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1、(10)申请公布号 CN 104263695 A (43)申请公布日 2015.01.07 CN 104263695 A (21)申请号 201410463239.2 (22)申请日 2014.09.12 C12N 5/04(2006.01) C12N 5/02(2006.01) (71)申请人 南京通泽农业科技有限公司 地址 210046 江苏省南京市栖霞区尧化街道 甘家边 108 号 1 幢 701 室 (72)发明人 杨存 (54) 发明名称 一种剑叶耳草愈伤组织和悬浮细胞的快速繁 殖方法 (57) 摘要 本发明研究了一种剑叶耳草愈伤组织和悬浮 细胞的快速繁殖方法， 包括无菌叶片的获得、。
2、 愈伤 组织的诱导、 悬浮细胞的培养和增殖等步骤。 本发 明方法可以大规模培养剑叶耳草细胞， 生产次生 代谢物， 克服化学方法合成不经济、 受自然条件和 人为条件影响等缺点， 操作简单， 试验重复性好， 增殖率高。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书2页 (10)申请公布号 CN 104263695 A CN 104263695 A 1/1 页 2 1. 一种剑叶耳草愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法， 包括无菌叶片的获得、 愈伤组 织的诱导、 悬浮细胞的培养和增殖等， 主要步骤如下 ： 。
3、（1） 取剑叶耳草的幼嫩叶片， 按照常规的消毒方法对其进行消毒处理 ； （2）将步骤 （1）灭菌处理过的剑叶耳草叶片接入培养基配方为 MS+IBA0.5mg/ L+6-BA4mg/l+活性炭0.1%培养基中进行愈伤组织诱导培养， 附加蔗糖30g/L， 琼脂6.5g/L， PH5-6， 暗室培养， 温度 20 ； （3） 取步骤 （2） 诱导出来的分散性好的愈伤组织放入液体培养基 B5+NAA0.1-0.2mg/ L+KT0.2-0.4mg/L+ 酪蛋白水解氨基酸 0.5g/L+ 叶酸中进行振荡培养， 附加蔗糖 30g/L， 每 200ml 三角瓶接种 50ml 液体悬浮细胞， PH5.85， 。
4、光照 1000lx， 温度 20 ； （4） 取步骤 （3） 悬浮培养出来的稳定细胞， 放入附加了 3-5mg/L 硝酸镧的上述液体培养 基中进行培养， 20 天后称重， 检测次生代谢物含量。 2. 按照权利要求 1 所述的一种剑叶耳草愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法， 其特征 在于 ： 步骤 （1） 中所述剑叶耳草无菌叶片的获得为 ： 取剑叶耳草的叶片， 先在漂白粉中浸泡 3min， 毛刷去除表面污渍， 流水冲洗 30min， 超净工作台上次氯酸钠处理 11min， 无菌水冲洗 5-7 遍。 3. 按照权利要求 1 所述的一种剑叶耳草愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法， 其特 征在于 ： 步骤。
5、 （2） 中所述愈伤组织的诱导， 在培养基中附加活性炭， 既可促进愈伤组织的生 长， 又可防止愈伤组织的褐化。 4. 按照权利要求 1 所述的一种剑叶耳草愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法， 其特征 在于 ： 步骤 （3） 中加入了酪蛋白水解氨基酸 0.5g/L 和叶酸进行悬浮细胞培养， 有助于悬浮 细胞的生长。 5. 按照权利要求 1 所述的一种剑叶耳草愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法， 其特 征在于 ： 步骤 （4） 加入了硝酸镧， 稀土可以促进细胞的生长， 还可以调节次生代谢物质的合 成。 权 利 要 求 书 CN 104263695 A 2 1/2 页 3 一种剑叶耳草愈伤组织和悬浮细胞。
6、的快速繁殖方法 技术领域 0001 本发明涉及组培条件下剑叶耳草悬浮细胞的培养， 属于植物技术领域。 背景技术 0002 剑叶耳草， Hedyotis caudatifolia Merr.et Metcalf， 茜草科， 灌木， 别名 ： 长尾 耳草、 少年红、 千年茶、 痨病草等， 产于广东、 广西、 福建、 江西、 浙江 （南部） 、 湖南等省区 ； 常 见于丛林下比较干旱的砂质土壤上或见于悬崖石壁上， 有时亦见于粘质土壤的草地上。剑 叶耳草是一种药用植物， 全草 ： 味甘、 性平。有止咳、 消积、 止血功能。用于支气管炎哮喘、 痨 病， 咯血， 小儿疳积。鲜叶 ： 捣烂外敷跌打肿痛， 外。
7、伤出血。叶 ： 煎水洗治结膜炎。目前剑叶 耳草的利用， 主要靠自然繁殖， 关于其繁殖引种技术尚无研究。 发明内容 0003 本发明所要解决的技术问题是提供剑叶耳草细胞悬浮培养的快速繁殖方法， 可以 大规模培养剑叶耳草细胞， 生产次生代谢物， 克服化学方法合成不经济， 受自然条件和人为 条件影响等缺点， 操作简单， 试验重复性好， 增殖率高。 0004 为解决上述技术问题， 本发明采用下列技术方案 ： 取剑叶耳草的叶片， 先在漂白粉中浸泡 3min， 毛刷去除表面污渍， 流水冲洗 30min， 超 净工作台上次氯酸钠处理 11min， 无菌水冲洗 5-7 遍， 灭菌处理过的剑叶耳草叶片接入培养 。
8、基配方为 MS+IBA0.5mg/L+6-BA4mg/l+ 活性炭 0.1% 培养基中进行愈伤组织诱导培养， 附加 蔗糖 30g/L， 琼脂 6.5g/L， PH5-6， 暗室培养， 温度 20， 诱导出来的分散性好的愈伤组织放 入液体培养基 B5+NAA0.2mg/L+KT0.3mg/L+ 酪蛋白水解氨基酸 0.5g/L+ 叶酸中进行振荡培 养， 附加蔗糖 30g/L， 每 200ml 三角瓶接种 50ml 液体悬浮细胞， PH5.85， 光照 1000lx， 温度 20， 悬浮培养出来的稳定细胞， 放入附加了 4mg/L 硝酸镧的上述液体培养基中进行培养， 20 天后称重， 检测次生代谢物。
9、含量。 0005 采用本发明制备的剑叶耳草悬浮细胞， 增殖率高， 操作简单， 能耗少， 可筛选出次 生代谢物含量高的细胞株。 0006 下面将结合具体实施方式对本发明作进一步阐述， 但本发明要求保护的范围并不 局限于下列实施方式。 具体实施方式 0007 实施例 1 取剑叶耳草的叶片， 先在漂白粉中浸泡 3min， 毛刷去除表面污渍， 流水冲洗 30min， 超 净工作台上次氯酸钠处理 11min， 无菌水冲洗 5-7 遍， 灭菌处理过的剑叶耳草叶片接入培养 基配方为 MS+IBA0.5mg/L+6-BA4mg/l+ 活性炭 0.1% 培养基中进行愈伤组织诱导培养， 附加 蔗糖 30g/L， 。
10、琼脂 6.5g/L， PH5-6， 暗室培养， 温度 20， 诱导出来的分散性好的愈伤组织放 入液体培养基 B5+NAA0.1mg/L+KT0.2mg/L+ 酪蛋白水解氨基酸 0.5g/L+ 叶酸中进行振荡培 说 明 书 CN 104263695 A 3 2/2 页 4 养， 附加蔗糖 30g/L， 每 200ml 三角瓶接种 50ml 液体悬浮细胞， PH5.85， 光照 1000lx， 温度 20， 悬浮培养出来的稳定细胞， 放入附加了 3mg/L 硝酸镧的上述液体培养基中进行培养， 20 天后称重， 检测次生代谢物含量。 0008 实施例 2 取剑叶耳草的叶片， 先在漂白粉中浸泡 3mi。
11、n， 毛刷去除表面污渍， 流水冲洗 30min， 超 净工作台上次氯酸钠处理 11min， 无菌水冲洗 5-7 遍， 灭菌处理过的剑叶耳草叶片接入培养 基配方为 MS+IBA0.5mg/L+6-BA4mg/l+ 活性炭 0.1% 培养基中进行愈伤组织诱导培养， 附加 蔗糖 30g/L， 琼脂 6.5g/L， PH5-6， 暗室培养， 温度 20， 诱导出来的分散性好的愈伤组织放 入液体培养基 B5+NAA0.2mg/L+KT0.4mg/L+ 酪蛋白水解氨基酸 0.5g/L+ 叶酸中进行振荡培 养， 附加蔗糖 30g/L， 每 200ml 三角瓶接种 50ml 液体悬浮细胞， PH5.85， 光。
12、照 1000lx， 温度 20， 悬浮培养出来的稳定细胞， 放入附加了 5mg/L 硝酸镧的上述液体培养基中进行培养， 20 天后称重， 检测次生代谢物含量。 0009 实施例 3 取剑叶耳草的叶片， 先在漂白粉中浸泡 3min， 毛刷去除表面污渍， 流水冲洗 30min， 超 净工作台上次氯酸钠处理 11min， 无菌水冲洗 5-7 遍， 灭菌处理过的剑叶耳草叶片接入培养 基配方为 MS+IBA0.5mg/L+6-BA4mg/l+ 活性炭 0.1% 培养基中进行愈伤组织诱导培养， 附加 蔗糖 30g/L， 琼脂 6.5g/L， PH5-6， 暗室培养， 温度 20， 诱导出来的分散性好的愈伤。
13、组织放 入液体培养基 B5+NAA0.2mg/L+KT0.2mg/L+ 酪蛋白水解氨基酸 0.5g/L+ 叶酸中进行振荡培 养， 附加蔗糖 30g/L， 每 200ml 三角瓶接种 50ml 液体悬浮细胞， PH5.85， 光照 1000lx， 温度 20， 悬浮培养出来的稳定细胞， 放入附加了 3mg/L 硝酸镧的上述液体培养基中进行培养， 20 天后称重， 检测次生代谢物含量。 0010 实施例 4 取剑叶耳草的叶片， 先在漂白粉中浸泡 3min， 毛刷去除表面污渍， 流水冲洗 30min， 超 净工作台上次氯酸钠处理 11min， 无菌水冲洗 5-7 遍， 灭菌处理过的剑叶耳草叶片接入培。
14、养 基配方为 MS+IBA0.5mg/L+6-BA4mg/l+ 活性炭 0.1% 培养基中进行愈伤组织诱导培养， 附加 蔗糖 30g/L， 琼脂 6.5g/L， PH5-6， 暗室培养， 温度 20， 诱导出来的分散性好的愈伤组织放 入液体培养基 B5+NAA0.2mg/L+KT0.2mg/L+ 酪蛋白水解氨基酸 0.5g/L+ 叶酸中进行振荡培 养， 附加蔗糖 30g/L， 每 200ml 三角瓶接种 50ml 液体悬浮细胞， PH5.85， 光照 1000lx， 温度 20， 悬浮培养出来的稳定细胞， 放入附加了 5mg/L 硝酸镧的上述液体培养基中进行培养， 20 天后称重， 检测次生代谢物含量。 说 明 书 CN 104263695 A 4 。