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一种黄色篮状菌孢子粉的制备方法、黄色篮状菌可湿性粉剂及其制备方法.pdf

  • 上传人：罗明
  • 文档编号：5255325
  • 上传时间：2018-12-30
  • 格式：PDF
  • 页数：15
  • 大小：2.43MB
    • 摘要
    申请专利号：

    CN201410449924.X

    		 申请日：

    2014.09.04
    公开号：

    CN104286032A

    		 公开日：

    2015.01.21
    当前法律状态：

    授权

    		 有效性：

    有权
    法律详情：

    授权|||实质审查的生效IPC(主分类):A01N 63/04申请日:20140904|||公开
    IPC分类号：

    A01N63/04; A01P3/00; C12N3/00; C12R1/645(2006.01)N

    		 主分类号：

    A01N63/04
    申请人：

    青岛农业大学
    发明人：

    咸洪泉; 张军霞; 李雅华
    地址：

    266000 山东省青岛市城阳区青岛农业大学生命科学学院生物楼B座325
    优先权：

    专利代理机构：

    北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙) 11350

    		 代理人：

    苏雪雪
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    内容摘要

    本发明涉及一种黄色篮状菌可湿性粉剂，它包括黄色篮状菌(Talaromyces flavus)分生孢子粉、载体和助剂，所述黄色篮状菌可湿性粉剂中的活菌含量为5×l08cfu/g～5×l09cfu/g，所述黄色篮状菌可湿性粉剂的悬浮率大于75％，润湿时间小于60秒，含水量小于6％。本发明优化了黄色篮状菌qw12菌株的孢子发酵工艺；以黄色篮状菌孢子为活性成分，创制出黄色篮状菌可湿性粉剂，提供了一种黄色篮状菌生防制剂的生产技术和方便实用的新剂型。该发明为黄色篮状菌可湿粉剂大规模商品化生产奠定了基础，有利于加速黄色篮状菌在生物防治中的推广应用进程，具有重要理论和实践意义。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  一种黄色篮状菌可湿性粉剂，其特征在于，它包括黄色篮状菌(Talaromyces flavus)分生孢子粉、载体和助剂，所述黄色篮状菌可湿性粉剂中的活菌含量为5×l08cfu/g～5×l09cfu/g，所述黄色篮状菌可湿性粉剂的悬浮率大于75％，润湿时间小于60秒，含水量小于6％。
    所述黄色篮状菌分生孢子粉在可湿性粉剂中的重量百分比为5～50％。所述载体选自硅藻土、皂土、高岭土中的一种或多种，载体在可湿性粉剂中的重量百分比为40％～93％；所述助剂包括润湿剂、分散剂和紫外保护剂；所述润湿剂选自木质素磺酸钠、吐温80中的一种，润湿剂在可湿性粉剂中的重量百分比为1％～5％；所述分散剂为聚乙二醇，分散剂在可湿性粉剂中的重量百分比为0.5％～2％；所述紫外保护剂选自糊精和甲基纤维素中的一种，紫外保护剂在可湿性粉剂中的重量百分比为0.5％～2％。

    2.  权利要求1所述的黄色篮状菌可湿性粉剂，其特征在于具体的制备方法如下：
    (1)按量称取可湿性粉剂中各组分；
    (2)将载体和固体助剂粉碎，过325目筛；
    (3)各种固体助剂按比例加入到硅藻土中混匀，然后加入润湿剂混匀，最后将干燥的黄色篮状菌分生孢子粉加入到混合物中混合均匀，即获得黄色篮状菌可湿性粉剂。

    3.  权利要求1或2所述的黄色篮状菌可湿性粉剂，其特征在于所述黄色篮状菌为黄色篮状菌qw12，其保藏号为CGMCC 5067。

    4.  权利要求3所述的黄色篮状菌可湿性粉剂，其特征在于，所 述黄色篮状菌(Talaromyces flavus)分生孢子粉中黄色篮状菌分生孢子含量为5×109～1.42×1011个/g，含水量小于12％，活孢率大于90％。
    所述的黄色篮状菌分生孢子粉为黄色蓝状菌的固体发酵结束后，固体培养物干燥、粉碎后过200目筛；或用真菌孢子分离器分离收集的黄色篮状菌分生孢子粉。

    5.  一种利用黄色篮状菌qw12制备分生孢子粉的发酵培养方法，其特征在于培养基中固体基质/水＝10/4～10/10，碳源为基质的0.5％～4％，硫酸铵为基质的0.1％～4％，无机盐为基质的0.5‰～5‰。
    所述的固体基质为麸皮和玉米秸秆粉，其中麸皮在固体基质中的重量百分比为20％～100％；所述的碳源选自葡萄糖、麦芽糖中的一种或两种；所述的无机盐选自MgSO4、ZnSO4、FeSO4、CuSO4中的一种或两种的组合。
    发酵条件为黄色篮状菌qw12种子的接种量为3％-22％，每天12h～24h光照，25～30℃，发酵时间为5～13d，
    发酵结束后，将固体培养物干燥、粉碎后过200目筛；或用真菌孢子分离器分离收集的黄色篮状菌分生孢子粉。

    6.  根据权利要求5所述的利用黄色篮状菌qw12制备分生孢子粉的发酵培养方法，其特征在于所述黄色篮状菌种子为浓度1×106个/mL～1×108个/mL的黄色篮状菌孢子悬浮液或1×106cfu/mL～1×109cfu/mL的黄色篮状菌培养液。

    说明书

    说明书一种黄色篮状菌孢子粉的制备方法、黄色篮状菌可湿性粉剂及其制备方法
    技术领域
    本发明涉及微生物农药技术领域，特别涉及一种微生物农药可湿性粉剂及其制备方法，更具体地说，本发明涉及一种黄色篮状菌孢子粉发酵及制备方法，以及该黄色篮状菌可湿性粉剂及其制备方法。
    背景技术
    农药在防治植物病虫害，保证农业稳产和增产、提高农产品的质量、改善人民的生活水平起着重要的作用。化学农药在控制农作物病害和保护农业安全方面发挥了重要的作用，但也导致了一系列环境和社会问题，如广泛应用化学农药出现的“3R”问题等等，严重影响了现代农业的可持续发展。
    微生物农药是用生物活体或者代谢产物制成的能够防治作物病、虫和杂草的制剂，防治的对象不容易产生抗药性，选择性强、对人畜及天敌较安全，繁殖较快，可以利用农副产品、工农业废水以及废弃物等来广泛生产，是生产无公害食品的首选药剂。目前，已开发成为产品、投入实际使用的杀虫细菌主要有4种，即球形芽孢杆菌、日本金龟子芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和缓病芽孢杆菌；已经记载的杀虫真菌有100个多个属、800多个种，研究最多的是白僵菌和绿僵菌。木霉菌(Trihoderma)对植物病原真菌有很好的抑制作用，是研究最多的真菌杀菌剂，已开发为木霉菌农药制剂。
    为了便于微生物农药的保存、运输和使用，提高药效，需将其制成一定的剂型的制剂。微生物农药加工比化学农药困难，首先微生物农药的有效成分一般是活的生物体，其疏水性直接影响到制剂的分散性、悬浮性和润湿性等物理性能；其次微生物与各类助剂的生物相容性一般都比较差；另外生物体对湿度、温度和 光照等环境比较敏感，制剂贮存稳定性差，需要添加保护剂等助剂。
    微生物农药的剂型包含了可湿性粉剂、颗粒剂、悬浮剂、微粒剂等。可湿性粉剂(Wettable Powders，WP)具备使用、贮存及运输方便，不添加有机溶剂和加工操作相对容易等特点，是人们在制剂开发中的首选剂型。可湿性粉剂由原药、载体和表面活性剂等助剂组成，助剂对农药制剂具有重要影响，直接影响到农药药效。尤其在真菌孢子制剂中对助剂具有更高的要求，除了要求助剂的性能优良外，还必须不能影响真菌孢子的萌发和菌丝的生长，因此筛选与真菌具有优良生物学相容性的助剂对菌剂的研制尤为重要，针对特定菌株筛选适宜的助剂是真菌可湿性粉剂生产的关键。
    黄色篮状菌(Talaromyces flavus)对核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)等多种病原菌产生的菌核有重寄生作用，此外对大丽轮枝菌(Verticillum dahliae)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)等有明显的抑制作用。该菌生防机制多样，主要包括重寄生作用、竞争作用、溶菌作用等；其中重寄生作用是黄色篮状菌是最重要的作用机制，在与寄主真菌互作中，可以被诱导产生几丁质酶、纤维素酶、β-1,3-葡聚糖酶等多种葡萄糖氧化酶和水解酶。黄色篮状菌生长温度和pH的范围广泛，可在我国南、北方不同的生态条件下生存和繁殖，对菌核病及黄萎病等重要植物真菌病害有明显防治作用，是一种重要的生防因子，具有良好的生防应用前景和研究价值。
    黄色篮状菌(Talaromyces flavus)作为重要的生防菌之一，目前国内尚无该菌相应的制剂开发研究，极大地制约了黄色篮状菌在生物防治中的使用和推广。我们从土壤中分离筛选到一株黄色篮状菌qw12(保藏编号是：CGMCC 5067， 特征基因GenBank登陆号：JN602366)，它对杨树腐烂菌、立枯丝核菌和玉米纹枯病菌等植物病原真菌具有很强的抑制作用。
    发明内容
    针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种黄色篮状菌分生孢子粉发酵及制备方法，以及该黄色篮状菌可湿性粉剂及其制备方法。
    本发明的技术方案如下：
    一种黄色篮状菌可湿性粉剂，它包括黄色篮状菌(Talaromyces flavus)分生孢子粉、载体和助剂，所述黄色篮状菌可湿性粉剂中的活菌含量为5×l08cfu/g～5×l09cfu/g，所述黄色篮状菌可湿性粉剂的悬浮率大于75％，润湿时间小于60秒，含水量小于6％。
    所述黄色篮状菌分生孢子粉在可湿性粉剂中的重量百分比为5-50％。所述载体选自硅藻土、皂土、高岭土中的一种或多种，载体在可湿性粉剂中的重量百分比为40％～93％；所述助剂包括润湿剂、分散剂和紫外保护剂；所述润湿剂选自木质素磺酸钠、吐温80中的一种，润湿剂在可湿性粉剂中的重量百分比为1％～5％；所述分散剂为聚乙二醇，分散剂在可湿性粉剂中的重量百分比为0.5％～2％；所述紫外保护剂选自糊精和甲基纤维素的一种，紫外保护剂在可湿性粉剂中的重量百分比为0.5％～2％。
    如上所述的黄色篮状菌可湿性粉剂，具体的制备方法如下：
    (1)按量称取可湿性粉剂中各组分；
    (2)将载体先用粉碎机粉碎，过325目筛；
    (3)按比例依次将载体、润湿剂、分散剂、紫外保护剂和黄色篮状菌分生孢子粉充分混合均匀，即获得黄色篮状菌可湿性粉剂。
    在上述方案的基础上，所述黄色篮状菌为黄色篮状菌qw12。
    在上述方案的基础上，所述黄色篮状菌(Talaromyces flavus)分生孢子粉中黄色篮状菌分生孢子含量为5×109～1.42×1011个/g，含水量小于12％，活孢率大于90％。
    所述的黄色篮状菌分生孢子粉为黄色蓝状菌的固体发酵结束后，固体培养物干燥、粉碎后过200目筛；或用真菌孢子分离器分离收集的黄色篮状菌分生孢子粉。
    一种利用黄色篮状菌qw12制备分生孢子粉的发酵培养方法，培养基中固体基质/水＝10/4～10/10，碳源为基质的0.5％～4％，硫酸铵为基质的0.1％～4％，无机盐为基质的0.5‰～5‰。
    所述的固体基质为麸皮和玉米秸秆粉，其中麸皮在固体基质中的重量百分比为20％～100％；所述的碳源选自葡萄糖、麦芽糖中的一种或两种；所述的无机盐选自MgSO4、ZnSO4、FeSO4、CuSO4中的一种或两种的组合。
    发酵条件为黄色篮状菌qw12种子的接种量为3％～22％，每天12h～24h光照，25～30℃，发酵时间为5～13d，
    发酵结束后，将固体培养物干燥、粉碎后过200目筛；或用真菌孢子分离器分离收集的黄色篮状菌分生孢子粉。
    在上述方案的基础上，所述黄色篮状菌种子为浓度1×106个/mL～1×108个/mL的黄色篮状菌孢子悬浮液或1×106cfu/mL～1×109cfu/mL的黄色篮状菌培养液。
    本发明优化了黄色篮状菌qw12菌株的孢子发酵工艺；以黄色篮状菌孢子为活性成分，创制出黄色篮状菌可湿性粉剂，提供了一种黄色篮状菌生防制剂的生产技术和方便实用的新剂型。该发明为黄色篮状菌可湿粉剂大规模商品化生产奠定了基础，有利于加速黄色篮状菌在生物防治中的推广应用进程，具有重要理论和实践意义。
    具体实施方式
    实施例1
    黄色篮状菌qw12固体发酵条件
    1、固体发酵基质确定
    分别设置3种单一物质的培养基：麸皮、玉米秸秆粉、玉米粉；4种混合物质的培养基：麸皮+玉米秸秆粉、麸皮+玉米粉、玉米秸秆粉+玉米粉、麸皮+玉米秸秆粉+玉米粉，混合物质培养基中的不同成分等比例混合。料水比＝1:1，121℃灭菌30min，接种1×106个/mL的孢子悬浮液，接种量5％；28℃培养7d，每天翻曲1次。每个处理设三个重复。发酵结束后取0.5g固体发酵培养物，加入无菌水，在磁力搅拌器上搅拌5min，用血球计数板在显微镜下统计孢子的数目。结果表明：培养基为单一基质时，麸皮效果最好，产孢量达到5.66×109个/g；混合基质中，麸皮与秸秆粉组合效果最佳，产孢量达到6.10×109个/g(表1)；进一步研究发现(表2)，麸皮与秸秆粉按4:1配比效果最好，产孢量可达7.80×109个/g。
    表1 不同的固体培养基对产孢量的影响

    表2 麸皮与玉米秸秆的不同配比培养基对产孢量影响

    2、料水比对产孢量的影响
    在固体发酵基础培养基中分别设料水比为10:3、10:4、10:5、10:6、10:7、10:8、10:9、10:10进行试验，每个处理设3次重复，计数孢子数并计算平均产孢量。试验结果表明(如表3)，以料水比为5:4的处理产孢量最高。
    表3 料水比对产孢量的影响

    3、矿质元素对产孢的促进作用
    在固体发酵基础培养基中分别添加固体基质1‰的矿质元素MgSO4、ZnSO4、FeSO4、CuSO4、CaSO4、K2SO4，设不添加矿质元素作为对照，每种处理重复3次，显微镜下计算平均产孢量。结果如表4所示，添加的不同矿质元素对黄色篮状菌qw12的产孢量的影响有所不同，添加Cu元素对该菌产孢的促进作用最显著，产孢量最高；并且在培养基中添加3‰CuSO4为最佳(表5)。
    表4 不同产孢促进剂对产孢量的影响

    表5 CuSO4浓度对产孢量的影响

    4补加碳源对产孢量的影响
    在固体基础培养基中按固体基质质量的1％添加外加碳源蔗糖、葡萄糖、麦芽糖3种碳源；对照为不外加碳源的固体基础培养基。与对照相比，外加碳源菌株的产孢量有所增加，添加葡萄糖的培养基的产孢量最高，其次是麦芽糖，如表6所示。
    在保持发酵条件不变的情况下，分别按固体基质质量的0.5％、1％、2％、3％、4％添加葡萄糖，如表7所示，不同浓度的葡萄糖对黄色篮状菌qw12产孢量影响 不同，随着葡萄糖添加量的增加黄色篮状菌的产孢量依次升高，而添加量超过3％时产孢量降低，故以添加3％葡萄糖的效果最佳。
    表6 不同碳源对产孢量的影响

    表7 葡萄糖浓度对产孢量的影响

    5、外加氮源对产孢量的影响
    在固体基础培养基按固体基质质量的1％添加无机氮源(硝酸铵、硫酸铵、尿素)及有机氮源(酵母膏、蛋白胨、豆饼粉)，对照为不外加氮源的固体基础培养基，并保持其它发酵条件不变。六种外加氮源中以添加硫酸铵的培养基的产孢量最高，其它处理的产孢量比对照菌株的产孢量低，如表8所示。在保持发酵条件不变的情况下，在培养基中分别按固体基质质量的0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％添加硫酸铵，如表9所示，不同浓度的硫酸铵对黄色篮状菌qw12产孢量影响不同，随着硫酸铵添加量的增加黄色篮状菌的产孢量依次升高，而添加量超过3％时产孢量降低，故以添加3％硫酸铵的效果最佳。
    表8 不同氮源对产孢量的影响

    表9 硫酸铵浓度对产孢量的影响

    6、接种量对产孢量的影响
    分别按3％、5％、10％、14％、18％、22％接种量进行接种，试验结果表明，固体发酵基础培养基中接种量为18％时最为理想，如表10所示。
    表10 接种量对产孢量影响

    7、光照条件对产孢量的影响
    将接种后的固体发酵基础培养基分别置于光照条件为24h光照、12h黑暗和12小时光照、24h黑暗条件下培养，显微镜下计数孢子数并计算平均的产孢量。其中24h光照可以显著提高黄色篮状菌qw12的产孢量，如表11所示。
    表11 光照对产孢量影响

    8、培养基正交试验筛选
    选择麸皮与玉米秸秆粉比例、料水比、硫酸铵和接种量做4因素3水平(L9(34))的正交试验(表12)，优化产孢培养条件。
    表12 正交因素试验水平设计

    在所选取的水平范围内，因素A、B、C、D对产孢量影响大小依次为：D﹥B﹥A﹥C，最优组合为A3B2C1D3(表13)，经过进一步试验筛选及验证得到最佳配方为麸皮比例为100％，料水比为10:7，接种量为14％，硫酸铵浓度为3％，最终孢子量达到8.39×1010个/g。
    表13 (L9(34))正交设计及结果

    9、黄色篮状菌固体发酵时间确定
    采用正交优化后的发酵培养基发酵培养黄色篮状菌，每天观察菌的生长状 况，并检测产孢量，来确定最佳发酵时间。果如表14所示，第10天黄色篮状菌的产孢量最大。
    表14 产孢量随时间的变化情况

    实施例2：黄色篮状菌孢子粉的制备
    优化的黄色篮状菌产孢培养基在121℃下灭菌20-30min接种106个/mL的孢子悬浮液，28℃黑暗培养10d。待发酵结束后，将固体培养基在35℃烘箱中烘干水分，固体培养物干燥、粉碎后过200目筛；或用真菌孢子分离器分离孢子，过200目筛；收集的黄色篮状菌分生孢子粉。
    称取0.05g黄色篮状菌孢子粉悬于20mL无菌水中，用磁力搅拌器搅拌30min后，用血球计数板来测定孢子悬液浓度，计算黄色篮状菌分生孢子粉的含孢量。3次重复，计算孢子粉平均的含孢量。
    称取1g黄色篮状菌孢子粉于100℃烘2h后，使其自然冷却，再次将黄色篮状菌孢子粉称重，重复3次，计算含水量平均值。
    活孢率测定：将孢子粉用无菌水配制成浓度为106个/ml的悬浮液，吸取1mL该悬液接入9mL萌发液中，置于28℃摇床，120r/min振荡培养24h后，稀释培养液(每个视野100个分生孢子左右)，在显微镜下用血球计数板记录培养液中萌发与未萌发的孢子数，重复取样3次，计算孢子的平均萌发率，即为活孢率。孢子萌发标准为芽管长度大于或等于孢子直径的1/2。孢子萌发液配方为1％胰蛋白胨，2％葡萄糖，无菌水1000mL，105～115℃灭菌15min。
    结果表明，固体培养物干燥、粉碎后过200目筛，黄色篮状菌孢子粉含孢量 为5×109～1.2×1010个/g，含水量为10％，活孢率为92.3％；用真菌孢子分离器分离孢子、过200目筛，收集的黄色篮状菌分生孢子粉含孢量为9.8×109～1.0×1011个/g，含水量为9.7％，活孢率为95.31％，可用于后续可湿性粉剂的加工。
    实施例3：助剂的筛选
    1载体的筛选
    载体对黄色篮状菌孢子萌发的影响：高岭土、滑石粉、皂土、硅藻土按照5mg/mL、10mg/mL的浓度比例与PDA培养基混合后灭菌，并在无菌条件下制成平板。取1.0×103个/ml的黄色篮状菌qw12孢子悬浮液0.1mL于含有不同载体的平板上涂布，无载体的PDA培养基为对照，每个处理设置4次重复，28℃下培养，48h后观察并计数在含有不同载体的平板上孢子萌发所形成的菌落数。
    载体对黄色篮状菌菌丝生长的影响：将直径0.5cm黄色篮状菌qw12菌块置于上述方法制作的含不同载体的平板的中心，以无载体的PDA培养基为对照，每个处理4次重复，28℃下培养，72h后用十字交叉法测量菌落直径，计算菌落的日均生长速率。
    菌落生长速率＝(最终菌落直径－起初菌落直径)/菌落生长天数
    结果表明：不同载体对黄色篮状菌日均生长速率和孢子萌发影响存在差异(表15，表16)，硅藻土、皂土、高岭土可作为黄色篮状菌可湿性粉剂的载体，其中硅藻土更优。
    表15 载体对黄色篮状菌菌丝生长的影响

    表16 载体对黄色篮状菌孢子萌发的影响

    注：孢子萌发形成的菌落数cfu值由平均值±标准误差(SE)表示。同一助剂不同质量浓度对黄色篮状菌孢子萌发形成菌落的差异用大写字母表示，大写字母不同表示差异显著(P≤0.05)。同一质量浓度不同助剂对黄色篮状菌孢子萌发形成单孢菌落数的差异用小写字母表示，小字母不同表示差异显著(P≤0.05)，下同。
    2、润湿剂的筛选
    润湿剂十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、木质素磺酸钠和吐温80分别按照500μg/mL、1000μg/mL、2000μg/mL的浓度比例与PDA培养基混合后灭菌，制成平板。涂布接种黄色篮状菌qw12的孢子悬浮液，以无润湿剂的PDA培养基为对照，每个处理设置4次重复，28℃下培养，48h后观察并计数在含不同润 湿剂的平板上孢子萌发所形成的菌落数，测定润湿剂的生物相容性。菌丝生长率的测定方法同载体菌丝测定。润湿时间按照GB/T5451-2001来测定。
    以生物相容性和润湿时间为判别指标，木质素磺酸钠、吐温80可作为黄色篮状菌可湿性粉剂的润湿剂；其中吐温80更优，可促进菌丝生长、对孢子萌发影响最小、润湿时间最短(表17-19)。
    表17 润湿剂对黄色篮状菌菌丝生长的影响

    表18 润湿剂对黄色篮状菌孢子萌发的影响

    表19 润湿时间测定结果

    3、分散剂的筛选
    分散剂聚乙烯醇、聚乙二醇分别按照500μg/mL、1000μg/mL、2000μg/mL的浓度比例与PDA培养基混合后灭菌，制成平板。生物相容性测定方法同润湿剂。
    分散力的测定：将上述分散剂配制成500μg/mL、1000μg/mL、2000μg/mL浓度的母液，制备黄色篮状菌qw12孢子悬浮液，使其浓度为l07个/ml，取10mL该悬液加入到90mL母液中，充分摇匀，待0h、1h、4h后从悬浮液的上、中、下层分别取样，在显微镜下用血球计数板来计数，以未加入分散剂溶液作为对照。并按照下列公式来计算分散指数(I)：
    I=σ2/a‾]]>
    —样本平均数；σ—标准差
    I＝1，孢子随机分布；I>1，孢子聚集分布，当I<1，孢子均匀分布。
    以生物相容性和分散力为判别指标，聚乙二醇可促进菌丝生长、对孢子萌发影响最小、分散能力较强、相对较稳定，确定润湿剂为聚乙二醇。
    表20 不同分散剂对黄色篮状菌菌丝生长的影响

    表21 不同分散剂对黄色篮状菌孢子萌发的影响

    表22 分散剂对黄色篮状菌孢子的分散性能

    4、紫外保护剂的筛选
    紫外保护剂糊精、腐植酸、甲基纤维素、黄原胶、海藻糖分别按照500μg/mL、1000μg/mL、2000μg/mL的浓度比例与PDA培养基混合后灭菌，制成平板。生物相容性测定方法同润湿剂。
    保护剂保护效能的测定：配置黄色篮状菌qw12的孢子悬浮液，浓度为1.0×103个/ml，将该悬液涂布于含紫外保护剂的PDA平板上，在30W、光强为120lx的紫外灯下20cm处开盖照射平板30s后，28℃下黑暗培养该处理的平板，48h后观察并计数孢子萌发所形成的菌落数。筛选出保护效能最佳的紫外保护剂，再设置不同的浓度梯度，通过孢子萌发的方法，来确定最合适的比例。以进行紫外照射但不加入保护剂平板为对照1(用来计算残存活孢率)，以不进行紫外照射也不加保护剂平板为对照2(用来计算理论活孢率)，每个处理设置4次重复，并按照下列公式来计算保护效能指数：
    保护效能指数＝(照射后活孢率-残存活孢率)/(理论活孢率-残存活孢率)
    在3种浓度的甲基纤维素培养基中，黄色篮状菌qw12的菌丝生长速度较快，2000μg/mL时已经达到(1.003±0.017)cm/d。糊精和海藻糖也能促进黄色篮状菌qw12菌丝生长，与对照比较差异不显著，黄原胶和腐植酸对菌丝生长有显著的抑制作用。黄色篮状菌qw12的孢子在含五种紫外保护剂培养基上都能较好萌发，在含黄原胶、糊精、甲基纤维素、腐植酸培养基上，孢子的萌发率随着浓度的增大而增大，在含500μg/mL的甲基纤维素培养基上孢子的萌发率最高。黄原胶、糊精、海藻糖、甲基纤维素与对照差异不显著，有较好的相容性。5种紫外保护剂对黄色篮状菌qw12分生孢子保护效能指数间存在差异。糊精和甲基纤维素的保护效能较好，最高达到0.3(表23)。
    表23 不同紫外保护剂的保护效能

    实施例4：黄色篮状菌可湿性粉剂的质量检测
    1，黄色篮状菌可湿性粉剂的制备：孢子粉5％、10％、30％、50％，润湿剂吐温80为3％，分散剂聚乙二醇1％，紫外保护剂甲基纤维素1％，载体硅藻土补足100％；将载体和固体助剂先粉碎，过325目筛；各种固体助剂按比例加入到硅藻土中混匀，然后加入润湿剂混匀，最后将干燥的黄色篮状菌分生孢子粉加入到混合物中混合均匀，即获得黄色篮状菌可湿性粉剂。
    2，质量检测
    含孢量测定：同实施例2。
    含水量的测定：将试验用的器皿在120℃烘箱烘15min后称重，称取5g黄色篮状菌可湿性粉剂于120℃烘2h后，使其自然冷却，再将黄色篮状菌孢子粉和烘干的器皿称重，重复3次，计算含水量平均值。含水量(％)＝[(5－烘干后的质量)/5]×100
    润湿时间测定参照GB/T5451-2001来测定完全润湿的时间。
    悬浮率测定参照GB/T14825-2006来测定孢子悬浮率。
    pH测定：称取2g可湿性粉剂溶于100mL蒸馏水中，用磁力搅拌器迅速搅拌1min，然后再静置1min，用pH计来测定样品的pH值，每个样品重复3次，每次结果相差绝对值小于0.1，并计算平均值。
    黄色篮状菌可湿性粉剂中活孢子含量为8.4×108cfu/g～9×109cfu/g，含水量为0.96％～4.89％，润湿时间为17s～23s，悬浮率为81.73％～86.46％，pH值为7.27～7.49，以上指标符合国家的相关标准(表24)。
    表24 黄色篮状菌可湿性粉剂的各项指标测定

    以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照 前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

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