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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410696261.1 (22)申请日 2014.11.26 CCTCC NO ： M2014461 2014.10.09 C12N 1/20(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (71)申请人 湖南农业大学 地址 410028 湖南省长沙市芙蓉区隆平路湖 南农业大学 (72)发明人 陈东红 宋春竹 阮颖 黄勇 刘春林 (74)专利代理机构 北京科亿知识产权代理事务 所 ( 普通合伙 ) 11350 代理人 汤东凤 (54) 发明名称 一种黄连木种子产脂肪酶内生菌 PC1 及其分 离方法 (57) 摘要 本发明公。
2、开了一种黄连木种子产脂肪酶内生 菌 PC1 及其分离方法， 通过将种子用酒精、 氯化汞 处理后， 接种于牛肉膏蛋白胨培养得到内生菌， 用 液体 LB 发酵菌种， 将菌液接种于三丁酸甘油酯固 体培养基培养， 选取透明圈的菌种接种于液体 LB 培养基发酵， 取发酵液离心分离过滤后， 将滤液 用三丁酸甘油酯固体培养基培养， 筛选得到菌株 PC1。 菌株PC1平板划线得到单菌落， 外观呈白色， 生长初期表明湿润光滑， 随后边缘出现褶皱并变 干 ； 革兰氏染色呈阳性， 在电子显微镜下观察菌 体呈杆状。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申。
3、请 权利要求书1页 说明书5页 附图4页 (10)申请公布号 CN 104388353 A (43)申请公布日 2015.03.04 CN 104388353 A 1/1 页 2 1. 一种黄连木种子产脂肪酶内生菌 PC1， 其特征在于 ： 该菌株已于 2014 年 10 月 9 日保 藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为 ： CCTCC M 201446。 2.根据权利要求1所述的黄连木种子产脂肪酶内生菌PC1， 其特征在于 ： 所述的黄连木 种子产脂肪酶内生菌 PC1 脂肪酶的核苷酸全长序列如 SEQ ID NO.1 所示。 3.根据权利要求1所述的黄连木种子产脂肪酶内生菌PC1， 其。
4、特征在于 ： 所述的PC1菌 株平板划线得到单菌落， 外观呈白色， 生长初期表明湿润光滑， 随后边缘出现褶皱并变干 ； 革兰氏染色呈阳性， 在电子显微镜下观察菌体呈杆状。 4. 权利要求 1 所述的黄连木种子产脂肪酶内生菌 PC1 的分离方法， 其特征在于 ： 包含 以下步骤 ： 1) 选取新鲜健康的黄连木果实， 物理去除坚硬的果皮后， 从中挑选出完好无损的种子 在至少20倍体积的75酒精中浸泡10min， 0.1氯化汞中浸泡10min， 用无菌水清洗5次， 每次 1min ； 2) 将 5 枚经消毒的黄连木种子放入无菌研钵中， 加入 500L 无菌水研磨成糊状， 加 入无菌水稀释至 5mL，。
5、 取 100L 稀释液接种于牛肉膏蛋白胨培养基上， 在 28条件下培养 3 7 天， 得到内生细菌， 平板划线纯化后 4穿刺保存 ； 3) 将获得的菌株接种于 5mL 液体 LB， 28， 150rpm 培养过夜， 取 2L 菌液点于三丁酸 甘油酯固体培养基， 48h后选取菌落周围有明显透明圈的菌株， 再次接种于5mL液体LB培养 基中， 28， 150rpm 震荡发酵 48h ； 4)取1mL发酵液于10000rpm离心1min后， 将上清液过滤， 取滤液于打好孔的三丁酸甘 油酯固体培养基的孔内， 28培养 48h 后依据透明圈的直径大小， 筛选得到一株产脂肪酶 的优势菌株 PC1。 5.根。
6、据权利要求4所述的分离方法， 其特征在于 ： 所述的牛肉膏蛋白胨培养基为 ： 牛肉 膏 3g， NaCl 5g， 蛋白胨 10g， 水 1L， PH7.4 7.6。 6. 根据权利要求 4 所述的分离方法， 其特征在于 ： 所述的三丁酸甘油酯固体培养基为 ： 蛋白胨 10g/L， 酵母浸膏 5g/L， NaCl 5g/L， 琼脂 18g/L， pH 8.0， 三丁酸甘油酯乳化液 2。 7. 根据权利要求 6 所述的分离方法， 其特征在于 ： 所述的三丁酸甘油酯乳化液为三丁 酸甘油酯与 4阿拉伯树胶溶液体积比 1:3 在无菌条件下乳化至少 5min。 权 利 要 求 书 CN 104388353。
7、 A 2 1/5 页 3 一种黄连木种子产脂肪酶内生菌 PC1 及其分离方法 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 具体涉及一种黄连木种子产脂肪酶内生菌 PC1 及其分 离方法。 背景技术 0002 黄连木(Pistacia chinensis Bunge)又名楷木、 黄楝、 药木等， 系漆树科黄连木属 落叶乔木。黄连木籽含油 49.3， 不饱和脂肪酸高达 82.4， 是一种优良的野生油料资源， 特别是生产生物柴油的理想木本油料。 0003 植物内生菌 (endophyte) 是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健 康植物的各种组织和器官内部或细胞间隙的真菌、 细菌或放线菌， 。
8、被感染的宿主植物 ( 至 少是暂时 ) 不表现出外在症状。植物内生菌广泛存在于已研究过的所有植物中， 已在农业、 医药和环境保护等方面有着重大应用价值。但至今未见有关于黄连木内生菌的报道。 0004 脂肪酶(Lipase,EC3.1.1.3)即三酰基甘油酰基水解酶， 是一类能在水-油界面催 化甘油三酯水解， 而且在非水相介质中可催化酯合成反应的酶。脂肪酶普遍存在于动植物 和微生物体内， 但微生物源脂肪酶具有更宽的反应 pH、 适宜温度范围和更强的底物专一性 和立体选择性， 因而在酶学理论研究和实际应用中具有更加突出的地位。 发明内容 0005 本发明旨在提供一种黄连木种子产脂肪酶内生菌 PC1。
9、 及其分离方法， 通过对其中 产脂肪酶的菌株进行的选育， 得到优势菌株， 并对其酶学性进行研究。 0006 本发明通过以下技术方案实现 ： 0007 一种黄连木种子产脂肪酶内生菌 PC1， 该菌株已进行保藏， 保藏单位 ： 中国典型培 养物保藏中心， 地址 ： 湖北省武汉市洪山区八一路， 武汉大学， 中国典型培养物保藏中心 ； 保藏日期 ： 2014 年 10 月 9 日 ； 保藏编号为 ： CCTCC M 2014461。 0008 所述的黄连木种子产脂肪酶内生菌 PC1 脂肪酶的核苷酸全长序列如 SEQ ID NO.1 所示。 0009 所述的 PC1 菌株平板划线得到单菌落， 外观呈白色。
10、， 生长初期表明湿润光滑， 随后 边缘出现褶皱并变干 ； 革兰氏染色呈阳性， 在电子显微镜下观察菌体呈杆状。 0010 一种黄连木种子产脂肪酶内生菌 PC1 及其分离方法， 具体通过以下步骤完成 ： 0011 1) 选取新鲜健康的黄连木果实， 物理去除坚硬的果皮后， 从中挑选出完好无损的 种子在至少 20 倍体积的 75酒精中浸泡 10min， 0.1氯化汞中浸泡 10min， 用无菌水清洗 5 次， 每次 1min ； 0012 2) 将 5 枚经消毒的黄连木种子放入无菌研钵中， 加入 500L 无菌水研磨成糊状， 加入无菌水稀释至 5mL， 取 100L 稀释液接种于牛肉膏蛋白胨培养基上，。
11、 在 28条件下培 养 3 7 天， 得到内生细菌， 平板划线纯化后 4穿刺保存 ； 0013 3) 将获得的菌株接种于 5mL 液体 LB， 28， 150rpm 培养过夜， 取 2L 菌液点于三 说 明 书 CN 104388353 A 3 2/5 页 4 丁酸甘油酯固体培养基， 48h后选取菌落周围有明显透明圈的菌株， 再次接种于5mL液体LB 培养基中， 28， 150rpm 震荡发酵 48h ； 0014 4)取1mL发酵液于10000rpm离心1min后， 将上清液过滤， 取滤液于打好孔的三丁 酸甘油酯固体培养基的孔内， 28培养 48h 后依据透明圈的直径大小， 筛选得到一株产脂。
12、 肪酶的优势菌株 PC1。 0015 所述的牛肉膏蛋白胨培养基为 ： 牛肉膏 3g/L， NaCl 5g/L， 蛋白胨 10g/L， pH 7.4 7.6。 0016 所述的三丁酸甘油酯固体培养基为 ： 蛋白胨 10g/L， 酵母浸膏 5g/L， NaCl 5g/L， 琼 脂 18g/L， pH 8.0， 三丁酸甘油酯乳化液 2， 所述的三丁酸甘油酯乳化液 ： 三丁酸甘油酯与 4阿拉伯树胶溶液体积比 1:3 在无菌条件下乳化至少 5min。 0017 本发明方法得到的菌株 PC1 可以分泌产脂肪酶， 该酶对多种有机溶剂有耐受性， 其中甲醇和丙酮对该酶有明显促进作用， 最适 pH 为 8.0， 。
13、且有广谱的 pH 稳定性 ； 最适作用 温度为 35， 但不耐高温， 在 50时基本失活 ； 与短小芽孢杆菌 L5 脂肪酶有最近的亲缘关 系。 0018 本发明的有益效果为首次从黄连木种子里分离得到内生菌， 通过对其中产脂肪酶 的菌株进行的选育， 得到一优势菌株 PC1， 为其酶学性质的研究提供了技术支持。 附图说明 0019 图 1 是本发明菌株 PC1 的革兰氏染色图 ； 0020 图 2 是本发明菌株 PC1 的 16S rDNA 序列的系统进化分析 ； 0021 图 3 是本发明菌株 PC1 所产脂肪酶的最适 pH 和 pH 稳定性 ； 0022 图 4 是本发明菌株 PC1 所产脂肪。
14、酶的最适温度和热温定性 ； 0023 图 5 是表面活性剂对本发明菌株 PC1 所产脂肪酶活性的影响 ； 0024 图 6 是有机溶剂对本发明菌株 PC1 所产脂肪酶活性的影响 ； 0025 图 7 是本发明菌株 PC1 脂肪酶的核苷酸和推测的氨基酸序列 ； 具体实施方式 0026 下面结合实施例对本发明技术方案作进一步的说明， 以下所述， 仅是对本发明的 较佳实施例而已， 并非对本发明做其他形式的限制， 任何熟悉本专业的技术人员可能利用 上述揭示的技术内容加以变更或改型为同等变化的等效实施例。 凡是未脱离本发明方案内 容， 依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、 等同变化与改型。
15、， 均落在本 发明的保护范围内。 0027 实施例 1 0028 一种黄连木种子产脂肪酶内生菌 PC1 及其分离方法， 具体通过以下步骤完成 ： 0029 1) 选取新鲜健康的黄连木果实， 物理去除坚硬的果皮后， 从中挑选出完好无损的 种子在至少20倍体积的75酒精中浸泡10min， 0.1氯化汞中浸泡10min， 中间不时摇动， 然后用无菌水清洗 5 次， 每次 1min ； 0030 2) 将 5 枚经消毒的黄连木种子放入无菌研钵中， 加入 500L 无菌水研磨成糊状， 然后加入无菌水稀释到 5mL， 取 100L 稀释液接种于牛肉膏蛋白胨培养基 ( 牛肉膏 3g， 说 明 书 CN 10。
16、4388353 A 4 3/5 页 5 NaCl 5g， 蛋白胨 10g， 水 1L， PH 7.4 7.6) 上， 同时取最后一次清洗的无菌水和未研磨的 种子作为负对照， 在 28条件下培养 3 7 天， 得到内生细菌， 平板划线纯化后 4穿刺保 存 ； 试验重复 3 次， 每次设置 3 个平行组 ； 0031 3) 将获得的菌株接种于 5mL 液体 LB， 28， 150rpm 培养过夜， 取 2L 菌液点于三 丁酸甘油酯固体培养基上， 48h 后选取菌落周围有明显透明圈的菌株， 再次接种于 5mL 液体 LB 培养基中， 28， 150rpm 震荡发酵 48h ； 0032 4)取1mL。
17、发酵液于10000rpm离心1min后， 将上清液用无菌滤膜过滤， 取滤液于打 好孔的三丁酸甘油酯固体培养基的孔内， 28培养 48h 后依据透明圈的直径大小， 筛选得 到一株产脂肪酶的优势菌株， 暂命名为 PC1。 0033 获得的 PC1 菌株平板划线得到单菌落， 外观呈白色， 生长初期表明湿润光滑， 随后 边缘出现褶皱并变干 ； 革兰氏染色呈阳性， 在电子显微镜下观察菌体呈杆状 ( 图 1)。 0034 该 PC1 菌株已进行保藏， 保藏单位 ： 中国典型培养物保藏中心， 地址 ： 湖北省武汉 市洪山区八一路， 武汉大学， 中国典型培养物保藏中心 ； 保藏日期 ： 2014 年 10 月。
18、 9 日 ； 保藏 号为 ： CCTCC M 2014461。 0035 通过利用细菌 16S rDNA 通用引物进行 PCR 扩增并测序得到 PC1 菌株的 16S rDNA 的部分核苷酸序列， 借助 Clustalw 和 MEGA5.1 软件对 PC1 菌株的 16S rDNA 序列进化系统 分析(图2)， 显示其与Bacillus pumilus S7具有最近的亲缘关系， 表明该菌属于短小芽孢 杆菌 Bacillus pumilus， 因此将该菌命名为 Bacillus pumilus PC1。 0036 实施例 2 利用对硝基苯酚法测定 PC1 所产脂肪酶的酶学性质 0037 1. 利。
19、用对硝基苯酚法测定脂肪酶活力 0038 分别配制溶液 A30mg 对硝基苯棕榈酸酯 (p-NPP) 溶于 10mL 异丙醇 和溶液 B50mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)。将溶液 A 与 B 按 1:18 比例混匀并取 1.9mL 于试管中， 加 入上清粗酶液0.1mL(设高温灭活的粗酶液为负对照)， 于28准确反应10min后， 加入1mL 10的 SDS 溶液终止反应。分光光度计 OD410nm 下测定催化产生的对硝基酚 (pNP) 的吸收 值。 0039 脂肪酶 1 个酶活单位定义 ： 在 pH8.0， 28条件下， 以每分钟释放 1mol pNP 所需 的酶量， 酶活计算。
20、公式 ： 0040 A (Al A0K+C0)Vln/(V2t) 0041 式中， A:样品酶活(U/mL) ； A1:样品酶液的吸光度OD值 ； A0:对应酶液的空白吸光 度 OD 值 ； K: 对硝基酚标准曲线的斜率 ； C0: 对硝基酚标准曲线的截距 ； n: 稀释倍数 ； Vl: 反 应液的体积 /mL ； V2: 酶液的体积 /mL ； t: 反应时间 /min。 0042 2. 脂肪酶的酶学性质 0043 把过夜培养的 PC1 菌液按 1接种量接种在 50mL 液体 LB 培养基中， 150rpm 发酵 48h。将发酵液经 5000rpm 离心 15min， 取上清液在不同的 pH。
21、 环境下反应 10min 后测酶的最 适 pH， 让粗酶液与等体积的不同 pH 的缓冲液混合， 4放置 24h 后测剩余酶活， 确定酶的 pH 稳定性。将粗酶液在不同的温度下反应 10min 后测酶的最适作用温度 ； 让粗酶液在不同的 温度下放置 1h 后测剩余酶活， 确定酶的温度稳定性。将粗酶液与等体积的不同表面活性剂 或有机溶剂混匀， 28， 150rpm 摇动 30min 后检测剩余酶活。 0044 结果表明， 通过利用对硝基苯酚法测定 PC1 菌株所产脂肪酶的酶学性质， 表明该 说 明 书 CN 104388353 A 5 4/5 页 6 PC1菌株所产脂肪酶的最适pH为8.0且有广谱。
22、的pH稳定性(图3) ； 最适作用温度为35， 但不耐高温， 在 50时基本失活 ( 图 4)。表面活性剂显著抑制该酶活性 ( 图 5)。该酶对多 种有机溶剂有耐受性， 其中甲醇和丙酮对该酶有明显促进作用 ( 图 6)。 0045 实施例 3PC1 脂肪酶基因的克隆 0046 通过对 NCBI GenBank 数据库中已公布的部分短小芽孢杆菌脂肪酶的核苷酸序 列使用 Clustalw 软件进行多重序列比对分析， 确定严格保守的区段用于设计扩增脂肪酶 基因全长的正反向引物 (P1： TAG AGTCGTATAAGATGAATAAGG 和 P2： TTAATTCGTATTCTGTCCT CCG)。。
23、PCR 扩增体系 (50L) ：Buffer 10L、 d NTP Mixture(2.5mM each)4L、(2.5U/L)0.5L、 ddH2032.5L、 引物 P1和 P2(10M) 各 1L、 PC1基因组DNA 1L。 PCR反应条件 ： 94预变性4min ； 95变性20s， 58退火30s， 72延伸 1min， 共 30 个循环 ； 72延伸 5min。扩增产物送往公司测序。 0047 结果表明 ： 通过同源克隆得到 PC1 脂肪酶的核苷酸全长序列， 如 SEQ ID NO.1 所 示， 经系统进化分析进一步表明本发明鉴定的短小芽孢杆菌PC1脂肪酶与NCBI公布的短小 芽孢杆菌 L5脂肪酶有最近的亲缘关系 ( 图 7)， 但序列仍有区别。 0048 说 明 书 CN 104388353 A 6 5/5 页 7 说 明 书 CN 104388353 A 7 1/4 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104388353 A 8 2/4 页 9 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 104388353 A 9 3/4 页 10 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 104388353 A 10 4/4 页 11 图 7 说 明 书 附 图 CN 104388353 A 11 。