特异探测膀胱癌细胞的分子遗传装置的构建方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104293819 A (43)申请公布日 2015.01.21 CN 104293819 A (21)申请号 201410441470.1 (22)申请日 2014.09.01 C12N 15/66(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 深圳市第二人民医院 地址 518035 广东省深圳市福田区笋岗西路 3002 号 (72)发明人 黄卫人 刘宇辰 蔡志明 (74)专利代理机构 深圳鼎合诚知识产权代理有 限公司 44281 代理人 向武桥 彭家恩 (54) 发明名称 特异探测膀胱癌细胞的分子遗传装置的构建 方法 (57) 摘要 本 。

2、发 明 公 开 了 一 种 特 异 探 测 膀 胱 癌 细 胞 的 分 子 遗 传 装 置 的 构 建 方 法，包 括 ：构 建 质 粒 hUPII-pSpCas9、构 建 质 粒 hTERT-gRNA-BAM、构 建 质 粒 pRL-SV40-LacI、 构 建 质 粒 pcDNA3-LacO-hRluc 和 构 建 质 粒 pcDNA3-LacO-E-cadherin。构建的分子遗传装置 能够有效特异控制膀胱癌细胞并显著影响其恶性 生物学行为， 并能够有效检测膀胱癌细胞并增强 荧光素酶基因的表达， 便于科学研究。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 1 页 。

3、附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图3页 (10)申请公布号 CN 104293819 A CN 104293819 A 1/1 页 2 1. 一种特异探测膀胱癌细胞的分子遗传装置的构建方法， 所述其特征在于， 包括 ： 构建质粒 hUPII-pSpCas9 ； 构建质粒 hTERT-gRNA-BAM ； 构建质粒 pRL-SV40-LacI ； 构建质粒 pcDNA3-LacO-hRluc ； 构建质粒 pcDNA3-LacO-E-cadherin。 2. 如权利要求 1 所述的构建方法， 其特征在于， 将 h。

4、UPII 启动子片段插入质粒 Cbh-3X-FLAG-NLS-SpCas9-NLS 的 XbaI/AgeI 位点， 而构 建所述质粒 hUPII-pSpCas9 ； 将 hTERT 启动子和核酸酶序列围绕的引导 RNA 分子分别插入质粒 pCMVp-NEO-BAM 的 XbaI/Sal I 和 Sal I/BamH I 位点， 而构建所述质粒 hTERT-gRNA-BAM ； 将 lacI 基 因 序 列 插 入 质 粒 pRL-SV40 的 NheI/XbaI 位 点，而 构 建 所 述 质 粒 pRL-SV40-LacI ； 将 lac 操纵子序列和 hRluc 基因分别插入质粒 pcDN。

5、A3 的 HindIII/Kpn I 和 BamH I/ EcoR I 位点， 而构建所述质粒 pcDNA3-LacO-hRluc ； 将人 E-cadherin cDNA 序列插入 pcDNA3-LacO-hRluc 的 BamH I/EcoR I 位点， 而构建 所述质粒 pcDNA3-LacO-E-cadherin。 3. 如权利要求 2 所述的构建方法， 其特征在于， 所述 lacI 基因序列如 SEQ ID NO:1 所 示。 4. 如权利要求 1 所述的构建方法， 其特征在于， 所述膀胱癌细胞如 T24、 5637、 J82 或 SW-780。 5. 一种权利要求 1 所述构建方法。

6、构建的分子遗传装置在特异探测膀胱癌细胞试剂盒 中的应用。 6. 一种权利要求 1 所述构建方法构建的分子遗传装置在抑制膀胱癌细胞药物中的应 用。 7. 一种权利要求 1 所述构建方法构建的分子遗传装置在膀胱癌细胞中特异表达效应 基因上的应用。 8. 如权利要求 7 所述的应用， 其特征在于， 所述效应基因是 luciferase 基因或 E-cadherin 基因。 权 利 要 求 书 CN 104293819 A 2 1/4 页 3 特异探测膀胱癌细胞的分子遗传装置的构建方法 技术领域 0001 本申请涉及一种特异探测膀胱癌细胞的分子遗传装置。 背景技术 0002 在我国， 膀胱癌发病率和死。

7、亡率均居泌尿系统肿瘤首位。美国肿瘤协会 2011 年的 统计资料显示， 全世界每年新增膀胱癌患者 38 万， 死亡人数 15 万。近十多年来， 膀胱癌发 病有逐年上升和年轻化等趋势。许多患者就诊时已属中晚期， 缺乏有效治疗手段， 预后差， 死亡率高。 膀胱移行上皮细胞癌占膀胱癌的90以上， 其分为非肌层浸润性和肌层浸润性， 前者易发生复发， 主要采用经尿道膀胱肿瘤切除术进行治疗， 术后辅以膀胱灌注治疗， 减少 复发 ； 后者易发生转移， 主要采用根治性膀胱切除术进行治疗， 术后辅以化疗或放疗。膀胱 癌转移是患者的主要死因。骨盆淋巴结是膀胱癌转移的首选部位， 其次为肺、 骨、 肝脏和脑 组织。膀。

8、胱癌发生转移患者的中位生存时间为 12-15 个月。化疗是晚期膀胱癌治疗的主要 手段， 但疗效不佳， 不能显著延长患者的生存时间。 0003 基因治疗， 尤其近年来发展起来的分子靶向治疗， 曾是晚期膀胱癌治疗的希望， 但 是存在诸多难以突破的技术瓶颈， 如靶向性差、 杀伤效果不稳定、 安全性隐患等， 严重限制 了该技术在肿瘤治疗中的应用。因此， 探索特异、 高效和副作用小的新型生物靶向治疗方 法， 对于膀胱癌的治疗具有非常重要的意义。 0004 CRISPR Cas9 系统是细菌利用来保护自身免受外来病毒和核酸侵袭的细胞机器。 当细菌受到噬菌体感染后， CRISPR RNA 就能通过互补序列结。

9、合噬菌体 DNA 序列， 并表达 Cas9一种核酸切割酶， 能切割噬菌体 DNA， 沉默其基因表达。CRISPR Cas9 系统目前已 被开发成为新一代基因组编辑技术， 为修复突变 DNA 提供了一条简单的途经， 有潜力用于 治疗许多的遗传基因疾病。 将CRISPR/Cas系统用于真核细胞需要满足两个条件 ： 一个是表 达 Cas9 酶， 用于切断靶标 DNA ； 另外一个就是称为引导 RNA 的 RNA 分子， 这种分子能通过碱 基配对与靶标互补结合。 发明内容 0005 本发明提供一种新的特异探测膀胱癌细胞的分子遗传装置的构建方法。 0006 本发明提供一种特异探测膀胱癌细胞的分子遗传装置。

10、的构建方法， 其特征在于， 包括 ： 0007 构建质粒 hUPII-pSpCas9 ； 0008 构建质粒 hTERT-gRNA-BAM ； 0009 构建质粒 pRL-SV40-LacI ； 0010 构建质粒 pcDNA3-LacO-hRluc ； 0011 构建质粒 pcDNA3-LacO-E-cadherin。 0012 将 hUPII 启动子片段插入质粒 Cbh-3X-FLAG-NLS-SpCas9-NLS 的 XbaI/AgeI 位点， 而构建所述质粒 hUPII-pSpCas9。 说 明 书 CN 104293819 A 3 2/4 页 4 0013 将 hTERT 启动子和核。

11、酸酶序列围绕的引导 RNA 分子分别插入质粒 pCMVp-NEO-BAM 的 XbaI/Sal I 和 Sal I/BamH I 位点， 而构建所述质粒 hTERT-gRNA-BAM。 0014 将 lacI 基因序列插入质粒 pRL-SV40 的 NheI/XbaI 位点， 而构建所述质粒 pRL-SV40-LacI。 0015 将 lac 操纵子序列和 hRluc 基因分别插入质粒 pcDNA3 的 HindIII/Kpn I 和 BamH I/EcoR I 位点， 而构建所述质粒 pcDNA3-LacO-hRluc。 0016 将人 E-cadherin cDNA 序列插入 pcDNA3。

12、-LacO-hRluc 的 BamH I/EcoR I 位点， 而 构建所述质粒 pcDNA3-LacO-E-cadherin。 0017 分子遗传装置的构建基于 CRISPR-Cas9 技术， 该装置可以包含逻辑 “与” 门遗传线 路。分子遗传装置整合了人端粒酶逆转录酶基因的肿瘤特异性启动子和人 uroplakin 基因 的膀胱特异性启动子。该装置基于来自这两个启动子的输入信息， 并只在它们均有高转录 活性的细胞中激活输出端基因的 CMV 启动子 ( 该启动子在一般情况下被 lacI 抑制 )。 0018 当且仅在膀胱癌细胞 ( 同时具有高转录活性的 hTERT 和 hUPII 启动子 ) 。

13、中， Cas9 系统能有效工作并沉默阻遏蛋白 lac I 的表达， 从而激活效应基因的表达。 0019 上述质粒的混合物与转染试剂形成质粒 / 转染试剂混合物。转染试剂如 Lipofectamin2000。质粒 / 转染试剂混合物进行荧光酶素活性检测和细胞迁移运动能力检 测。 0020 所述 lacI 基因序列如 SEQ ID NO:1 所示。 0021 所述膀胱癌细胞如 T24、 5637、 J82 或 SW-780。 0022 一种所述构建方法构建的分子遗传装置在特异探测膀胱癌细胞试剂盒中的 应 用。 0023 一种所述构建方法构建的分子遗传装置在抑制膀胱癌细胞药物中的应用。 0024 一。

14、种所述构建方法构建的分子遗传装置在膀胱癌细胞中特异表达效应基因上的 应用。 0025 所述效应基因是 luciferase 基因或 E-cadherin 基因。 0026 本发明的有益效果是 ： 构建的分子遗传装置能够有效特异控制膀胱癌细胞并显著 影响其恶性生物学行为， 并能够有效检测膀胱癌细胞并增强荧光素酶基因的表达， 便于科 学研究。 附图说明 0027 图 1 是分子遗传装置的工作原理示意图 ； 0028 图 2 是 lacI 靶序列和所设计的引导 RNA 序列示意图 ； 0029 图 3 是荧光素酶检测结果图， 其中， 横坐标依次表示膀胱癌细胞系 T24、 膀胱癌细 胞系 5637、 。

15、膀胱癌细胞系 SW-780、 膀胱癌细胞系 J82、 HEK-293T( 人胚肾脏细胞 )、 HeLa( 宫 颈癌细胞 )、 A549( 肺癌细胞 )、 PC-3( 前列腺癌细胞 )、 GC-1( 精母细胞 )、 GC-2( 精母细胞 ) 和 Fibroblast( 人成纤维上皮细胞 )， 对于每个细胞， 左边方柱指本发明分子遗传装置， 右 侧方柱指 hTERT-Rluc 载体 ； SC-1 指仅在膀胱癌细胞中高表达荧光素酶的分子遗传装置 ； 0030 图 4 是细胞划痕检测结果图， 其中， A K 依次表示膀胱癌细胞系 T24、 膀胱癌细胞 系 5637、 膀胱癌细胞系 SW-780、 膀胱。

16、癌细胞系 J82、 HEK-293T( 人胚肾脏细胞 )、 HeLa( 宫颈 说 明 书 CN 104293819 A 4 3/4 页 5 癌细胞 )、 A549( 肺癌细胞 )、 PC-3( 前列腺癌细胞 )、 GC-1( 精母细胞 )、 GC-2( 精母细胞 ) 和 人成纤维上皮细胞， 对于每个细胞， 上面表示 0 小时取样结果， 下面表示 24 小时取样结果， 从左至右依次表示 SC-1、 SC-4 及 pcDNA3-hTERT-E-cadherin。 具体实施方式 0031 下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。 0032 技术与方法 0033 1. 细胞培养 0034。

17、 膀胱癌细胞系 T24、 J82、 5637、 SW-780 和 HEK-293T( 人胚肾脏细胞 )、 HeLa( 宫颈癌 细胞)、 A549(肺癌细胞)、 PC-3(前列腺癌细胞)、 GC-1(精母细胞)和GC-2 (精母细胞)购 自 American Type Culture Collection(ATCC,Manassas,USA)， 人成纤维上皮细胞由发明 人分离培养。 细胞培养液由90的DMEM(Invitrogen,CA)， 10的胎牛血清(Invitrogen)， 1 -2的谷氨酰胺和 0.5 -1的双抗配成。 0035 2. 分子遗传装置的构建 0036 质粒 hUPII-p。

18、SpCas9(PX165) 的构建过程如下 ： 将 hUPII 启动子片段插入质粒 Cbh-3X-FLAG-NLS-SpCas9-NLS(从Addgene获得， Addgene是全球科学家质粒共享非盈利组 织 ) 的 XbaI/AgeI 位点。 0037 质粒hTERT-gRNA-BAM的构建过程如下 ： 将hTERT启动子和核酸酶序列围绕的引导 RNA 分子分别插入质粒 pCMVp-NEO-BAM( 从 Addgene 获得 ) 的 XbaI/Sal I 和 Sal I/BamH I 位点。 0038 质粒 pRL-SV40-LacI 的构建过程如下 ： 将 lacI 基因序列插入质粒 pR。

19、L-SV40( 从 Promega 公司获得 ) 的 NheI/XbaI 位点。 0039 质粒 pcDNA3-LacO-hRluc 的构建过程如下 ： 将 lac 操纵子序列和 hRluc 基因分别 插入质粒 pcDNA3( 从 Addgene 获得 ) 的 Hind III/Kpn I 和 BamH I/EcoRI 位点。 0040 质粒pcDNA3-LacO-E-cadherin的构建过程如下 ： 将人E-cadherin cDNA序列插入 pcDNA3-LacO-hRluc 的 BamH I/EcoR I 位点。 0041 3. 细胞转染 0042 转 染 前 一 天， 4-5104个。

20、 细 胞 接 种 在 24 孔 板 上， 加 入 0.5ml 培 养 基， 放 在 37、 5 CO2培养箱内。生长 24 小时后， 细胞汇合度达到 70， 在 50ul 的无血清 培养基内加入 1ug 重组质粒的混合物， 柔和混匀。在 50ul 无血清培养基内加入 1ul Lipofectamin2000(Invitrogen,CA) 试剂， 轻轻混匀， 室温放置 5min。将稀释好的质粒和 Lipo2000 轻柔混匀， 室温放置 20 分钟， 以便形成质粒 /lipofectamin 混合物。将质粒 / lipofectamin 混合物加入 24 孔板内， 轻柔摇晃 24 孔板。放入培养箱。

21、内， 4-6 小时后更换培 养基。 0043 4. 荧光素酶活性检测 0044 用 Promega 公 司 的 Dual-Luciferase Reporter Assay System 检 测 样 品 Luciferase 活性。按上述转染方法转染细胞。转染 48h 后， 吸去旧培养基， 用 PBS 清洗 洗两次， 每孔细胞加入 100l 的 Passive Lysis Buffer(PLB)， 室温轻微振摇 15min。收 集细胞裂解液于 1.5ml Eppendorf 管中 ； 向 Eppendorf 管中加入 100l 的 Luciferase 说 明 书 CN 104293819 A。

22、 5 4/4 页 6 Assay Reagent II(LAR II) ； 将细胞裂解液 12,000g 离心 1min， 取上 清 50l 加入 1.5ml Eppendorf 管中并吹打均匀 ： 用阅读仪测量可见光强度 l0s( 此时所读光为 psiCHECK2 载 体上转录翻译产生的萤火虫 Luciferase 所发出的 ) ； 取出 Eppendorf 管， 加入 100l Stop&Glo Reagent， 吹打均匀 ； 用阅读仪测量可见光强度 10s( 此时所读光为 psiCHECK2 载 体上转录翻译出的海肾 Luciferase 所发出的 ) 将所得到的数据， 标准化后进行分析。

23、。荧光 素酶活性检测结果如图 3 所示。 0045 5. 细胞迁移运动能力检测 0046 细胞迁移运动能力由细胞划痕实验检测。先用 marker 笔在 24 孔板背后， 用直尺 比着， 均匀得划横线， 大约每隔 0.5 1cm 一道， 横穿过孔。每孔至少穿过 5 条线。用 PBS 洗细胞 3 次， 去处划下的细胞， 加入无血清培养基。放入 37 度 5 CO2 培养箱， 培养。按 0， 24 小时取样， 拍照。细胞迁移运动能力检测结果如图 4 所示。 0047 6. 统计学分析 0048 数据分析使用 SPSS17.0 统计软件， 正态分布的数据采用 xs 表示。两组间比较， 采用独立样本 t。

24、 检验。检验水准以 P0.05 表示差别具有统计学意义。 0049 实验结果 0050 1. 分子遗传装置的构建 0051 基于 CRISPR-Cas9 技术构建了一个包含逻辑 “与” 门遗传线路的分子装置 ( 如图 1 所示)， 该装置整合了人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)的肿瘤特异性启动子和人uroplakin 基因的膀胱特异性启动子。该装置基于来自这两个启动子的输入信息， 并只在它们均有高 转录活性的细胞中激活输出端基因的 CMV 启动子 ( 该启动子在一般情况下被 lacI 抑制 )。 启动子的信息整合是通过 Cas9 蛋白和靶向 lacI 基因的引导 RNA 的结合来实现的。该引导。

25、 RNA 和其 lacI 靶序列的分子序列如图 2 所示。lacI 的序列是 GAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGC GAAAACGCGGGAAAAAGTGGA(SEQ ID NO:1)。引导 RNA(sgRNA) 的序列如图 2 所示。 0052 2. 该装置特异性识别膀胱癌细胞的实验验证 0053 当效应基因被选取为 luciferase 基因时， 荧光素酶检测实验结果显示， 该装置仅 在膀胱癌细胞 T24、 5637、 J82 和 SW-780 中激活荧光素酶报告基因的表达 ( 如图 3 所示 )。 这些结果提示该分子遗传装置能有效检测膀胱癌细胞并增强荧光素酶基因的表达 ( 与。

26、 hTERT-Rluc 载体相比 )。 0054 3. 该装置特异性控制膀胱癌细胞恶性生物学行为的实验验证 0055 当效应基因被选取为 E-cadherin 时， 实验结果显示， 该装置仅在膀胱癌细胞 T24、 5637、 J82 和 SW-780 中抑制细胞的迁移 ( 如图 4 所示 )。这些结果提示该分子遗传装置能 有效特异控制膀胱癌细胞并显著影响其恶性生物学行为 ( 与 hTERT-Rluc 载体相比 )。 0056 以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明， 不能认定本发 明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说， 在不脱 离本发明构思的前提下， 还可以做出若干简单推演或替换。 说 明 书 CN 104293819 A 6 1/1 页 7 0001 序 列 表 CN 104293819 A 7 1/3 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104293819 A 8 2/3 页 9 图 3 说 明 书 附 图 CN 104293819 A 9 3/3 页 10 图 4 说 明 书 附 图 CN 104293819 A 10 。