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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410689764.6 (22)申请日 2014.11.26 C12Q 1/14(2006.01) C12Q 1/10(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) C12R 1/445(2006.01) C12R 1/19(2006.01) C12R 1/22(2006.01) C12R 1/37(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (71)申请人 张晓军 地址 211499 江苏省扬州市仪征市真州镇国 庆路 141 号 (72)发明人 张晓军 (74)专利代理机构 扬州苏中专利事务所 ( 普通 合伙。
2、 ) 32222 代理人 许必元 (54) 发明名称 基于超分子识别的细菌检测方法及其应用 (57) 摘要 本发明涉及一种基于超分子识别的细菌检测 方法， 应用超分子识别及具有稳定电化学活性的 碳硼烷衍生物或阿霉素作为细菌标识物探针分 子， 在电极上滴加菌液， 随后立即滴加标识物探针 分子与细菌特异结合， 然后检测差分脉冲响应信 号 ； 或者用菌悬液作为电解液， 应用超分子识别 及具有稳定电化学活性的碳硼烷衍生物或阿霉素 作为细菌标识物探针分子， 在菌悬液中加入标识 物探针分子与细菌特异性结合， 然后检测交流阻 抗曲线。本发明可实现活菌计数、 细菌种类鉴别、 以及临床样本中的耐药菌株和敏感菌株。
3、的区分， 检测普适性强， 速度快， 灵敏度高， 特异性好， 检测 效率高 ； 避免了使用昂贵的免疫试剂或检测试剂 盒。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 (10)申请公布号 CN 104388528 A (43)申请公布日 2015.03.04 CN 104388528 A 1/1 页 2 1. 基于超分子识别的细菌检测方法， 其特征在于， 应用超分子识别及具有稳定电化学 活性的阿霉素作为细菌标识物探针分子， 在电极上滴加菌液， 随后立即滴加标识物探针分 子与细菌特异结合， 然后检测差分脉冲响应信号。 2. 如权利要。
4、求 1 所述的基于超分子识别的细菌检测方法的应用， 其特征在于， 利用单 一标准菌株悬液获得的差分脉冲谱来鉴别细菌的种类。 3. 如权利要求 1 所述的基于超分子识别的细菌检测方法的应用， 其特征在于， 利用单 一标准菌株悬液获得的差分脉冲峰电位的值来鉴别临床病原菌的耐药程度高低。 4. 如权利要求 1 所述的基于超分子识别的细菌检测方法的应用， 其特征在于， 利用单 一标准菌株悬液获得的差分脉冲峰电流的值来计算细菌的量。 5. 如权利要求 2-4 任一项所述的基于超分子识别的细菌检测方法的应用， 其特征在 于， 所述单一标准菌株为金黄色葡萄球菌， 大肠杆菌， 鲍曼不动杆菌， 肺炎克雷伯氏菌或。
5、奇 异变形杆菌。 权 利 要 求 书 CN 104388528 A 2 1/3 页 3 基于超分子识别的细菌检测方法及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一种基于超分子识别的细菌检测方法及其应用。 背景技术 0002 致病细菌一直是严重危害人类健康的 “隐形杀手” 。 为了减少其对人类的危害需要 进行科学的研究如活菌计数、 分类鉴别、 敏感程度等。 目前最常用而相对精准的活菌计数方 法为琼脂板菌落计数法， 此法是通过将样本稀释到适当倍数后培养 24 小时， 使菌培养形成 离散的菌落， 然后人工进行计数。而鉴别细菌种类则要经上述培养后进行一系列生化试验 来实现。 此法不但检测时间长， 还浪费大。
6、量人力、 物力。 细菌的快速检测方法的研究早在20 世纪 60 年代就开始进行了研究， 一直持续发展到现在。目前细菌的快速检测方法可分为以 下几类 ： 活细胞计数法、 仪器检测、 核酸检测等。 上述方法虽检测时间有所缩短， 但所需免疫 试剂昂贵且通常毒性较大， 所需仪器也同样昂贵， 并且操作复杂， 专一性和选择性差。 0003 电化学是研究电能与化学能之间的相互转化及转化过程中有关规律的科学。 电化 学测试方法具有 ： l. 简单易行， 可将难以测定的化学参数之间转变为容易测定的电参数进 行测定。2灵敏度高， 即使是微量的物质变化也可以通过电流或电量的变化进行测定。3 实咐行好， 利用高精度的。
7、特点， 可以检测出微反应量， 并对其进行定量。电化学差分脉冲伏 安法具有高灵敏度 ： 可逆电极反应物质灵敏度可达 lO。7mol/l， 不可逆电极反应物质灵敏 度可达 lO-Omol/l ； 分辨能力强 ； 选择性强 ： 允许前放电物质的量大， 前放电物质的浓度比 待测物质浓度高50000倍亦不干扰测定。 交流阻抗也叫电化学阻抗谱(EIS)， 它是一种以小 振幅的正弦波电位 （或电流） 为扰动信号， 对体系的影响小， 并且扰动与体系的响应之间近 似呈线性关系， 这就使测量结果的数字处理变得简单。 0004 分子识别一直是分析化学家感兴趣的问题。 伴随超分子络合物的形成会出现颜色 变化、 电化学。
8、信号的改变等各种功能。据此有望建立起高选择性、 灵敏快速的分子识别方 法。 0005 碳硼烷衍生物是由硼元素和碳元素形成的多面体硼烷簇化合物， 在水、 氧及其他 各种条件下具有很高的化学稳定性。碳硼烷易于被化学衍生， 其硼氢顶点易于发生亲电取 代反应， 强碱还可以夺取碳氢顶点的质子。碳硼烷的独特性质使得设计和合成新型的碳硼 烷化合物成为材料化学、 生物化学共同关注的热点话题。 发明内容 0006 本发明提供应用电化学方法快速检测细菌的方法， 可以实现活菌计数， 细菌种类 鉴别、 以及临床样本中的耐药菌株和敏感菌株的区分， 检测普适性强， 速度快， 灵敏度高， 特 异性好， 检测效率高 ； 避免。
9、了使用昂贵的免疫试剂或检测试剂盒 ； 对样本的要求不高， 不需 要经过复杂处理， 在复杂的样本条件下均可进行 ； 所用设备可实现微型化和便携化。 0007 所述应用电化学方法快速检测细菌的方法为， 应用超分子识别及具有稳定电化学 活性的碳硼烷衍生物或阿霉素作为细菌标识物探针分子， 在电极上滴加菌液， 随后立即滴 说 明 书 CN 104388528 A 3 2/3 页 4 加标识物探针分子与细菌特异结合， 然后检测差分脉冲响应信号。 0008 优选， 利用单一标准菌株悬液获得的差分脉冲谱来鉴别细菌的种类 ； 或者利用单 一标准菌株悬液获得的差分脉冲峰电位的值来鉴别临床病原菌的耐药程度高低 ； 。
10、或者利用 单一标准菌株悬液获得的差分脉冲峰电流的值来计算细菌的量。 所述单一标准菌株优选为 金黄色葡萄球菌， 大肠杆菌， 鲍曼不动杆菌， 肺炎克雷伯氏菌或奇异变形杆菌。 0009 另一种应用电化学方法快速检测细菌的方法为， 用菌悬液作为电解液， 应用超分 子识别及具有稳定电化学活性的碳硼烷衍生物或阿霉素作为细菌标识物探针分子， 在菌悬 液中加入标识物探针分子与细菌特异性结合， 然后检测交流阻抗曲线。 0010 优选， 利用单一标准菌株悬液获得的系统阻抗谱与所得阻抗值对比， 鉴别细菌的 种类 ； 或者利用单一标准菌株悬液获得的电化学阻抗值来计算靶细菌的量。所述单一标准 菌株优选为金黄色葡萄球菌，。
11、 大肠杆菌， 鲍曼不动杆菌， 肺炎克雷伯氏菌或奇异变形杆菌。 0011 另一种应用电化学方法快速检测细菌的方法为， 在电极上修饰所测细菌并进行培 养， 应用超分子识别及具有稳定电化学活性的碳硼烷衍生物或阿霉素作为细菌标识物探针 分子使检测标识物探针分子与电极上修饰的细菌特异性结合， 然后检测差分脉冲伏安信 号。 0012 优选， 利用单一标准菌株悬液获得的差分脉冲谱来鉴别细菌的种类 ； 或者利用单 一标准菌株悬液获得的差分脉冲峰电位的值来鉴别临床病原菌的耐药程度高低 ； 或者利用 单一标准菌株悬液获得的差分脉冲峰电流的值来计算细菌的量。 所述单一标准菌株优选为 金黄色葡萄球菌， 大肠杆菌， 鲍。
12、曼不动杆菌， 肺炎克雷伯氏菌或奇异变形杆菌。 0013 优选， 应用上述电化学方法快速检测细菌时， 所选取的频率范围为 102Hz-108Hz。 0014 本发明利用不同的探针分子与细菌特异性结合， 导致电化学响应信号的差异来检 测细菌的种类、 数量或耐药程度。 具体的操作可以是 ： 检测探针分子的电化学响应信号作为 空白值， 然后检测探针分子与细菌特异性结合后的电化学响应信号， 与空白值进行比较。 将 待测菌液与前述单一标准菌株悬液获得的响应谱图进行对比， 从而获得检测细菌的种类、 数量或耐药程度。 0015 伏安测定是采用电化学工作站与由一个工作电极、 对电极和参比电极组成的三电 极系统。。
13、工作电极采用碳电极或氧化铟锡等电极， 对电极为铂丝， 参比电极为银丝， 组成普 通的三电极系统。 0016 在三电极系统中， 只需取用少量菌液及识别分子组成检测液， 利用差分脉冲法得 到单一细菌的响应谱图。 0017 测量方案可以使用细菌与探针分子混合后在电极上测量或者在电极上修饰细菌 然后使用探针分子与之结合的方法。对于前者， 具有更敏捷更即时的优点。 0018 本发明的有益效果 ： (1) 几种探针分子均具有高度的特异性与灵敏性， 对供试菌 株金黄色葡萄球菌， 大肠杆菌， 鲍曼不动杆菌， 肺炎克雷伯氏菌， 奇异变形杆菌等都有很好 的检测活性。 (2)相关探针分子及其纳米复合物制剂对两种金黄。
14、色葡萄球菌 （敏感性和耐药 性） 有很好的检测区分能力， 能够通过观测峰电流和峰电位及阻抗等来进行区分。 0019 目前国内外采用电化学方法快速检测细菌还处于探索阶段。 具体实施方式 说 明 书 CN 104388528 A 4 3/3 页 5 0020 实施例 l 1.1 探针分子溶液的配制 ： 将几种探针分子衍生物分别用 PBS 配制成高浓度母液， 再 用 PBS 分别稀释成浓度为 1*10-4mol/l、 4*10-4mol/l、 8*10-4mol/l、 12*10-4mol/l。药物探针 于 -4保存。实验前， 将探针药物取出摇匀， 进行电化学实验。 0021 1.2 实验菌株及培养。
15、方法 ： 标准菌株 ： 大肠杆菌 (ATCC8739)， 金黄色葡萄球菌 (CGMCCI. 89)， 肺炎克雷伯氏菌 (ATCC700600)， 鲍曼不动杆菌 (ATCC19606)， 奇异变形杆菌 (ATCC12453) 等。临床耐药菌株 ： 金黄色葡萄球菌 (SA321)， 肺炎克雷伯氏菌 (KP450)， 鲍曼 不动杆菌(AB135)， 奇异变形杆菌(PM102)。 LB液体培养基 ： 1%(wv)胰蛋白胨， 0. 5% (w/ v) 酵母抽提物， 1% (w/v) 氯化钠， 高压蒸汽灭菌 30min 后， 用 2mol/ml 的 NaOH 调整 pH 至 7.2-7.4。LB 琼脂板为。
16、 LB 液体培养基中加入 0.5% (w/v) 琼脂粉， 高压蒸汽灭菌后， 冷却至 50倒板， 冷凝即得。培养方法 ： 用接种环从 4保存的固体斜面培养基上挑取少量茵落， 接种于固体 LB 培养基平面上， 37恒温箱中培养 24h 后， 用接种环挑取 3-5 个菌落转移至 无菌试管中， 用LB培养基稀释并混匀， 调整菌液浓度至1.0105-5.0105CFU/ml作MIC测 定用菌悬液。 0022 取ITO电极， 将其切割成0.5*5.Ocm的条状， 分别用丙酮、 无水乙醇、 二次蒸馏水洗 净吹干备用。将阿霉素溶液 15ul 滴于电极上， 使其在 0.5*0.5cm 的面积上铺展， 加入对电 极和参比电极， 得到 DPV 曲线。此曲线作为对比试验中的空白试验。 0023 取已调好浓度的菌液 lOul 滴于电极上， 随后滴加 lOul 浓度为 4*10-4mol/l 的探 针溶液， 得到相关电活性分子探针与不同菌作用后的差分脉冲伏安曲线。由曲线看出不同 菌种的峰值处在不同的位置， 其间相差的大小足以用肉眼看出。在不同菌种的作用下得到 的电活性探针分子的相关峰电流和峰电位也有较明显的差异。 同没有菌液的空白试验相比 较， 峰的位置以及大小有明显的改变。 说 明 书 CN 104388528 A 5 。