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1、(10)申请公布号 CN 104244987 A (43)申请公布日 2014.12.24 CN 104244987 A (21)申请号 201280069918.0 (22)申请日 2012.12.14 10-2011-0135162 2011.12.15 KR 10-2012-0001710 2012.01.05 KR A61K 47/48(2006.01) C12N 15/11(2006.01) A61K 9/16(2006.01) A61K 48/00(2006.01) (71)申请人 株式会社百奥尼 地址 韩国大田市 (72)发明人 蔡济旭 韩宝兰 金韩娜 朴翰浯 尹坪伍 金淳基 郑。
2、光柱 权泰宇 崔锺德 李三用 郑恩贞 (74)专利代理机构 北京律诚同业知识产权代理 有限公司 11006 代理人 徐金国 (54) 发明名称 新型寡核苷酸缀合物及其应用 (57) 摘要 本发明提供一种用于治疗疾病 ( 特别是癌 症 ) 的双链 RNA 结构体及其制备方法， 一种利用 所述 RNA 结构体以靶向特异性方式递送双螺旋寡 RNA 的技术， 所述双链 RNA 结构包括共价结合到 双螺旋寡 RNA 以提高双螺旋寡 RNA 的递送的聚合 物化合物， 并且进一步包括结合的靶向特异性配 体。由结合有配体的双螺旋寡 RNA 组成的纳米颗 粒能够将双螺旋寡 RNA 有效递送至靶标， 从而即 使以。
3、相对较低的浓度施用双螺旋寡 RNA 时， 也可 显示双螺旋寡RNA的活性。 此外， 可防止双螺旋寡 RNA 被非特异性递送到其他器官和细胞中。因此， 结合有配体的双链 RNA 结构体可用于治疗多种疾 病， 特别是癌症， 并且还可被有效地用于新型的双 螺旋寡 RNA 递送体系。特别地， 结合有配体的双 链 RNA 结构体可被有效地用于治疗包括癌症和感 染性疾病的疾病。此外， 本发明涉及一种杂化缀 合物， 一种制备所述杂化缀合物和由所述缀合物 组成的纳米颗粒的方法， 所述杂化缀合物包括通 过简单的共价键与反义寡核苷酸 (ASO) 的两端结 合以提高 ASO 的体内稳定性的亲水性材料和疏水 性材料。。
4、 根据本发明的ASO-聚合物缀合物可提高 ASO的体内稳定性， 能够有效递送治疗性ASO进入 细胞。此外， 即使以相对较低的浓度施用 ASO- 聚 合物缀合物时， 也可显示 ASO 的活性。 (30)优先权数据 (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2014.08.15 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/KR2012/010967 2012.12.14 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2013/089522 KO 2013.06.20 (51)Int.Cl. 权利要求书 4 页 说明书 29 页 附图 19 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求。
5、书4页 说明书29页 附图19页 (10)申请公布号 CN 104244987 A CN 104244987 A 1/4 页 2 1. 一种治疗药物 - 聚合物结构体， 所述治疗药物 - 聚合物结构体具有下式 1 的结构并 包括与之结合的配体 ： 式 1 L-A-X-R-Y-B 其中 A 是亲水性材料 ； B 是疏水性材料 ； X 和 Y 各自彼此独立地为简单的共价键或连接 分子介导的共价键 ； R是治疗药物 ； 以及L是具有通过受体介导的内吞作用(RME)来提高靶 细胞的内化的特性的受体特异性配体。 2. 如权利要求 1 所述的治疗药物 - 聚合物结构体， 其中所述治疗药物是双螺旋寡 RNA。
6、 或抗癌药物。 3. 如权利要求 1 所述的治疗药物 - 聚合物结构体， 其中所述配体选自靶特异性抗体、 适体、 肽和受体特异性化学物质， 所述配体特异性结合靶标并执行受体介导的内吞作用 (RME)。 4. 如权利要求 3 所述的治疗药物 - 聚合物结构体， 其中所述受体特异性化学物质选自 叶酸、 N- 乙酰半乳糖胺 (NAG) 和甘露糖。 5. 如权利要求 2 所述的治疗药物 - 聚合物结构体， 其中所述双螺旋寡 RNA 由 19-31 个 核苷酸组成。 6. 如权利要求 2 所述的治疗药物 - 聚合物结构体， 其中所述双螺旋寡 RNA 包括修 饰， 所述修饰包括在一个或更多个核苷酸的糖部分。
7、的 2碳位置的 -OH 基被 -CH3( 甲 基 )、 -OCH3、 -NH2、 -F( 氟 )、 -O-2- 甲氧乙基、 -O- 丙基、 -O-2- 甲硫基乙基、 -O-3- 氨基丙 基、 -O-3- 二甲基氨基丙基、 -O-N- 甲基乙酰氨基或 -O- 二甲基羟氨基乙基取代 ； 核苷酸的 糖部分的氧被硫取代 ； 将核苷酸之间的键修饰为选自由硫代磷酸酯键、 磷酸硼键和甲基膦 酸酯键之一或两种或更多种的组合 ； 或修饰为 PNA( 肽核酸 ) 或 LNA( 锁核酸 ) 的形式。 7. 如权利要求 1 所述的治疗药物 - 聚合物结构体， 其中所述疏水性材料具有 250-1,000 的分子量。 8。
8、. 如权利要求 7 所述的治疗药物 - 聚合物结构体， 其中所述疏水性材料选自由类固醇 衍生物、 甘油酯衍生物、 甘油醚、 聚丙二醇、 C12-C50不饱和烃或饱和烃、 二酰基磷脂酰胆碱、 脂肪酸、 磷脂和脂多胺构成的组。 9. 如权利要求 8 所述的治疗药物 - 聚合物结构体， 其中所述类固醇衍生物选自由胆固 醇、 胆甾烷醇、 胆酸、 胆甾烯基甲酸酯、 胆甾烷基甲酸酯和胆甾烷基胺构成的组。 10.如权利要求8所述的治疗药物-聚合物结构体， 其中所述甘油酯衍生物选自甘油单 酯、 甘油二脂和甘油三酯。 11. 如权利要求 1 所述的治疗药物 - 聚合物结构体， 其中所述亲水性材料具有 200-1。
9、0,000 的分子量。 12. 如权利要求 11 所述的治疗药物 - 聚合物结构体， 其中所述亲水性材料选自由聚乙 二醇、 聚乙烯吡咯烷酮和聚恶唑啉构成的组。 13.如权利要求1所述的治疗药物-聚合物结构体， 其中所述共价键是不可降解的键或 可降解的键。 14. 如权利要求 13 所述的治疗药物 - 聚合物结构体， 其中所述不可降解的键是酰胺键 或磷酸键。 权 利 要 求 书 CN 104244987 A 2 2/4 页 3 15. 如权利要求 13 所述的治疗药物 - 聚合物结构体， 其中所述可降解的键选自由二硫 键、 可酸降解的键、 酯键、 酐键、 可生物降解的键或酶促降解的键构成的组。 。
10、16. 一种制备配体缀合的双螺旋寡 RNA 结构体的方法， 所述方法包括以下步骤 ： (1) 在结合有官能团 - 亲水性材料的固相支持物上合成单链 RNA ； (2) 将疏水性材料共价结合到结合有所述官能团 - 亲水性材料的单链 RNA 的 5 端 ； (4) 将官能团 -RNA- 聚合物结构体和单独合成的互补的单链 RNA 与固相支持物分离 ； (5) 通过官能团将配体结合到亲水性材料的末端 ； 以及 (6) 将结合有配体的 RNA- 聚合物结构体与互补的单链 RNA 退火以形成双链 RNA 结构 体。 17. 一种制备双螺旋寡 RNA 结构体的方法， 所述方法包括以下步骤 ： (1) 在固。
11、相支持物上合成单链 RNA ； (2) 将亲水性材料共价结合到单链 RNA 的 5 端 ； (3) 将配体结合到与所述单链 RNA 结合的亲水性材料 ； (4) 将结合有配体的 RNA- 亲水性聚合物结构体和单独合成的互补的 RNA- 疏水性聚合 物结构体与固相支持物分离 ； 以及 (5) 将结合有配体的 RNA- 亲水性聚合物结构体与互补的 RNA- 疏水性聚合物结构体退 火以形成双链结构， 其中所述制备方法在步骤 (1) 至 (4) 之间包括合成与步骤 (1) 的单链 RNA 互补的单链 RNA， 然后将疏水性材料共价结合所合成的单链 RNA 以合成单链 RNA- 疏水性聚合物结构体 的步。
12、骤。 18. 一种制备结合有配体的双螺旋寡 RNA 结构体的方法， 所述方法包括以下步骤 ： (1) 在结合有官能团的固相支持物上合成单链 RNA ； (2) 将亲水性材料共价结合到步骤 (1) 中所获得的材料 ； (3) 将配体共价结合到步骤 (2) 中所获得的材料 ； (4) 将步骤 (3) 中所获得的材料与固相支持物分离 ； (5) 通过结合到 3 端的官能团， 将疏水性材料共价结合到从步骤 (4) 所得的材料 ； 以 及 (6) 将从步骤 (5) 所得的材料与互补的单链 RNA 退火以形成双链 RNA 结构体。 19.一种纳米颗粒， 包括如权利要求1至15中任一项所述的治疗药物-聚合物。
13、结构体。 20. 一种药物组合物， 包括如权利要求 1 至 15 中任一项所述的治疗药物 - 聚合物结构 体。 21. 一种药物组合物， 包括如权利要求 19 所述的纳米颗粒。 22. 一种反义寡核苷酸 (ASO)- 聚合物缀合物， 由下式 5 表示 ： 式 5 A-X-R-Y-B 其中 A 和 B 的一个是亲水性材料， 另一个是疏水性材料， X 和 Y 各自彼此独立地为简单 的共价键或连接分子介导的共价键， R 是 ASO。 23. 如权利要求 22 所述的反义寡核苷酸 (ASO)- 聚合物缀合物， 其中所述 ASO 由 10-50 个核苷酸组成。 权 利 要 求 书 CN 10424498。
14、7 A 3 3/4 页 4 24. 如权利要求 23 所述的反义寡核苷酸 (ASO)- 聚合物缀合物， 其中所述寡核苷酸包 括修饰， 所述修饰包括在一个或更多个核苷酸的糖部分的 2 碳位置的 -OH 基被 -CH3( 甲 基 )、 -OCH3、 -NH2、 -F( 氟 )、 -O-2- 甲氧乙基、 -O- 丙基、 -O-2- 甲硫基乙基、 -O-3- 氨基丙 基、 -O-3- 二甲基氨基丙基、 -O-N- 甲基乙酰氨基或 -O- 二甲基羟氨基乙基取代 ； 核苷酸的 糖部分的氧被硫取代 ； 将核苷酸之间的键修饰为选自由硫代磷酸酯键、 磷酸硼键和甲基膦 酸酯键之一或两种或更多种的组合 ； 或修饰为。
15、 PNA( 肽核酸 ) 或 LNA( 锁核酸 ) 的形式。 25.如权利要求22所述的反义寡核苷酸(ASO)-聚合物缀合物， 其中所述亲水性材料具 有 200-10,000 的分子量。 26.如权利要求25所述的反义寡核苷酸(ASO)-聚合物缀合物， 其中所述亲水性材料选 自由聚乙二醇、 聚乙烯吡咯烷酮和聚恶唑啉构成的组。 27.如权利要求22所述的反义寡核苷酸(ASO)-聚合物缀合物， 其中所述疏水性材料具 有 250-1,000 的分子量。 28.如权利要求27所述的反义寡核苷酸(ASO)-聚合物缀合物， 其中所述疏水性材料是 C12-C50烃或胆固醇。 29.如权利要求22所述的反义寡核。
16、苷酸(ASO)-聚合物缀合物， 其中所述共价键是不可 降解的键或可降解的键。 30.如权利要求29所述的反义寡核苷酸(ASO)-聚合物缀合物， 其中所述不可降解的键 是酰胺键或磷酸键。 31.如权利要求29所述的反义寡核苷酸(ASO)-聚合物缀合物， 其中所述可降解的键选 自由二硫键、 可酸降解的键、 酯键、 酐键、 可生物降解的键或酶促降解的键构成的组。 32.一种ASO-聚合物缀合物， 包括结合到如权利要求22至31中任一项所述的ASO-聚 合物缀合物的亲水性材料的配体。 33. 一种制备 ASO- 聚合物缀合物的方法， 所述方法包括以下步骤 ： (a) 将亲水性材料共价结合到固相支持物上。
17、 ； (b) 在包括亲水性材料的固相支持物上合成 ASO ； (c) 将疏水性材料共价结合到固相支持物上的 ASO 的 5 端 ； 以及 (d) 从固相支持物分离并纯化所得的 ASO- 聚合物缀合物。 34. 一种制备 ASO- 聚合物缀合物的方法， 所述方法包括以下步骤 ： (a) 在结合有官能团的载体上合成 ASO ； (b) 将亲水性材料共价结合到所述 ASO 的 5 端 ； (c) 将结合所述亲水性材料的 ASO 缀合物与所述载体分离 ； 以及 (d) 将疏水性材料共价结合到从所述载体分离的所述 ASO 的 3 端。 35. 一种制备包括与之连接的配体的 ASO- 聚合物缀合物的方法，。
18、 所述方法包括以下步 骤 ： (a) 将亲水性材料结合连接有官能团的固相支持物 ； (b) 在结合有官能团 - 亲水性材料的固相支持物上合成 ASO ； (c) 将疏水性材料共价结合到 ASO 的 5 端 ； (d) 将步骤 (c) 中获得的 ASO- 聚合物缀合物与固相支持物分离 ； 以及 (e) 将配体结合到从固相支持物分离的 ASO- 聚合物缀合物的亲水性材料。 权 利 要 求 书 CN 104244987 A 4 4/4 页 5 36. 一种制备包括与之连接的配体的 ASO- 聚合物缀合物的方法， 所述方法包括以下步 骤 ： (a) 在连接有官能团的固相支持物上合成 ASO ； (b)。
19、 将亲水性材料共价结合到 ASO 的末端 ； (c) 将配体共价结合到 ASO- 亲水性材料缀合物 ； (d) 将连接有官能团的 ASO- 亲水性材料 - 配体缀合物与固相支持物分离 ； 以及 (e) 将疏水性材料共价结合到从固相支持物分离的缀合物的 ASO 的 3 端。 37. 一种纳米颗粒， 包括如权利要求 22 至 31 中任一项所述的 ASO- 聚合物缀合物。 38. 一种纳米颗粒， 包括如权利要求 32 的结合有配体的 ASO- 聚合物缀合物。 39. 一种药物组合物， 包括药学上有效量的如权利要求 22 至 31 中任一项所述的 ASO- 聚合物缀合物。 40. 一种药物组合物， 。
20、包括药学上有效量的如权利要求 37 所述的纳米颗粒。 41.一种药物组合物， 包括药学上有效量的如权利要求32所述的结合有配体的ASO-聚 合物缀合物。 42. 一种药物组合物， 包括药学上有效量的如权利要求 38 所述的纳米颗粒。 权 利 要 求 书 CN 104244987 A 5 1/29 页 6 新型寡核苷酸缀合物及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一种用于治疗癌症和感染性疾病的新型寡核苷酸结构体， 该结构体中 结合有提高单链寡核苷酸或双链寡核苷酸递送的亲水性材料和疏水性材料， 本发明还涉及 该新型寡核苷酸结构体的应用。 0002 本发明的第一方面涉及一种包括与包含在该结构体中的亲。
21、水性材料结合的靶特 异性配体的双螺旋寡 RNA 结构体， 一种由结合有配体的双螺旋寡 RNA 结构体组成的纳米颗 粒， 一种包括所述RNA结构体的药物组合物， 一种包括由结合有配体的双螺旋寡RNA结构体 组成的纳米颗粒的药物组合物， 一种制备所述结构体的方法， 一种制备由所述 RNA 结构体 组成的纳米颗粒的方法和一种递送结合有配体的双螺旋寡 RNA 结构体的技术。 0003 本发明的第二方面涉及一种反义寡核苷酸 ( 以下简称 “ASO” ) 缀合物， 所述 ASO 缀 合物包括通过简单的共价键或连接分子介导的共价键结合到ASO的两端以提高ASO的细胞 内递送效率的亲水性材料和疏水性材料， 一。
22、种制备所述缀合物的方法以及一种递送由 ASO 缀合物组成的纳米颗粒的技术。 背景技术 0004 自从发现了 RNA 干扰 ( 以下简称 “RNAi” ) 的作用， 人们发现 RNAi 在多种哺乳动 物细胞上序列特异性地作用于 mRNA(Silence of the transcripts:RNA interference in medicine.J Mol Med(2005)83:764773)。当长的双链 RNA 被递送到细胞中时， 所递 送的 RNA 被核酸内切酶 dicer 加工为 21-23 个碱基对 (bp) 的小分子干扰 RNA( 以下简称 “siRNA” )。 siRNA结合RI。
23、SC(RNA诱导的沉默复合体)并通过反义链识别和降解靶mRNA的过 程以序列特异的方式抑制靶基因的表达 (NUCLEIC-ACID THERAPEUTICS:BASIC PRINCIPLES AND RECENT APPLICATIONS.Nature Reviews Drug Discovery.2002.1,503-514)。 0005 Bertrand 等人报道了与针对相同靶基因的反义寡核苷酸 (ASO) 相比， siRNA 对 mRNA 的体内和体外表达具有优异的抑制作用， 并且效果持久 (Comparison of antisense oligonucleotides and siR。
24、NAs in cell culture and in vivo.Biochem.Biophys.Res. Commun.2002.296:1000-1004)。此外， 由于 siRNA 与靶 mRNA 互补地结合从而以序列特异性 的方式来调控靶基因的表达， 因此与传统的基于抗体的药物或化学物质 ( 小分子药物 ) 相 比， siRNA 可有利地用在广泛的应用范围中 (Progress Towards in Vivo Use of siRNAs. Molecular Therapy.200613(4):664-670)。 0006 siRNA 具有优异的效果并且可有利地用在广泛的应用范围中， 但。
25、为了将 siRNA 开 发为细胞治疗剂， 需要提高siRNA的稳定性和细胞内递送效率， 以便将siRNA有效地递送到 靶细胞中 (Harnessing in vivo siRNA delivery for drug discovery and therapeutic development.Drug Discov.Today.2006Jan ； 11(1-2):67-73)。 0007 为了满足这些要求， 已使用了抗核酸酶类似物或诸如病毒载体、 脂质体或纳米颗 粒这样的载体。 0008 诸如腺病毒或逆转录病毒的病毒载体具有高转染效率， 但是伴随有免疫原性和致 说 明 书 CN 10424498。
26、7 A 6 2/29 页 7 癌性的风险。然而， 与病毒载体相比， 包括纳米颗粒的非病毒载体被评价为具有较低的细 胞内递送效率， 但具有以下优点， 包括 ： 体内安全性高、 靶特异性递送、 RNAi 寡核苷酸高效 摄入并内化进入细胞或组织、 低细胞毒性和免疫刺激。因此， 这些非病毒载体被认为是有 效抑制靶基因表达的最有前景的递送方法 (Nonviral delivery of synthetic siRNAs in vivo.J.Clin Invest.2007December3 ； 117(12):36233632)。 0009 已开发了具有各种纳米颗粒的递送体系用于肿瘤特异性递送。 这种纳。
27、米颗粒体系 通常被设计为表面包被有亲水性材料以增加血液中的循环时间， 并带有正电荷以增加内吞 作用(Active targeting schemes for nanoparticle systems in cancer therapeutics. Advanced Drug Delivery Reviews60(2008)16151626)。同时， 与正常组织不同， 肿瘤组 织非常坚硬且具有扩散限制， 由于该扩散限制对肿瘤所需的营养物以及诸如氧气和二氧化 碳之类的废物的迁移具有不利影响， 因而通过血管新生在周围区域形成血管来克服该扩散 限制。通过血管新生在肿瘤组织中形成的血管具有渗漏的且有缺陷。
28、的血管， 根据肿瘤的类 型不同， 该血管包括尺寸从约 100nm 至 2m 范围内的间隙。 0010 因此， 与正常组织的结构化的毛细血管相比， 纳米颗粒更容易穿过具有渗漏的且 有缺陷的血管的肿瘤组织的毛细血管内皮细胞， 这样纳米颗粒在血液中循环时很容易地 被递送。此外， 肿瘤组织无淋巴引流， 因而药物在其中积累。这种机制被称为增强的渗透 和滞留 (EPR) 效应。由于这种效应， 纳米颗粒易于特异性地被递送到肿瘤组织中， 而这种 机制被称为被动靶向 (Nanoparticles for drug delivery in cancer treatment.Urol Oncol.2008Jan-F。
29、eb ； 26(1):57-64)。 0011 为了克服体内分布、 靶向的非特异性以及包括抗癌药物的治疗药物的水溶性缺 乏， 已进行了各种研究来优化载有治疗药物的纳米颗粒的尺寸或对表面进行修饰以增加它 们在血液中的循环时间。特别地， 针对包括聚合物 - 药物缀合物的聚合物纳米颗粒， 已进行 了各种研究来通过将抗癌药物与水溶性的、 可生物降解的材料 ( 诸如白蛋白、 聚 -L- 谷氨 酸 (PGA) 或 N-(2- 羟丙基 )- 甲基丙烯酰胺共聚物 ) 连接而提高抗癌药物的肿瘤特异性递 送 (Therapeutic Nanoparticles for Drug Delivery in Cance。
30、r.Clin Cancer Res2008 ； 14:1310-1316)。此外， 已进行了各种研究来将两亲性材料与抗癌药物连接， 以形成由抗癌 药物的疏水性核和亲水性壳组成的聚合物胶束 (Development of the polymer micelle carrier system for doxorubicin.J Control Release2001 ； 74:295-302)。 0012 因此， 当疏水性材料被额外地结合到诸如抗癌药物的治疗药物以增加核的内聚力 时， 即使在低浓度下也可以形成胶束， 并且由于壳的亲水性材料而可以形成稳定性增加的 聚合物胶束。 通过可生物降解的键在两。
31、端结合有疏水性材料和亲水性材料的治疗药物可形 成改良的聚合物胶束， 从而能够将治疗药物稳定地递送到目标癌组织中。 0013 近来， 作为递送双链寡 RNA 结构体的技术， 开发了基于结合到核酸末端的材料特 性而形成的自组装纳米颗粒 SAMiRNA 技术 ( 韩国专利公开 No.2009-0042297)。SAMiRNA 是 由双链寡RNA结构体组成的自组装纳米颗粒， 所述双链寡RNA结构体结合有提高双链寡RNA 的递送的亲水性材料和疏水性材料， 用于形成 SAMiRNA 的技术可以是用于提高双链寡 RNA 的细胞内递送的技术。 0014 研究发现， 当将标记有荧光标签的 SAMiRNA 施用到。
32、肿瘤异种移植小鼠模型的尾部 静脉时， 纳米颗粒通过上述被动靶向被特异性地递送到肿瘤中 ( 参见图 2)。 说 明 书 CN 104244987 A 7 3/29 页 8 0015 同时， 主动靶向利用其中结合有靶向部分的纳米颗粒。据报道， 靶向部分导致纳 米颗粒在靶组织中优先积累或提高纳米颗粒内化进入靶细胞 (Does a targeting ligand influence nanoparticle tumor localization or uptake Trends Biotechnol.2008Oct ； 26(10):552-8.Epub2008Aug21)。 0016 主动靶向是指。
33、采用诸如抗体或配体的靶向部分与纳米颗粒结合来提高纳米颗粒 向靶细胞的递送。 近年来， 已进行了各种研究以采用与siRNA结合的各种靶向部分将siRNA 定位到所需组织。 0017 例如， 研究发现， 结合有 - 生育酚的 siRNA 在体内被有效地、 稳定地递送并通过 RNA干扰来抑制靶基因的表达(Kazutaka Nishina et al.,The American Society of Gene therapy,2008,16(4):734-740)。此外， 研究表明， 与主要用于递送 siRNA 的细胞穿透肽 (CCP)相比， 结合有胆固醇的siRNA被更有效地递送到肝组织中(US-2。
34、0060014289 ； Moschos S.A.et al.,Bioconjug.Chem.18:1450-1459)。 据报道， 引起递送效果的原因不仅是肿瘤组 织的特异性， 还有被所结合的靶向部分定向的细胞的特异性。 0018 主动靶向利用能够结合对靶细胞表面特异性的或在靶细胞表面上过表达的碳水 化合物、 受体或抗原的材料 (Nanotechnology in cancer therapeutics:bioconjugated nanoparticles for drug delivery.Mol Cancer Ther2006 ； 5(8):1909-1917)。因此， 结 合有主动靶。
35、向部分的纳米颗粒在血液中循环时通过被动靶向在肿瘤组织中积累， 并且通过 靶向部分促进纳米颗粒向靶细胞的递送， 从而提高了被递送到细胞中的药物的治疗效果。 作为靶向部分， 主要采用配体或抗体。靶向部分与它在细胞表面上的受体以高亲和力和特 异性结合并通过受体介导的内吞作用 (RME) 促进纳米颗粒的内化 (Kinetic analysis of receptor-mediated endocytosis(RME)of proteins and peptides:use of RME as a drug delivery system.J Control Release1996 ； 39:191-2。
36、00)。 0019 由该配体或抗体靶向的细胞表面受体或抗原的特征在于它对靶细胞是特异性的 或在靶细胞中过表达， 以便于靶向配体的进入， 从而提高内吞作用率。此外， 受体或抗原 将其中结合有配体的纳米颗粒递送到细胞中， 并循环回到细胞表面 (Receptor-mediated endocytosis:An overview of a dynamic process.J.Biosci.,Oct.1984,6(4),pp.535-54 2.)。肿瘤靶向部分是这样的材料， 其特异性地结合在靶细胞系中特异性地表达的受体 ( 如 表皮生长因子或低密度脂蛋白受体 )， 或结合已知在各种肿瘤细胞的表面上过表达。
37、的肿瘤 特异性受体 ( 如叶酸受体 )(Nanotechnology in cancer therapeutics:bioconjugated nanoparticles for drug delivery.Mol Cancer Ther2006,5(8):1909-1917)。 0020 如果靶向部分(特别是通过受体介导的内吞作用(RME)来提高内化的受体特异性 配体 ) 与 SAMiRNA 结合， 则可有效地促进 SAMiRNA 递送到靶细胞 ( 特别是肿瘤细胞 ) 中， 因 此 SAMiRNA 即使在相对低的浓度和剂量下也可被递送到靶细胞中， 这样双链寡 RNA 可显示 出较高的活性， 。
38、并且可抑制双链寡 RNA 向其他器官和细胞非特异性递送。 0021 此外， SAMiRNA 形成技术不仅可应用于双链寡 RNA， 而且也可应用于单链寡核苷 酸， 特别是用于治疗目的的单链反义寡核苷酸 (ASO)。 0022 ASO技术是通过采用单链RNA或DNA改变mRNA的代谢来控制信息从基因到蛋白质 的传递的技术。 换句话说， ASO技术是采用选定的与蛋白质互补地并特异性地杂交的核苷酸 序列来优先抑制目的蛋白质表达的技术。由于 ASO 以序列特异性的方式与靶基因结合， 因 说 明 书 CN 104244987 A 8 4/29 页 9 而不会影响除了靶基因之外的基因的表达。 因此， ASO。
39、技术可作为有用的工具来分析特异性 蛋白质的体内作用， 并且还可用于针对特定疾病的基因治疗 (FASEBJ.9,1288-1296,1995)。 0023 近年来， 开发了一种新型的单链反义寡核苷酸antagomir， 并已将其用于抑 制细胞中 microRNA 的功能。已知 antagomir 或 microRNA 抑制剂 (miRNA 抑制剂 ) 是互补 地结合靶 microRNA 以抑制 microRNA 功能的化学合成的短 RNA。antagomir 优选地具有诸 如 2 甲氧基或硫代磷酸酯这样的修饰的化学结构， 以防止 antagomir 的降解。目前， 抑 制与包括癌症、 心脏和肺纤。
40、维化在内的多种疾病相关的 miRNA 功能的 antagomir 是已知 的 (“Silencing of microRNAs in vivo withantagomirs“Nature,Dec.2005,438(706 8):685-689 ； “MicroRNAs as Therapeutic Targets“New England J.Medicine,2006,354 (11):1194-1195 ； Meister G.et al.,“Sequence-specifi c inhibition of microRNA-and siRNA-induced RNA silencing“R。
41、NA,Mar.2004,10(3):544-550)。 0024 反义 DNA 与靶 mRNA 结合以形成 RNA/DNA 双链， 所述 RNA/DNA 双链在体内被 RNase H(一种特异性地降解其中形成有RNA/DNA杂化双链的mRNA的核糖核酸酶)降解。 反义RNA 形成RNA/RNA双链， 并且靶mRNA的降解是由RNase L诱导的。 RNase L是优先降解双链RNA 周围的单链 RNA 的核糖核酸酶 (Pharmacol.Toxicol.32,329-376,1992)。 0025 然而， 包括 miRNA 抑制剂 antagomir 的 ASO 应被有效地递送到靶细胞中以达到。
42、所 需效果， 并且 ASO 在血液中可被核糖核酸酶降解。因此， 为了将 ASO 用于治疗目的， ASO 缀 合物应被有效地递送通过细胞膜， 并应确保 ASO 在体内的稳定性 (Shigeru Kawakami and Mitsuru Hashida,Drug Metab.Pharmacokinet.22(3):142-151,2007)。 0026 因此， 为了体内稳定性， 大多数 ASO 呈通过提供核酸酶抗性的各种修饰而获得的 寡聚脱氧核苷酸(ODN)的形式。 所述修饰可以是在一个或多个核苷酸的糖部分的2 碳位置 的 -OH 基被 -CH3( 甲基 )、 -OCH3、 -NH2、 -F( 氟。
43、 )、 -O-2- 甲氧乙基、 -O- 丙基、 -O-2- 甲硫基乙 基、 -O-3- 氨基丙基、 -O-3- 二甲基氨基丙基、 -O-N- 甲基乙酰氨基或 -O- 二甲基羟氨基乙基 取代 ； 核苷酸的糖部分的氧被硫取代 ； 将核苷酸之间的键修饰为硫代磷酸酯键、 磷酸硼键 或甲基膦酸酯键 ； 或以上一种或多种修饰的组合 ； 或修饰为 PNA( 肽核酸 ) 或 LNA( 锁核酸 ) 的形式 ( 参见 Crooke et al.,Ann.Rev.Med.Vol.55:pp61-652004,US5,660,985,US5,958, 691,US6,531,584,US5,808,023,US6,3。
44、26,358,US6,175,001Braasch D.A.et al.,Bioorg. Med.Chem.Lett.14:1139-1143,2003 ； Chiu Y.L.et al.,RNA,9:1034-1048,2003 ； Amarzguioui M.et al.,Nucleic Acid Res.31:589-595,2003)。 0027 为了将 ASO 递送到靶细胞中， 发展了利用诸如腺病毒或逆转录病毒之类的病毒的 基因递送技术和利用诸如脂质体、 阳离子型脂质或阳离子型聚合物之类的非病毒载体的基 因递送技术。 然而， 病毒载体在安全性方面存在问题， 这是因为不能确保这些载体在。
45、整合到 宿主染色体之后不会造成宿主基因的正常功能的异常， 或不会激活癌基因。此外， 如果病 毒基因即使以低水平持续表达而导致自身免疫性疾病或如果病毒载体引起改性病毒感染， ASO 也不能被有效地递送。 0028 为克服这些问题， 已研究了将基因融合到非病毒载体脂质体的方法或采用阳离子 型脂质或阳离子型聚合物的方法来克服上述缺点。虽然这些非病毒载体不及病毒载体有 效， 但是它们具有以下优点 ： 它们在体内安全、 副作用较少并且可以以低成本生产(Lehrman S.Nature.401(6753):517-518,1999)。 说 明 书 CN 104244987 A 9 5/29 页 10 00。
46、29 为了有效地实现采用非病毒载体稳定递送包括 ASO 的 ODN 分子， 需要一种有效的 防止酶促降解或非酶促降解的方法。因此， 提出了通过化学修饰 ASO 来使得 ASO 对核酸 酶稳定并增加 ASO 的细胞内吸收的方法 (Shigery Kawakami and Mitsuru Hashida.Drug Metab.Parmacokinet.22(3):142-151,2007)。 0030 同时， 包括PEG(聚乙二醇)的聚合物通过它们之间的相互作用自发形成具有胶束 结构的复合物， 这些复合物被称为聚合物复合胶束 (Kataoka K.et al.Macromolecules,29 :。
47、8556-8557,1996)。 这些聚合物复合胶束的优点在于相比于诸如微球体或纳米颗粒的其他 药物递送体系， 它们具有非常小的尺寸同时其分布非常均匀， 并且它们是自发形成的， 使得 容易控制制剂的质量并确保再现性。 0031 近年来， 为了增加 ASO 的细胞内递送效率， 发展了通过简单的共价键或连接分子 介导的共价键将亲水性材料 ( 如生物相容性聚合物 PEG) 与 ASO 结合来确保 ASO 的稳定性 并使ASO有效渗透通过细胞膜的技术(韩国专利登记No.0466254)。 然而， 仅通过化学修饰 和聚乙二醇化难以实现提高 ASO 的体内稳定性并确保 ASO 有效递送到靶组织中。 003。
48、2 如上所述， 发展了通过将疏水性材料和亲水性材料引入 siRNA 而获得的纳米颗粒 来提高siRNA的细胞内递送的SAMiRNA技术， 但是尚未报道将该技术应用到ASO的递送。 因 此， 需要开发一种ASO递送体系及其制备方法， 通过将各种化学修饰引入ASO并将各种聚合 物与 ASO 缀合以保护 ASO 不受酶的影响， 从而使 ASO 的稳定性增加并有效渗透通过细胞膜。 发明内容 0033 根据本发明的第一方面 ： 0034 本发明的一个目的在于提供一种治疗药物结构体、 一种由所述治疗药物结构体组 成的纳米颗粒及其制备方法， 所述治疗药物结构体包括亲水性材料和疏水性材料， 所述亲 水性材料和。
49、疏水性材料是通过简单的共价键或连接分子介导的共价键结合治疗药物的两 末端以提高治疗药物的细胞内递送效率的生物相容性的聚合物化合物， 所述治疗药物结构 体进一步包括与亲水性材料结合的配体。 0035 本发明的另一个目的在于提供一种双螺旋寡 RNA 结构体， 其包括通过简单的键或 连接分子介导的共价键结合双螺旋寡RNA的两末端以提高双螺旋寡RNA的细胞内递送效率 的生物相容性的亲水性聚合物材料和疏水性聚合物材料， 所述双螺旋寡 RNA 结构体进一步 包括与亲水性材料结合的受体特异性配体， 所述受体特异性配体具有通过受体介导的内吞 作用 (RME) 来提高靶细胞 ( 特别是肿瘤细胞 ) 的内化的特性 ； 一种由结合有配体的双螺旋 寡 RNA 结构体组成的纳米颗粒 ； 和一种药物组合物， 所述药物组合物包括结合有配体的双 螺旋寡 RNA 结构体或者包括由结合有配体的双螺旋寡 RNA 结构体组成的纳米颗粒。 0036 本发明的再另一目的是提供一种制备结合有配体的双螺旋寡 RNA 结构体的方法 和制备包括由结合有配体的双螺旋寡 RNA 结构体组成的纳米颗粒的方法， 和一种采用结合 有配体的双螺旋寡 RNA 结构。