATCAAGGAGC(SEQ ID NO ： 11) ARMS 引物 12 ： CCGTCGCTATCAAGGAGC(SEQ ID NO ： 12) ARMS 引物 13 ： CCGTCGCTATCAAGGATCC(SEQ ID NO ： 13) ARMS 引物 14 ： CCGTCGCTATCAAGGAAGC(SEQ ID NO ： 14) ARMS 引物 15 ： CCGTCGCTATCAAGGAACC(SEQ ID NO ： 15) ARMS 引。
22、物 16 ： CCGTCGCTATCAAGGAACC(SEQ ID NO ： 16) ARMS 引物 17 ： CGTCGCTATCAAGGAATCTC(SEQ ID NO ： 17) ARMS 引物 18 ： CCGTCGCTATCAAGGAACC(SEQ ID NO ： 18) ARMS 引物 19 ： CCGTCGCTATCAAGGAACAG(SEQ ID NO ： 19) ARMS 引物 20 ： GTCGCTATCAAGGAATCATC(SEQ ID NO ： 20) ARMS 引物 21 ： CGTCGCTATCAAGGAATCTC(SEQ ID NO ： 21) ARMS 引物 。
23、22 ： GTCGCTATCAAGGAATTCGA(SEQ ID NO ： 22) ARMS 引物 23 ： AGCCTACGTGATGGCCAT(SEQ ID NO ： 23) ARMS 引物 24 ： CCAGCGTGGCCAGCGT(SEQ ID NO ： 24) ARMS 引物 25 ： CCAGCGTGGACGGTAAC(SEQ ID NO ： 25) ARMS 引物 26 ： GACAATTCCCACCACGTGT(SEQ ID NO ： 26) ARMS 引物 27 ： CACCGTGCAGCTCATCAT(SEQ ID NO ： 27) ARMS 引物 28 ： AGATCAC。
24、AGACTTTGGGCG(SEQ ID NO ： 28) ARMS 引物 29 ： GTTGGGCTGGCCAAACA ； (SEQ ID NO ： 29) ARMS 引物 1 和 2 对应的下游引物为 Y1 ： AGACCATGAGAGGCCCTG(SEQ ID NO ： 30) ； 说 明 书 CN 104293913 A 6 4/7 页 7 ARMS 引物 3 对应的下游引物为 Y2 ： AGATGATGGAAATATACAGCTTGC(SEQ ID NO ： 31) ； ARMS 引物 4 19 对应的下游引物为 Y3 ： TGTGGAGATGAGCAGGGT(SEQ ID NO ： 。
25、32) ； ARMS 引物 20 27 对应的下游引物为 Y4 ： TTGTCTTTGTGTTCCCGGA(SEQ ID NO ： 33) ； ARMS 引物 28 和 9 对应的下游引物为 Y5 ： GGCTGACCTAAAGCCACC(SEQ ID NO ： 34) ； ARMS 引物 1 3 对应的中介引物为 Z1 ： ACCTCGTTCTGGGCTCTACTCCGGTGCGTTCGGCACGGTGTATA(SEQ ID NO ： 35) ； ARMS 引物 4 22 对应的中介引物为 Z2 ： ACCTCGTTCTGGGCTCTACTCCATGGCTCTGAACCTCA(SEQ ID 。
26、NO ： 36) ； ARMS 引物 23 27 对应的中介引物为 Z3 ： ACCTCGTTCTGGGCTCTACCTGCCTCCTGGACTATG(SEQ ID NO ： 37) ； ARMS 引物 28 和 9 对应的中介引物为 Z4 ： ACCTCGTTCTGGGCTCTACCCATGCAGAAGGAGGCAA(SEQ ID NO ： 38)。 0017 特别的， 上述 EGFR 多点突变单管快速检测试剂盒中使用的通用荧光探针的序列 为 ： TC(dT-FAM)GCGGTGTTGGTGTAGAGCCCAGAACGAGGTTTTTTTTTTTTTTTTTT(SEQ ID NO ： 39)。
27、， 对应的淬灭序列为 ： 5 -BHQ-CCGCAGA-3 。 0018 热启动快速 Taq 酶系统的组成为 dNTPS(U)、 UNG 酶、 热启动快速 Taq 酶。 0019 本发明的有益效果是 ： 本发明的发明， 操作简单， 可以定性检测出多点突变的存在。 本发明的检测方法中使用 的引物设计难度低， 大幅降低了引物合成的成本。 0020 本发明检测方法克服了现有 ARMS 技术的局限性， 大大提高了其检测通量。 0021 本发明的检测方法实现了多管检测反应的简易性， 1 管反应取代了之前的多管检 测。节省人力物力。 附图说明 0022 图 1 是本发明检测方法的原理图 ； 图 2 是等浓。
28、度模板在不同 Taq 酶反应条件下的 PCR 扩增曲线。 具体实施方式 0023 多点突变单管快速检测方法， 包括如下步骤 ： 1) 设计针对不同点突变的 ARMS 引物及对应的下游引物、 中介连接引物、 通用荧光探针 及其淬灭探针 ； 其中， 中介连接引物由通用序列部分和特异序列部分构成， 通用序列部分与 通用荧光探针部分序列互补， 特异序列部分与点突变下游的部分序列互补 ； 2) 将 ARMS 引物及对应的下游引物、 中介连接引物、 通用荧光探针及其淬灭探针与热启 动快速 Taq 酶系统混合， 扩增 ； 3) 检测反应体系的荧光变化， 确定是否存在点突变。 0024 作为上述方法的进一步改。
29、进， 通用荧光探针上连接荧光基团的核苷酸和淬灭探针 上连接淬灭基团的核苷酸在互补配对后的间距不超过 4 个核苷酸， 进一步的， 不超过 3 个、 2 个、 1 个或连接在相互配对的两个核苷酸上。通用荧光探针和淬灭探针也可以是在同一条 说 明 书 CN 104293913 A 7 5/7 页 8 具有发卡结构的核酸序列。 0025 作为上述方法的进一步改进， 中介连接引物中与突变位点下游的部分序列互补的 核酸数量不少于 5bp， 不少于 10bp， 特别的， 互补的核酸数量为 15 30bp。 0026 作为上述方法的进一步改进， 中介连接引物中与通用荧光探针部分核酸互补配对 的核酸数量不少于 。
30、5bp， 不少于 10bp， 特别的， 互补的核酸数量为 15 45bp。 0027 互补序列的存在， 有利于保证引物间存在足够的亲和力， 保证检测结果的可靠性。 0028 作为上述方法的进一步改进， 通用荧光探针的一端连接有保护核酸序列。保护序 列的作用在于防止探针的关键序列不被反应体系中无意引入的核酸外切酶过早切除。 保护 序列不与待测序列、 引物等互补配对， 可以是简单重复序列， 如多个 A、 T、 C、 G 等。 0029 下面结合附图， 进一步说明本发明的检测原理。 0030 以 EGFR 突变点 S768I 为例， 该点的野生型为 G， 突变型为 T， 在 PCR 过程中， 首先使。
31、 用 1 对引物， 含 1 条针对突变点的 ARMS 引物 ( 引物最后一个碱基为 T) 和下游引物。该引 物在快速酶的作用下特异性的扩增出突变位点T。 野生型位点G不被扩增， 如图1a所示 ； 当 特异性扩增发生后， 在 ARMS 引物的引导下， 快速 Taq 酶沿着 DNA 模板， 向 5 -3 方向移动并 水解中介连接引物的序列介导区域， 而中介连接引物的探针互补区域则被释放， 如图 1b 所 示 ； 释放出来的探针互补区域， 基于碱基互补配对原则， 与通用荧光探针发生互补， 在淬灭 基团的存在下， 荧光基团的荧光被淬灭， 如图 1c 所示 ； 快速 Taq 酶通过中介连接引物的探针互补。
32、区域， 向 5 -3 方向移动， 水解淬灭基团， 从 而淬灭基团远离荧光基团， 从而 PCR 反应产生了荧光， 如图 1d 所示。 0031 因此， 只要多个个突变位点的 ARMS 引物、 下游引物和中介连接引物， 1 组通用荧光 探针与通用淬灭互补探针， 可以置于一个 PCR 反应管中， 即可以检测出样本中是否存在点 突变， 显著提高了 ARMS 法的检测通量。 0032 实施例 1 EGFR 多点突变单管快速检测试剂盒， 主成分如下 ： DNA 提取液 ： 50mM NaOH、 10mMTris-HCl(PH8.0)、 1 NP-40、 6 Chelex、 0.1mM EDTA(PH8.0。
33、) 组成热 启动快速 Taq 酶系统 ： 3U 的热启动 Taq， 0.5ul 的 dNTPs(25mM) 引物 ： EGFR 多点突变单管快速检测试剂盒使用的 ARMS 引物及对应的下游引物如下表 ： 说 明 书 CN 104293913 A 8 6/7 页 9 中介连接引物 ： 说 明 书 CN 104293913 A 9 7/7 页 10 通用荧光探针对 ： 通用荧光探针 ： 5 -TC(dT-FAM)GCGGTGTTGGTGTAGAGCCCAGAACGAGGTTTTTTTTTTTTTTTTT T-3 通用淬灭探针 ： 5 -BHQ-CCGCAGA-3 使用方法 ： DNA 提取 ： 取。
34、 2 片 10m 的 FFPE 组织切片， 刮取下来后放入到 1.5ml 离心管中， 再加入 120l 的 DNA 提取液， 100煮沸 10 分钟后， 将离心管 12000rpm 离心 5 分钟， 取 10l 的上清加入到 PCR 反应管中 ； 快速 PCR ： 50l 荧光 PCR 体系中， 3U 的快速 Taq 酶， 10mM Tris-HCL， 50mM KCL， 0.5U 的 UNG 酶， 0.2mM dNTPS(U)， 3mM MgCl2。通用荧光探针与通用淬灭互补探针各 1m， 28 个突变位点的 ARMS 引物、 下游引物和中介连接引物各 1m。95 度 5min 后， 95 。
35、5 秒， 58 31 秒， 循环数 为 40 循环。 0033 监测反应体系的荧光变化， 如存在点突变， 则荧光信号会增长， 如图 2 所示。 说 明 书 CN 104293913 A 10 1/10 页 11 广州和实生物技术有限公司 多点突变单管快速检测方法及试剂盒 39 PatentIn version 3.5 1 22 DNA 人工引物 1 ttcaaaaaga tcaaagtgct ga 22 2 22 DNA 人工引物 2 ttcaaaaaga tcaaagtgct gt 22 3 21 DNA 人工引物 3 caaaaagatc aaagtgctgg c 21 4 序 列 表 C。
36、N 104293913 A 11 2/10 页 12 22 DNA 人工引物 4 ttcccgtcgc tatcaaaaca tc 22 5 22 DNA 人工引物 5 ttcccgtcgc tatcaaaaca tc 22 6 22 DNA 人工引物 6 ttcccgtcgc tatcaaaaca tc 22 7 19 DNA 人工引物 7 tcccgtcgct atcaagtct 19 8 19 DNA 人工引物 序 列 表 CN 104293913 A 12 3/10 页 13 8 ccgtcgctat caaggtaca 19 9 20 DNA 人工引物 9 cgtcgctatc aa。
37、ggcatctc 20 10 19 DNA 人工引物 10 tcccgtcgct atcaagtct 19 11 18 DNA 人工引物 11 ccgtcgctat caaggagc 18 12 18 DNA 人工引物 12 ccgtcgctat caaggagc 18 序 列 表 CN 104293913 A 13 4/10 页 14 13 19 DNA 人工引物 13 ccgtcgctat caaggatcc 19 14 19 DNA 人工引物 14 ccgtcgctat caaggaagc 19 15 19 DNA 人工引物 15 ccgtcgctat caaggaacc 19 16 1。
38、9 DNA 人工引物 16 ccgtcgctat caaggaacc 19 17 序 列 表 CN 104293913 A 14 5/10 页 15 20 DNA 人工引物 17 cgtcgctatc aaggaatctc 20 18 19 DNA 人工引物 18 ccgtcgctat caaggaacc 19 19 20 DNA 人工引物 19 ccgtcgctat caaggaacag 20 20 20 DNA 人工引物 20 gtcgctatca aggaatcatc 20 21 20 DNA 人工引物 序 列 表 CN 104293913 A 15 6/10 页 16 21 cgtcg。
39、ctatc aaggaatctc 20 22 20 DNA 人工引物 22 gtcgctatca aggaattcga 20 23 18 DNA 人工引物 23 agcctacgtg atggccat 18 24 16 DNA 人工引物 24 ccagcgtggc cagcgt 16 25 17 DNA 人工引物 25 ccagcgtgga cggtaac 17 序 列 表 CN 104293913 A 16 7/10 页 17 26 19 DNA 人工引物 26 gacaattccc accacgtgt 19 27 18 DNA 人工引物 27 caccgtgcag ctcatcat 18 。
40、28 19 DNA 人工引物 28 agatcacaga ctttgggcg 19 29 17 DNA 人工引物 29 gttgggctgg ccaaaca 17 30 序 列 表 CN 104293913 A 17 8/10 页 18 18 DNA 人工引物 30 agaccatgag aggccctg 18 31 24 DNA 人工引物 31 agatgatgga aatatacagc ttgc 24 32 18 DNA 人工引物 32 tgtggagatg agcagggt 18 33 19 DNA 人工引物 33 ttgtctttgt gttcccgga 19 34 18 DNA 人工。
41、引物 序 列 表 CN 104293913 A 18 9/10 页 19 34 ggctgaccta aagccacc 18 35 44 DNA 人工引物 35 acctcgttct gggctctact ccggtgcgtt cggcacggtg tata 44 36 38 DNA 人工引物 36 acctcgttct gggctctact ccatggctct gaacctca 38 37 36 DNA 人工引物 37 acctcgttct gggctctacc tgcctcctgg actatg 36 38 37 DNA 人工引物 38 acctcgttct gggctctacc catgcagaag gaggcaa 37 序 列 表 CN 104293913 A 19 10/10 页 20 39 47 DNA 通用探针 39 gcggtgttgg tgtagagccc agaacgaggt tttttttttt ttttttt 47 序 列 表 CN 104293913 A 20 1/2 页 21 图 1 说 明 书 附 图 CN 104293913 A 21 2/2 页 22 图 2 说 明 书 附 图 CN 104293913 A 22 。