一株茎点霉属内生真菌及其应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104293681 A (43)申请公布日 2015.01.21 CN 104293681 A (21)申请号 201410447123.X (22)申请日 2014.09.04 CCTCC No.M 2014162 2014.04.25 201410216817.2 2014.05.21 CN C12N 1/14(2006.01) C09K 17/00(2006.01) C12R 1/645(2006.01) C09K 101/00(2006.01) (71)申请人 浙江大学 地址 310027 浙江省杭州市西湖区浙大路 38 号 (72)发明人 王洪凯 陈亚平 林。

2、福呈 (74)专利代理机构 杭州天勤知识产权代理有限 公司 33224 代理人 胡红娟 (54) 发明名称 一株茎点霉属内生真菌及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一株茎点霉属内生真菌及其应 用。所述茎点霉属内生真菌命名为茎点霉 (phoma sp.)KDZ-5， 保藏编号为 CCTCC No.M 2014162。所 述应用是该茎点霉属内生真菌在提高水稻或小麦 耐盐性中的应用。本发明首次发现茎点霉 (phoma sp.)KDZ-5 可以提高水稻和小麦对盐胁迫的抵御 能力， 试验表明， 将 KDZ-5 菌株与水稻苗建立共 培养体系后， KDZ-5 菌株能显著促进水稻苗在加 盐 MS 平板上的生。

3、长 ； 将 KDZ-5 菌株在营养液水培 和土壤盆栽条件下与小麦苗建立共培养体系后， KDZ-5 菌株能显著减缓或延迟盐碱地中小麦的盐 害症状， 同时大大增加了小麦的生物量累积。 (66)本国优先权数据 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 10 页 序列表 2 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书10页 序列表2页 附图3页 (10)申请公布号 CN 104293681 A CN 104293681 A 1/1 页 2 1.一株茎点霉属内生真菌， 其特征在于， 命名为茎点霉(phoma sp.。

4、)KDZ-5， 保藏编号为 CCTCC No.M 2014162。 2. 一种含有如权利要求 1 所述茎点霉属内生真菌的菌剂。 3. 如权利要求 2 所述的菌剂， 其特征在于， 采用所述茎点霉属内生真菌的菌丝制成。 4. 如权利要求 3 所述的菌剂， 其特征在于， 所述茎点霉属内生真菌菌丝的浓度为 1 3g/L。 5. 如权利要求 1 所述茎点霉属内生真菌在提高小麦耐盐性中的应用。 6. 如权利要求 5 所述的应用， 其特征在于， 包括 ： 在盐碱地土壤中拌入所述茎点霉属内 生真菌， 然后将萌发的小麦种子播种于盐碱地中 ； 或者， 将小麦幼苗与所述茎点霉属内生真菌建立共培养体系， 然后将共培养。

5、体系转移 至盐碱地中生长。 7. 如权利要求 1 所述茎点霉属内生真菌在提高水稻耐盐性中的应用。 8. 如权利要求 7 所述的应用， 其特征在于， 包括 ： 将水稻幼苗与所述茎点霉属内生真菌 建立共培养体系， 然后将共培养体系转移至盐碱地中生长 ； 或者， 在育苗圃土壤中拌入所述茎点霉属内生真菌， 然后将水稻种子播种于育苗圃中， 并在移栽期将育苗圃中长出的水稻幼苗移栽至盐碱地中。 权 利 要 求 书 CN 104293681 A 2 1/10 页 3 一株茎点霉属内生真菌及其应用 技术领域 0001 本发明属于微生物种质资源利用领域， 具体涉及一株茎点霉属内生真菌及其应 用。 背景技术 000。

6、2 土壤盐碱化降低了耕地的生产力， 是粮食生产中一个非常重要的非生物胁迫， 每 年给世界的粮食生产造成严重的损失， 并且严重影响到地区的生态平衡。目前， 全世界有 超过 8 亿公顷的土地存在土地盐渍化的问题， 占据了所有陆地面积的 6。特别是在干旱、 半干旱和地中海式气候的地区， 这个问题更为严重。近些年来， 不合理的耕种和灌溉， 以及 环境污染和生态平衡的破坏是导致盐渍化的问题的主要原因。 我国土壤盐渍化问题十分严 峻， 盐碱地分布范围广、 面积大、 类型多， 主要分布在华北平原、 东北平原、 西北内陆地区及 滨海地区。 所以， 如何改良和利用大面积的盐碱地， 提高植物的耐盐碱能力已经成为我。

7、国生 物科学技术领域的急待解决的重大课题。 这也对改善生态环境， 推动区域经济、 社会和生态 可持续发展具有特别重要意义。 0003 国内外盐碱地改良方法主要有水利工程措施、 农业改良措施、 生物改良措施以及 化学改良措施等。 水利工程措施主要是指大水洗盐 ； 农业改良措施主要包括铺沙盖土、 客土 换土、 深挖埋绿肥、 深耕翻土等 ； 化学改良措施主要是添加土壤改良剂， 目前常用的主要有 石膏、 石灰石、 磷石膏等 ； 生物改良措施主要是种植耐盐碱的植物如向日葵， 甜菜、 玉米、 大 麦、 大豆、 棉花、 高粱等， 使盐碱地在利用过程中得到改良。 0004 选择耐盐品种也是利用盐渍化土壤的主要。

8、途径。许多研究人员希望可以通过培 育耐盐植物来解决土壤盐渍化的利用问题， 可是由于植物在耐盐性方面遗传和生理的复杂 性， 并未得到理想的成果。 近些年研究发现共生菌对提高植物的耐盐性具有较好的效果， 不 仅可以改善土壤状况还可以增强植物的生长。因此， 通过微生物与植物的共生来增强植物 的耐盐性具有良好的应用前景。 0005 小麦和水稻是重要的粮食作物， 具有重要的经济意义。提高这些粮食作物的抗盐 碱能力， 使其在盐渍化的土壤也能够形成具有一定规模的产量， 对有效利用盐渍化土地、 扩 大小麦和水稻的种植面积具有重要前景。 0006 近年来， 关于丛枝菌根真菌对植物耐盐性的影响的研究展示了真菌在增。

9、强植物耐 盐性上的潜力。利用内生真菌提高大豆抗盐性的研究也已经有了研究报道， 但内生真菌在 提高水稻和小麦的耐盐、 抗盐性上的作用还没有发表研究报告。 发明内容 0007 本发明提供了一株茎点霉属内生真菌， 该菌株能够提高水稻和小麦对盐胁迫的耐 受能力。 0008 一株茎点霉属内生真菌， 分类命名为茎点霉 (phoma sp.)， 株号为 KDZ-5， 已于 2014年4月25日保藏于位于中国武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为 说 明 书 CN 104293681 A 3 2/10 页 4 CCTCC No.M 2014162。 0009 本发明的茎点霉属内生真菌 KDZ-5。

10、( 即 Phoma sp.KDZ-5) 具有如下特性 ： 该菌株 在 PDA 平板上， 菌落生长迅速， 25黑暗条件下培养 7 天， 菌落直径平均 5.2cm ； 初期菌落呈 灰白色， 后期逐渐呈深灰色至棕褐色， 菌落质地较硬， 菌丝具隔膜， 无色至黄褐色， 分生孢子 器、 分生孢子未见 ； 其 ITS 序列如 SEQ ID No.1 所示。 0010 本发明还提供了一种含有所述茎点霉属内生真菌的菌剂。 由于所述茎点霉属内生 真菌不产孢， 因此所述菌剂采用所述茎点霉属内生真菌的菌丝制成。菌剂的剂型可以根据 需要制成固体剂型或液体剂型， 若为液体剂型， 作为优选， 所述茎点霉属内生真菌菌丝的浓 。

11、度为 1 3g/L。根据使用场合的差异， 所述液体剂型可采用水 ( 有土栽培 ) 或 Hoagland s 营养液 ( 无土栽培 ) 配制。 0011 试验表明， 在盐胁迫下， 水培营养液或土壤中接种 KDZ-5 菌株的小麦幼苗出现失 绿发黄、 萎焉干枯等盐害症状比对照组推迟、 症状较轻、 长势更旺盛 ； 表现为 ： 在 100mM 盐浓 度胁迫14d后， 水培营养液中接种KDZ-5的小麦苗在株高、 鲜重、 干重上都得到了显著增加， 分别提高了 7.8、 21.6。13.0 ； 在 200mM 盐胁迫下， 土壤中接种 KDZ-5 的小麦苗在鲜 重和干重上分别比对照组提高了 10.9和 12.5。

12、 ； 在 250mM 盐胁迫下， 接种 KDZ-5 的小麦 苗比对照组在株高、 鲜重和干重上分别增加了 51.4、 10.2、 18.5 ； 说明 KDZ-5 菌株可 以增强小麦幼苗对盐胁迫的抵御能力。 0012 因此， 本发明还提供了所述茎点霉属内生真菌在提高小麦耐盐性中的应用。所述 应用包括 ： 在盐碱地土壤中拌入所述茎点霉属内生真菌， 然后将萌发的小麦种子播种于盐 碱地中 ； 0013 小麦种子在发芽生长过程中， 所述茎点霉属内生真菌即自然地与小麦种子建立起 了共生关系。 0014 或者， 所述应用包括 ： 将小麦幼苗与所述茎点霉属内生真菌建立共培养体系 ( 即 共生体系 )， 然后将共。

13、培养体系转移至盐碱地中生长。 0015 小麦幼苗与KDZ-5菌株的共培养体系可以在MS培养基平板上建立， 也可以在水培 营养液中建立。在 MS 培养基平板上建立即是将小麦幼苗移栽至 MS 培养基平板上， 然后挑 取KDZ-5菌株的菌丝接种在小麦幼苗的根部附近， 使KDZ-5菌株与小麦幼苗共培养 ； 在水培 营养液中建立即是将小麦幼苗转移至含有 KDZ-5 菌株的水培营养液中， 进行共培养。共培 养完成后， 将共生有 KDZ-5 菌株的小麦幼苗转移至盐碱地中即可。 0016 由于小麦难以忍受长期的水涝环境， 因此在建立共培养体系时， 优选在 MS 培养基 平板上建立共培养体系， 然后再转移至盐碱。

14、地中。 实际应用中， 更优选为直接在盐碱地土壤 中拌入所述茎点霉属内生真菌， 然后将萌发的小麦种子播种于盐碱地中。 0017 试验表明， KDZ-5 菌株在加盐 MS 平板上可以稳定促进水稻幼苗生长， 除在株高上 与对照有显著差异外， 共培养有KDZ-5菌株的加盐MS平板上， 水稻幼苗的茎秆也显著加粗， 叶片也相对较宽， 表现出更好地生长态势 ； 表现为在 200mM NaCl 的盐胁迫下， MS 培养基平 板上接种内生真菌KDZ-5的水稻幼苗在鲜重和干重上比对照组平均提高了19.5、 78.9； 说明 KDZ-5 菌株可以显著增强水稻幼苗对盐胁迫的抵御能力。 0018 因此， 本发明还提供了。

15、所述茎点霉属内生真菌在提高水稻耐盐性中的应用。所述 应用包括 ： 将水稻幼苗与所述茎点霉属内生真菌建立共培养体系， 然后将共培养体系转移 说 明 书 CN 104293681 A 4 3/10 页 5 至盐碱地中生长 ； 0019 水稻幼苗与 KDZ-5 菌株的共培养体系也可以在 MS 培养基平板上或水培营养液中 建立， 建立方法与小麦相同。 0020 或者， 所述应用包括 ： 在育苗圃土壤中拌入所述茎点霉属内生真菌， 然后将水稻种 子播种于育苗圃中， 并在移栽期将育苗圃中长出的水稻幼苗移栽至盐碱地中。 0021 上述两种方法均适用于水稻的实际生产当中， 但出于节约成本考虑， 更优选为第 二种。

16、应用方式。 0022 与现有技术相比， 本发明的有益效果为 ： 0023 本发明首次发现茎点霉(phoma sp.)属内生真菌KDZ-5可以提高水稻和小麦对盐 胁迫的抵御能力， 试验表明， 将 KDZ-5 菌株与水稻苗建立共培养体系后， KDZ-5 菌株能显著 促进水稻苗在加盐MS平板上的生长 ； 将KDZ-5菌株在营养液水培和土壤盆栽条件下与小麦 苗建立共培养体系后， KDZ-5 菌株能显著减缓或延迟盐碱地中小麦的盐害症状， 同时大大增 加了小麦的生物量累积。 附图说明 0024 图 1a 为菌株 KDZ-5 在 PDA 平板上的生长状态图 ( 正面 ) ； 0025 图 1b 为菌株 KD。

17、Z-5 在 PDA 平板上的生长状态图 ( 反面 ) ； 0026 图 2 为实施例 1 中 SE 组和 SC 组的水稻苗在含有 200mM NaCl 的 MS 平板上生长两 周的生长状态对比图 ； 0027 图 3 为实施例 2 中 SE 组和 SC 组的水稻苗在含有 100mM、 200mM NaCl 的水培营养 液中生长 3 天、 6 天、 12 天的生长状态对比图 ； 0028 图 4 为实施例 3 的盆栽试验中土壤的处理示意图 ； 0029 图 5 为实施例 3 中 SE 组和 SC 组的水稻苗在含有 200mM、 250mM NaCl 的土壤中生 长 7 天、 14 天的生长状态对。

18、比图。 具体实施方式 0030 下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。 0031 实施例 1 菌株 KDZ-5 的分离纯化和鉴定 0032 1.1 菌株 KDZ-5 的分离纯化 0033 1.1.1 培养基配制 0034 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar， PDA) ： 马铃薯(去皮)200g、 葡萄糖 20g、 琼脂 20g， 加蒸馏水定容至 1000mL ； 然后进行常规的高温灭菌 (1.1 个大气压， 121下灭菌 20min)。 0035 水琼脂培养基 (water agar， WA) ： 琼脂 15g， 加自来水定容至 1000mL ； 。

19、然后进行 常规的高温灭菌 (1.1 个大气压， 121下灭菌 20min)。 0036 1.1.2 菌株分离纯化 0037 本发明的 KDZ-5 菌株是按下列分离培养条件在实验室中获得的， 包括 ： 0038 在我国新疆阿克苏地区盐碱地中采集的苦豆子植物样本， 将植物样本进行保鲜处 理后带回实验室中， 用自来水将植物样本冲洗干净， 去除表面的泥土及附属物 ； 在室温条件 说 明 书 CN 104293681 A 5 4/10 页 6 下晾干后置于超净台上， 用剪刀或者解剖刀截取合适大小 2-3cm 的小段， 根据下列步骤进 行表面消毒工作 ： 经 75乙醇漂洗 30s、 无菌水冲洗 3 次、 。

20、有效氯含量为 1次氯酸钠漂洗 5-8min、 无菌水冲洗3-5次 ； 将消毒后的组织材料用无菌的刀片取植物组织切成0.5cm长的 小段后纵切 ； 各处理小段分别置于含有硫酸链霉素 (100U/mL) 和氨苄青霉素 (100U/mL) 的 PDA平板上， 每皿6块， 3次重复， 于28恒温培养3-7d ； 分离的过程必须严格按照无菌操作 的要求， 分离的样品每天观察一次， 连续观察一周， 若发现有菌丝长出， 则及时用接种针或 者灭过菌的牙签小心的将菌丝边缘连同少量培养基一起挑出， 转接到新的 PDA 平板上， 纯 化 2-3 次直至为单一菌落。 0039 1.2 菌株 KDZ-5 的鉴定 004。

21、0 1.2.1 形态鉴定 0041 KDZ-5 经过分离纯化后， 接种到 PDA 培养基上， 22培养 7 天。用挑针挑取少量菌 体， 制成玻片， 在显微镜下观察， 其形态特征为 ： 该菌株在 PDA 平板上， 菌落生长迅速， 25 黑暗条件下培养 7 天， 菌落直径平均 5.2cm ； 初期菌落呈灰白色， 后期逐渐呈深灰色至棕褐 色， 菌落质地较硬 ( 图 1a 和图 1b) ； 菌丝具隔膜， 无色至黄褐色， 分生孢子器、 分生孢子未 见。 0042 1.2.2 分子鉴定 0043 1.2.2.1 真菌基因组 DNA 的小量提取 0044 提取方法包括 ： 0045 利用无菌牙签挑取内生真菌。

22、菌丝 10 20mg 置于 1.5mL 无菌离心管中， 加入 500L 提取缓冲液 (1M KCl， 100mM Tris-HCl， 10mM EDTA， pH 8.0)， 放入少许石英砂 ( 或 2 粒磁珠 )， 研磨仪研磨 1min( 至菌丝粉碎 ) ； 0046 12000rpm 离心 10min， 吸取上清至另一离心管中， 弃沉淀 ； 0047 加入等体积异丙醇， 轻轻颠倒混匀后室温静置 10min ； 0048 12000rpm 离心 10min， 弃上清， 将离心管倒置于吸水纸上干燥 ； 0049 干燥后加入 70酒精 800L， 12000rpm 离心 2min， 轻轻倒去上清液。

23、 ； 0050 在吸水纸上排干水分， 37干燥 15min， 使乙醇充分挥发 ； 0051 用 50L ddH2O 或 1TE buffer 重悬沉淀， DNA 样品可置于 4冰箱过夜。 0052 1.2.2.2 真菌 ITS rDNA 基因的 PCR 扩增 0053 PCR 扩增引物 ： 0054 ITS1 ： 5 -TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3 0055 ITS4 ： 5 -TCCTCCGCTTATTGATA TGC-3。 0056 PCR 反应体系 (50L) ： 0057 说 明 书 CN 104293681 A 6 5/10 页 7 0058 PCR 反应程序 ： 00。

24、59 0060 0061 1.2.2.3PCR 产物的回收纯化 ： 0062 PCR 反应结束后， PCR 产物经 1的琼脂糖凝胶电泳检测后， 采用爱思进生物技术 公司的 DNA 凝胶纯化试剂盒， 按照试剂盒说明书的步骤进行。 0063 步骤如下 ： 0064 将50L PCR产物全部加到1的琼脂糖凝胶的点样孔中， 按5V/CM的电泳条件 电泳 30min。 0065 电泳结束后， 在紫外灯下用刀片切取含目的 DNA 片段的凝胶， 置于 2mL 离心管 中， 称重。 0066 按照 1mg 凝胶加入 3mL 的 DE-A 缓冲液的标准， 加入 DE-A 缓冲液到收集凝胶的 2mL 离心管中， 。

25、75保温 10min， 期间振荡数次， 至完全融化。 0067 加入 0.5 倍 DE-A 体积的 DE-B 缓冲液， 混合均匀。 0068 将DNA制备管放入2mL离心管中， 将混合液转移到DNA制备管中， 12000rpm离心 1min， 弃上清。 0069 将 DNA 制备管放回 2mL 离心管中， 加 500L 缓冲液 W1， 12000rpm 离心 30s。 0070 将 DNA 制备管放回 2mL 离心管中， 加 700L 缓冲液 W2， 12000rpm 离心 30s。 0071 重复步骤一次。 0072 将 DNA 制备管放回 2mL 离心管中， 12000rpm 离心 2mi。

26、n。以排干膜上洗涤液 ； 0073 将 DNA 制备管放回 2mL 离心管中， 加 50L 的 ddH2O， 10000rpm 离心 1min， 洗脱 DNA 置 -20下保存。 0074 1.2.2.4 基因的测序和序列分析 0075 将经电泳检测后、 已经纯化回收的目的DNA片段送至上海生工用ABIPRISMA377型 说 明 书 CN 104293681 A 7 6/10 页 8 自动测序仪进行测序。测序结果经过严格核对后， 得到如 SEQ ID No.1 所示、 长度为 541bp 的 DNA 片段序列。 0076 在 NCBI 网站上， 将测得的核苷酸序列用 BLAST 在 GenB。

27、ank 数据库中查找和比对同 源或相似的核苷酸序列 ； 根据同源序列的数据库注释， 再结合菌株的形态结构来判断所研 究菌株的种属。 经过BLAST比对， 该序列与登录号为JQ936186.1的序列覆盖率100， 相似 度达到 100 ； 表明该序列来自 Phoma sp. 的 ITS rDNA。 0077 对 KDZ-5 菌株进行了如下保藏 ： 生物材料样品名称 ： 茎点霉属真菌 (Phoma sp.) KDZ-5 ； 保藏单位 ： 中国典型培养物保藏中心 ； 保藏地址 ： 中国武汉武汉大学 ； 保藏日期 ： 2014 年 4 月 25 日 ； 保藏编号为 ： CCTCC No.M 20141。

28、62。 0078 同时经过检索， 关于 Phoma sp. 真菌在提高植物耐盐性方面的应用并没有相关的 报道。 0079 实施例 2KDZ-5 提高水稻苗耐盐性效果的试验 0080 2.1 培养基配制 0081 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (potato dextrose agar， PDA) ： 同实施例 1。 0082 MS 培养基 ： 硝酸钾 1900mg/L， 硝酸铵 1650mg/L， 硫酸镁 370mg/L， 磷酸二氢钾 170mg/L， 氯化钙440mg/L， 硫酸锰22.3mg/L， 硫酸锌8.6mg/L， 硼酸6.2mg/L， 碘化钾0.83mg/ L， 钼酸钠 0.25mg/L。

29、， 硫酸铜 0.025mg/L， 氯化钴 0.025mg/L， 硫酸亚铁 27.8mg/L， Na2EDTA 37.3mg/L， 甘氨酸 2.0mg/L， 盐酸硫胺素 0.1mg/L， 盐酸吡哆醇 0.5mg/L， 烟酸 0.5mg/L， 肌醇 100mg/L， 30g 蔗糖， 琼脂粉 7g， H2O 定容至 1L ； pH 值 5.6-5.8。 0083 2.2 菌株 KDZ-5 的培养 0084 用无菌的牙签挑取菌株 KDZ-5 的菌丝块置于 PDA 培养基平板上， 封口膜封口后置 于恒温生化培养箱中， 25黑暗条件下培养一周。 0085 2.3 水稻种子的萌发 0086 将水稻种子脱壳后。

30、， 选取饱满无损伤的种子置于无菌的三角瓶中， 经无菌水冲洗 2 次， 依次用 70的酒精表面消毒 5min， 2 ( 活性氯的含量 ) 的次氯酸钠灭菌 10min， 无菌 水多次冲洗至种子不发黄为止 ； 表面消毒完成后， 将水稻种子置于 1/2MS 培养基平板上， 于 30、 黑暗条件下萌发 3-4 天， 备用。 0087 2.4 平皿上的共培养 0088 采用 1313cm 的一次性塑料方皿， 选取长势相同， 大小一致水稻幼苗用于共培 养。 0089 移入水稻幼苗前， 向每方皿中倒入大约75mL MS培养基， 冷却凝固后用预先灭菌的 载玻片切去 2/5( 由图 2 可见， 在宽度 2/5 处。

31、用灭菌的载玻片插入培养基中， 切断培养基， 然 后用这个载玻片将 2/5 的培养基挑出， 为水稻幼苗的生长留出空间 )， 留出空白供水稻茎叶 的生长 ； 培养基处理好后， 将水稻幼苗转移至 MS 培养基上， 使根部舒展， 每个方皿中放入 6 株水稻苗 ； 移入水稻苗后， 用灭菌的牙签挑取菌株 KDZ-5 的菌丝， 点在水稻苗根部下方附近 与水稻共培养 ； 0090 设以下四种处理组 ： 水稻苗在 MS 平板上的生长 (CC 组 ) ； 水稻苗与内生真菌 在 MS 平板上的共培养 (CE 组 ) ； 水稻苗在加盐 MS 平板上的生长 (SC 组 ) ； 水稻苗与内 生真菌在加盐 MS 平板上的共。

32、培养 (SE 组 )， 每种处理 3 个重复 ； 培养皿封口后置于光照培 说 明 书 CN 104293681 A 8 7/10 页 9 养箱中 (25、 16h 光照 80mm-2sec-1 与 22、 8h 黑暗 ) 竖立培养。 0091 共培养两周后观察水稻的生长状况， 并按照上述步骤重复进行 3 次共培养。试验 发现， KDZ-5 菌株在加盐 MS 平板上可以稳定促进水稻生长， 在株高上与对照有显著差异外， 水稻苗的茎秆也显著加粗， 叶片也相对较宽， 表现出更好地生长态势 ( 图 2)。 0092 对SC组和SE组水稻苗的株高、 根长、 鲜重、 干重等数据进行了统计， 统计结果见表 1。

33、。 0093 表 1 200mM NaCl 的盐胁迫下 SC 组和 SE 组水稻苗的生长指标比较 0094 生长指标SC 组SE 组 株高11.801.12a12.151.20a 根长4.780.80a4.661.00a 鲜重0.1810.025b0.2170.016a 干重0.01910.0026b0.03420.0035a 0095 注 ： 表中 SC 表示盐胁迫下未接种内生真菌的对照处理的小麦苗， SE 表示盐胁迫下 接种 KDZ-5 的处理的小麦苗。 0096 由表 1 可见， 在 200mM NaCl 的盐胁迫下， SE 组的水稻苗在鲜重和干重上比 SC 组 平均提高了 19.5、 。

34、78.9 ； 表明 KDZ-5 菌株可以显著提高水稻苗对盐胁迫的抵御能力。 0097 实施例 3KDZ-5 提高小麦苗耐盐性的水培试验 0098 3.1 培养基以及溶液配制 0099 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (potato dextrose agar， PDA) ： 同实施例 1。 0100 马铃薯葡萄糖液体培养基 (potato dextrose liquid， PBA) ： 不加琼脂的 PDA 培 养基。 0101 霍格兰德营养液 ： 四水硝酸钙 945mg/L、 硝酸钾 506mg/L、 硝酸铵 80mg/L、 磷酸二 氢钾 136mg/L、 硫酸镁 493mg/L、 铁盐溶液 2.5m。

35、L、 微量元素液 5mL， pH 6.0。 0102 铁盐溶液 ： 七水硫酸亚铁 2.78g、 乙二胺四乙酸二钠 3.73g、 蒸馏水 500mL， pH 5.5。 0103 微量元素液 ： 碘化钾 0.83mg/L、 硼酸 6.2mg/L、 硫酸锰 22.3mg/L、 硫酸锌 8.6mg/ L、 钼酸钠 0.25mg/L、 硫酸铜 0.025mg/L、 氯化钴 0.025mg/L。 0104 3.2 小麦苗的准备工作 0105 将经表面消毒(70乙醇1min， 3次氯酸钠7min)后小麦种子置于30温箱中催 芽， 种子露白后在育苗土中育苗， 待小麦苗平均高度 4-5cm 时转移到营养液中。 。

36、0106 3.3 内生真菌的准备工作 0107 将 KDZ-5 菌株接种到 PDB 液体培养基中， 于 25， 180rpm 摇床培养 3-5 天， 过滤去 除液体培养基后， 利用榨汁机将菌丝打碎， 用霍格兰德营养液稀释至 1g/L， 备用。 0108 3.4 小麦苗与内生真菌的共培养 ： 0109 将准备好的小麦苗转移到含有菌丝的霍格兰德营养液中进行共培养， 一周后进行 说 明 书 CN 104293681 A 9 8/10 页 10 加盐处理 ( 见表 2)， 每个处理 100mL 霍格兰德营养液 +30 株小麦苗， 5 个重复。 0110 表 2 0111 0112 在加盐后的 0 天、。

37、 3 天、 6 天、 12 天拍照记录小麦幼苗的生长状况， 共培养两周后统 计小麦苗的株高、 根长、 鲜重和干重等生长指标。 0113 水培小麦苗的盐胁迫实验结果表明， 在 100mM 盐浓度胁迫下， 小麦苗生长受阻现 象相对较弱， 盐胁迫 6 天后， SC 组和 SE 组的小麦苗均出现了叶尖黄化的现象 ； 盐胁迫 12 天 后， SC 组小麦苗出现萎焉症状， 而 SE 组的小麦苗基本未出现萎焉现象， 依旧表现出良好的 生长态势。 0114 而在 150mM 和 200mM 盐浓度胁迫 3 天时， SC 组小麦苗和 SE 组的小麦苗均出现了 生长滞缓的现象 ； 其中 SC 组小麦苗出现了萎焉症。

38、状， 约占总数 3/4 的小麦叶尖失绿黄化 ； SE 组的小麦苗并未出现萎焉现象， 只有极少数叶片出现了叶尖黄化现象。盐胁迫 6 天时， SC 组小麦苗都出现了叶片萎焉枯黄， 甚至死亡等现象 ； SE 组的小麦苗开始出现萎焉症状， 叶尖黄化， 但并未出现枯死的现象。盐胁迫第 12 天时， SC 组的小麦苗已全数枯死， SE 组的 小麦苗还有部分存活。说明内生真菌 KDZ-5 增强了小麦苗对盐胁迫的耐受能力。 0115 图 3 显示了 100mM 盐浓度和 200mM 盐浓度胁迫下小麦苗的生长情况。 0116 综合三种不同盐浓度的试验结果可知， 在盐胁迫下， SE 组的小麦苗出现失绿发黄、 萎焉。

39、干枯等盐害症状比 SC 组推迟， 症状较轻， 长势更旺盛。说明内生真菌 KDZ-5 可以提高 小麦苗对盐胁迫的抵御能力。 0117 在 100mM 盐浓度下胁迫 14 天后统计小麦苗的株高、 根长、 鲜重、 干重等生长指标， 统计结果见表 3。 0118 表 3 100mM NaCl 的盐胁迫下 SC 组和 SE 组水培小麦苗的生长指标比较 0119 生长指标SC 组SE 组 株高25.122.39b27.072.11a 根长10.831.75a10.592.12a 鲜重0.3540.089b0.4310.114a 干重0.05010.0102a0.05670.0134a 0120 0121 。

40、注 ： 表中 SC 表示盐胁迫下未接种内生真菌的对照处理的小麦苗， SE 表示盐胁迫下 接种 KDZ-5 的处理的小麦苗。 0122 由表 3 可见， 相对于 SC 组， SE 组的小麦苗在株高、 鲜重、 干重上都有显著增加， 分 别提高了 7.8、 21.6。13.0。说明内生真菌 KDZ-5 在水培条件下可以显著增强小麦苗 说 明 书 CN 104293681 A 10 9/10 页 11 的耐盐性。 0123 实施例 4KDZ-5 提高小麦苗耐盐性的盆栽试验 0124 4.1 培养基配制 0125 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (potato dextrose agar， PDA) ： 同实施。

41、例 1。 0126 马铃薯葡萄糖液体培养基 (potato dextrose liquid， PBA) ： 同实施例 3。 0127 4.2 内生真菌的准备 0128 方法同实施例 3， 但用无菌水稀释。 0129 4.3 土壤的准备 0130 将大田土、 育苗土、 珍珠岩按照 4 ： 4 ： 1 的比例混合均匀后， 在 165的烘箱中干热 灭菌 3h， 冷却备用。 0131 取冷却后的土壤， 用灭菌水、 NaCl 溶液或菌丝液 ( 菌量为 1g/kg) 拌土， 获得四个 处理组 ： 正常土壤 (CC 组 )、 加盐土壤 (SC 组 )、 加菌不加盐土壤 (CE 组 )、 加盐加菌土壤 (SE。

42、 组 )。 0132 4.4 小麦的播种 0133 由图 4 可见， 小麦播种时， 先在花盆中填装加 3cm 厚的加盐土壤， 然后填装上述四 个处理组的厚度为 3cm 的处理土壤， 再用无菌镊子将经催芽处理萌发后的小麦粒小心、 均 匀地置于土层上， 每盆 25 个小麦粒， 最后用育苗土覆盖， 育苗土的厚度大约 1cm ； 浇水湿润 后放在光照培养室中 (25、 16h 光照 80mm-2sec-1 与 22、 8h 黑暗交替 ) 培养两周。培 养期间， SC 组、 SE 组用相应的 NaCl 溶液浇灌四次， CC 组、 CE 组用自来水浇灌 ； 观察小麦在 一周和两周后的生长情况并拍照记录， 。

43、并统计共培养两周后小麦苗的株高、 根长、 鲜重和干 重 ( 见图 5、 表 4)。 0134 由图 5 可见， 用浓度 200mM 和 250mM 的 NaCl 溶液浇灌处理 7d 后， 四个处理组的小 麦苗的生长都受到了盐胁迫的抑制 ； 但 SE 组的小麦苗表现出了更强的长势， 在株高上明显 高于 SC 组的小麦苗， 叶片也更加舒展。盐胁迫处理处理 14d 后， 在 250mM 盐胁迫下， SE 组 的小麦苗的生长状况显著优于 SC 组的小麦苗。 0135 SE 组小麦苗的生长状况比 CC 组稍差， 虽然没有达到完全解除盐害的效果， 但明显 强于在盐害胁迫下小麦的长势。CE 组与 CC 组长。

44、势相似。 0136 表 4 不同浓度 NaCl 盐胁迫下 SC 组和 SE 组小麦苗的生长指标比较 0137 0138 注 ： 表中 SC 表示盐胁迫下未接种内生真菌的对照处理的小麦苗， SE 表示盐胁迫下 接种 KDZ-5 的处理的小麦苗。 0139 由表 4 可见， 在 200mM 盐胁迫下， SE 组的小麦苗在鲜重和干重上分别比 SC 组的小 说 明 书 CN 104293681 A 11 10/10 页 12 麦苗提高了 10.9和 12.5 ； 在 250mM 盐胁迫下， SE 组的小麦苗在株高、 鲜重和干重上分 别比SC组的小麦苗增加了51.4、 10.2、 18.5。 说明在盆栽环境下， 内生真菌KDZ-5可 以显著提高小麦苗对盐胁迫的耐受力。 说 明 书 CN 104293681 A 12 1/2 页 13 0001 序 列 表 CN 104293681 A 13 2/2 页 14 0002 序 列 表 CN 104293681 A 14 1/3 页 15 图 2 说 明 书 附 图 CN 104293681 A 15 2/3 页 16 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 104293681 A 16 3/3 页 17 图 5 说 明 书 附 图 CN 104293681 A 17 。