杂环化合物及其用途.pdf

本发明提供取代的双环杂芳基和包含它们的组合物，其用于治疗一般炎症、关节炎、风湿性疾病、骨关节炎、炎症性肠病症、炎症性眼病症、炎症性或不稳定膀胱病症、银屑病、含炎症性组分的皮肤病、慢性炎症性病症，包括但不限于自身免疫疾病如全身性红斑狼疮(SLE)、重肌无力症、类风湿性关节炎、急性播散性脑脊髓炎、特发性血小板减少性紫癜、多发性硬化、休尼格综合征和自身免疫性溶血性贫血、过敏性病状(包括所有形式的过敏反应)；本发明还实现用于治疗p110活性介导、依赖或相关的癌症的方法，所述癌症包括但不限于白血病，如急性骨髓白血病(AML)、骨髓发育不良综合症(MDS)、骨髓增生性疾病(MPD)、慢性骨髓白血病(CML)、T细胞急性成淋巴细胞白血病(T-ALL)、B细胞急性成淋巴细胞白血病(B-ALL)、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、B细胞淋巴瘤和实体瘤，如乳癌。

权利要求书
1.   一种化合物，其选自
；
；
；
；
；
；以及

或任何其药学上可接受的盐。

2.   根据权利要求1所述的化合物，其具有如下结构

或任何其药学上可接受的盐。

3.   根据权利要求1所述的化合物，其具有如下结构：

或任何其药学上可接受的盐。

4.   根据权利要求1所述的化合物，其具有如下结构：

或任何其药学上可接受的盐。

5.   根据权利要求1所述的化合物，其具有如下结构：

或任何其药学上可接受的盐。

6.   根据权利要求1所述的化合物，其具有如下结构：

或任何其药学上可接受的盐。

7.   根据权利要求1所述的化合物，其具有如下结构：

或任何其药学上可接受的盐。

8.   根据权利要求1所述的化合物，其具有如下结构：

或任何其药学上可接受的盐。

9.   一种药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求2所述的化合物；以及药学上可接受的赋形剂或载体。

10.   一种药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求3所述的化合物；以及药学上可接受的赋形剂或载体。

11.   一种药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求4所述的化合物；以及药学上可接受的赋形剂或载体。

12.   一种药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求5所述的化合物；以及药学上可接受的赋形剂或载体。

13.   一种药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求6所述的化合物；以及药学上可接受的赋形剂或载体。

14.   一种药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求7所述的化合物；以及药学上可接受的赋形剂或载体。

15.   一种药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求8所述的化合物；以及药学上可接受的赋形剂或载体。

16.   根据权利要求2所述的化合物，其用于治疗选自以下各项的疾病：类风湿性关节炎、强直性脊椎炎、骨关节炎、银屑病关节炎、银屑病、炎症性疾病和自身免疫疾病、炎症性肠病症、炎症性眼病症、炎症性或不稳定膀胱病症、含炎症性组分的皮肤病、慢性炎症性病状、自身免疫疾病、全身性红斑狼疮(SLE)、重肌无力症、类风湿性关节炎、急性播散性脑脊髓炎、特发性血小板减少性紫癜、多发性硬化、休尼格综合征和自身免疫性溶血性贫血、过敏性病状和过敏反应。

17.   根据权利要求3所述的化合物，其用于治疗选自以下各项的疾病：类风湿性关节炎、强直性脊椎炎、骨关节炎、银屑病关节炎、银屑病、炎症性疾病和自身免疫疾病、炎症性肠病症、炎症性眼病症、炎症性或不稳定膀胱病症、含炎症性组分的皮肤病、慢性炎症性病状、自身免疫疾病、全身性红斑狼疮(SLE)、重肌无力症、类风湿性关节炎、急性播散性脑脊髓炎、特发性血小板减少性紫癜、多发性硬化、休尼格综合征和自身免疫性溶血性贫血、过敏性病状和过敏反应。

18.   根据权利要求4所述的化合物，其用于治疗选自以下各项的疾病：类风湿性关节炎、强直性脊椎炎、骨关节炎、银屑病关节炎、银屑病、炎症性疾病和自身免疫疾病、炎症性肠病症、炎症性眼病症、炎症性或不稳定膀胱病症、含炎症性组分的皮肤病、慢性炎症性病状、自身免疫疾病、全身性红斑狼疮(SLE)、重肌无力症、类风湿性关节炎、急性播散性脑脊髓炎、特发性血小板减少性紫癜、多发性硬化、休尼格综合征和自身免疫性溶血性贫血、过敏性病状和过敏反应。

19.   根据权利要求5所述的化合物，其用于治疗选自以下各项的疾病：类风湿性关节炎、强直性脊椎炎、骨关节炎、银屑病关节炎、银屑病、炎症性疾病和自身免疫疾病、炎症性肠病症、炎症性眼病症、炎症性或不稳定膀胱病症、含炎症性组分的皮肤病、慢性炎症性病状、自身免疫疾病、全身性红斑狼疮(SLE)、重肌无力症、类风湿性关节炎、急性播散性脑脊髓炎、特发性血小板减少性紫癜、多发性硬化、休尼格综合征和自身免疫性溶血性贫血、过敏性病状和过敏反应。

20.   根据权利要求6所述的化合物，其用于治疗选自以下各项的疾病：类风湿性关节炎、强直性脊椎炎、骨关节炎、银屑病关节炎、银屑病、炎症性疾病和自身免疫疾病、炎症性肠病症、炎症性眼病症、炎症性或不稳定膀胱病症、含炎症性组分的皮肤病、慢性炎症性病状、自身免疫疾病、全身性红斑狼疮(SLE)、重肌无力症、类风湿性关节炎、急性播散性脑脊髓炎、特发性血小板减少性紫癜、多发性硬化、休尼格综合征和自身免疫性溶血性贫血、过敏性病状和过敏反应。

21.   根据权利要求7所述的化合物，其用于治疗选自以下各项的疾病：类风湿性关节炎、强直性脊椎炎、骨关节炎、银屑病关节炎、银屑病、炎症性疾病和自身免疫疾病、炎症性肠病症、炎症性眼病症、炎症性或不稳定膀胱病症、含炎症性组分的皮肤病、慢性炎症性病状、自身免疫疾病、全身性红斑狼疮(SLE)、重肌无力症、类风湿性关节炎、急性播散性脑脊髓炎、特发性血小板减少性紫癜、多发性硬化、休尼格综合征和自身免疫性溶血性贫血、过敏性病状和过敏反应。

22.   根据权利要求8所述的化合物，其用于治疗选自以下各项的疾病：类风湿性关节炎、强直性脊椎炎、骨关节炎、银屑病关节炎、银屑病、炎症性疾病和自身免疫疾病、炎症性肠病症、炎症性眼病症、炎症性或不稳定膀胱病症、含炎症性组分的皮肤病、慢性炎症性病状、自身免疫疾病、全身性红斑狼疮(SLE)、重肌无力症、类风湿性关节炎、急性播散性脑脊髓炎、特发性血小板减少性紫癜、多发性硬化、休尼格综合征和自身免疫性溶血性贫血、过敏性病状和过敏反应。

说明书杂环化合物及其用途
本申请要求于2012年4月4日提交的美国临时申请号61/620,270的权益，所述临时申请以引用的方式并入本文。
本发明大体上涉及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)，并且更具体来说涉及PI3K活性的选择性抑制剂和这些物质的使用方法。
发明背景
通过3′-磷酸化磷酸肌醇进行的细胞信号传导牵涉到了多个细胞过程，例如恶性转化、生长因子信号传导、炎症和免疫性(有关评述，参见Rameh等，J.Biol Chem，274：8347-8350(1999))。负责产生这些磷酸化信号传导产物的酶，即磷脂酰肌醇3-激酶(PI 3激酶；PI3K)最初被鉴别为与病毒癌蛋白和生长因子受体酪氨酸激酶有关的活性，PI3K使磷脂酰肌醇(PI)和其磷酸化衍生物在肌醇环3′-羟基处发生磷酸化(Panayotou等，Trends Cell Biol 2：358-60(1992))。
当用多种刺激物处理细胞时，PI 3激酶活化的主要产物磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(PIP3)的水平将增加。此过程包括通过大多数生长因子受体以及许多炎症性刺激物、激素、神经递质和抗原进行的信号传导，并且因此PI3K活化代表着与哺乳动物细胞表面受体活化有关的一个(如果不是最普遍的话)信号转导事件(Cantley，Science 296：1655-1657(2002)；Vanhaesebroeck等，Annu.Rev.Biochem，70：535-602(2001))。因此，PI 3激酶活化涉及各式各样的细胞反应，包括细胞生长、迁移、分化和细胞凋亡(Parker等，Current Biology，5：577-99(1995)；Yao等，Science，267：2003-05(1995))。尽管PI 3激酶活化后产生的磷酸化脂质的下游目标尚未得到完全表征，但已知含有 pleckstrin同源(PH)域和FYVE-锌指域的蛋白质当结合各种磷脂酰肌醇脂质时将活化(Sternmark等，J Cell Sci，112：4175-83(1999)；Lemmon等，Trends Cell Biol，7：237-42(1997))。已经在免疫细胞信号传导情况下研究两组含有PH域的PI3K效应子，即酪氨酸激酶TEC家族和AGC家族丝氨酸/苏氨酸激酶的成员。对PtdIns(3，4，5)P3具有明显选择性的含有PH域的Tec家族成员包括Tec、Btk、Itk和Etk。PH与PIP3的结合对Tec家族成员的酪氨酸激酶活性至关重要(Schaeffer和Schwartzberg，Curr.Opin.Immunol.12：282-288(2000))。由PI3K调控的AGC家族成员包括磷酸肌醇依赖性激酶(PDK1)、AKT(也称为PKB)和蛋白激酶C(PKC)的某些同种型和S6激酶。AKT有三种同种型，并且AKT活化与PI3K依赖性增殖和存活信号密切相关。AKT活化取决于PDK1的磷酸化作用，而PDK1也具有3-磷酸肌醇选择性PH域以将其募集于膜，并在此处与AKT相互作用。其它重要的PDK1底物有PKC和S6激酶(Deane和Fruman，Annu.Rev.Immunol.22_563-598(2004))。在体外，蛋白激酶C(PKC)的一些同种型直接被PIP3活化。(Burgering等，Nature，376：599-602(1995))。
目前，已经根据底物特异性，将PI 3激酶家族分成三个类别。第I类PI3K可以使磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰肌醇-4-磷酸和磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(PIP2)磷酸化，分别产生磷脂酰肌醇-3-磷酸(PIP)、磷脂酰肌醇-3，4-二磷酸和磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸。第II类PI3K使PI和磷脂酰肌醇-4-磷酸磷酸化，而第III类PI3K只能使PI磷酸化。
对PI 3激酶进行的初始纯化和分子克隆揭露，所述激酶是由p85和p110亚基组成的异二聚体(Otsu等，Cell，65：91-104(1991)；Hiles等，Cell，70：419-29(1992))。自此，已经鉴别出四种不同的第I类PI3K，称为PI3Kα、β、δ和γ，各自由不同的110kDa催化亚基和调控亚基组成。更具体来说，三个催化亚基，即p110α、p110β和p110δ，各自与同一调控亚基p85相互作用；而p110γ与不同的调控亚基p101相互作用。如下文所述，这些PI3K在人类细胞和组织中的表达模式也各不相同。尽管近期已经积累了很多有关PI 3激酶的细胞功能的一般 信息，但个别同种型所起的作用还未完全了解。
研究人员曾描述过牛p110α的克隆。这一蛋白质被鉴别为与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)蛋白Vps34p有关，所述Vps34p是空泡蛋白加工中所涉及的一种蛋白质。经显示，重组p110α产物还在经过转染的COS-1细胞中与p85α缔合，产生PI3K活性。参见Hiles等，Cell，70，419-29(1992)。
Hu等，Mol Cell Biol，13：7677-88(1993)中描述了第二种人p110同种型(称为p110β)的克隆。据悉，此同种型在细胞中与p85缔合并且普遍表达，因为已经在多个人类和小鼠组织中以及人脐静脉内皮细胞、Jurkat人白血病T细胞、293人胚肾细胞、小鼠3T3成纤维细胞、HeLa细胞和NBT2大鼠膀胱癌细胞中发现了p110β mRNA。这种广泛表达表明，此同种型对于信号传导路径很重要。
Chantry等，J Biol Chem，272：19236-41(1997)中描述了PI 3激酶p110δ同种型的鉴别。据观察，人p110δ同种型是按组织限制性方式表达。它在淋巴细胞和淋巴组织中以高水平表达，并且已显示在免疫系统中的PI 3激酶介导的信号传导中起到关键作用(Al-Alwan等JI178：2328-2335(2007)；Okkenhaug等JI，177：5122-5128(2006)；Lee等PNAS，103：1289-1294(2006))。P110δ还显示在乳腺细胞、黑素细胞和内皮细胞中以较低水平表达(Vogt等Virology，344：131-138(2006)，并且牵涉到赋予乳癌细胞选择性迁移特性(Sawyer等Cancer Res.63：1667-1675(2003))。有关P110δ同种型的细节也可参见美国专利号5,858,753；5,822,910；和5,985,589。也参见Vanhaesebroeck等，Proc Nat.Acad Sci USA，94：4330-5(1997)，以及国际公布WO97/46688。
在PI3Kα、β和δ亚型每一者中，p85亚基通过其SH2域与目标蛋白质中的磷酸化酪氨酸残基(存在于适当的序列环境中)相互作用，将PI 3激酶局限在质膜(Rameh等，Cell，83：821-30(1995))。已经鉴别 出p85的五种同种型(p85α、p85β、p55γ、p55α和p50α)，它们由三种基因编码。Pik3r1基因的替代性转录物将编码p85α、p55α和p50α蛋白质(Deane和Fruman，Annu.Rev.Immunol.22：563-598(2004))。p85α普遍表达，而p85β主要见于脑和淋巴组织中(Volinia等，Oncogene，7：789-93(1992))。p85亚基与PI 3激酶的p110α、β或δ催化亚基缔合看起来是这些酶的催化活性和稳定性所必需的。此外，结合Ras蛋白质还可以调控PI 3激酶活性。
克隆p110γ也进一步揭露了PI3K酶家族内的复杂性(Stoyanov等，Science，269：690-93(1995))。p110γ同种型与p110α和p110β密切相关(催化域具有45％到48％同一性)，但应注意到，其不能利用p85作为目标亚基。而是p110γ结合p101调控亚基，所述p101调控亚基也结合于异三聚体G蛋白的βγ亚基。PI3Kγ的p101调控亚基最初是在猪体内克隆得到，随后鉴别出人直向同源物(Krugmann等，J Biol Chem，274：17152-8(1999))。已知p101N末端区与p110γN末端区之间的相互作用通过Gβγ活化PI3Kγ。近来已鉴别出p101同源物，即结合p110γ的p84或p87PIKAP(87kDa的PI3Kγ衔接蛋白)(Voigt等JBC，281：9977-9986(2006)；Suire等Curr.Biol.15：566-570(2005))。p87PIKAP中结合p110γ和Gβγ的区域与p101同源，并且还介导G蛋白偶合受体下游p110γ的活化。与p101不同，p87PIKAP在心脏中高度表达，并且对于PI3Kγ心脏功能至关重要。
组成型活性PI3K多肽描述于国际公布WO 96/25488中。此公布披露了嵌合融合蛋白的制备方法，在所述方法中，将p85中称为inter-SH2(iSH2)区的102个残基的片段通过连接子区与鼠类p110的N末端融合。p85 iSH2域似乎能够以与完整p85相当的方式活化PI3K活性(Klippel等，Mol Cell Biol，14：2675-85(1994))。
因此，PI 3激酶可通过其氨基酸特性或通过其活性确定。这一生长的基因家族的其它成员包括关系更远的脂质和蛋白激酶，包括酿酒酵母的Vps34 TOR1和TOR2(和其哺乳动物同系物，如FRAP和 mTOR)、共济失调毛细血管扩张症基因产物(ATR)和DNA依赖性蛋白激酶的催化亚基(DNA-PK)。一般参见Hunter，Cell，83：1-4(1995)。
PI 3激酶还涉及白细胞活化的多个方面。经显示，p85相关性PI3激酶活性与CD28的细胞质域以物理方式缔合，而CD28是响应抗原来活化T细胞的重要共刺激分子(Pages等，Nature，369：327-29(1994)；Rudd，Immunity，4：527-34(1996))。通过CD28活化T细胞将降低抗原活化的阈值，并增加增殖反应的量值和持续时间。这些作用牵涉到包括白细胞介素-2(IL2；一种重要的T细胞生长因子)在内众多基因转录的增加(Fraser等，Science，251：313-16(1991))。CD28突变使其不再与PI 3激酶相互作用将导致无法起始IL2的产生，从而表明了PI 3激酶在T细胞活化中的关键作用。
针对酶家族个别成员的特异性抑制剂为了解每种酶的功能提供了宝贵工具。LY294002和渥曼青霉素(wortmannin)两种化合物已经被广泛用作PI 3激酶抑制剂。然而，这些化合物是非特异性PI3K抑制剂，因为其不能辨识第I类PI 3激酶的四个成员。例如，渥曼青霉素对各种第I类PI 3激酶中每一者的IC50值都在1nM至10nM的范围内。类似地，LY294002对这些PI 3激酶中每一者的IC50值都为约1μM(Fruman等，Ann Rev Biochem，67：481-507(1998))。因此，这些化合物在研究个别第I类PI 3激酶中所起的作用是有限的。
根据使用渥曼青霉素进行的研究，有证据证实PI 3激酶的功能也是通过G蛋白偶合受体进行白细胞信号传导的某些方面所必需的(Thelen等，Proc Natl Acad Sci USA，91：4960-64(1994))。此外，研究还显示，渥曼青霉素和LY294002阻止嗜中性粒细胞迁移和超氧化物释放。然而，由于这些化合物不能辨识PI3K的各个同种型，从这些研究还不能了解这些现象中涉及到哪一种或哪些特定的PI3K同种型，以及不同第I类PI3K酶的哪些功能一般会在正常和患病组织中起作用。到目前为止，几种PI3K同种型在大多数组织中的共表达混淆了分开每种酶的活性的成果。
近来，通过开发允许进行同种型特异性基因敲除和激酶死亡(kinase dead)基因敲入小鼠研究的基因改造小鼠，以及开发针对一些不同同种型的选择性较强的抑制剂，在分离各种PI3K同工酶的活性方面已经取得了进展。已经产生P110α和p110β基因敲除小鼠并且它们都具有胚胎致死性，而从这些小鼠能获得的有关p110α和β表达和功能的信息很少(Bi等，Mamm.Genome，13：169-172(2002)；Bi等，J.Biol.Chem.274：10963-10968(1999))。最近，通过在ATP结合袋的DFG基元中进行单点突变(p110αD933A)产生了p110α激酶死亡基因敲入小鼠，这种突变将削弱激酶活性，但保留了突变p110α激酶的表达。与基因敲除小鼠相比，基因敲入法保留了信号传导的复杂化学计量、支架功能，并且在模拟小分子方法方面比基因敲除小鼠更理想。与p110αKO小鼠类似，p110αD933A纯合子小鼠也是胚胎致死的。然而，杂合子小鼠可存活和繁殖，但呈现明显减弱的通过胰岛素受体底物(IRS)蛋白(胰岛素、类胰岛素生长因子-1和瘦素作用的关键介体)进行的信号传导。在杂合子中，对这些激素反应性的缺乏将导致高胰岛素血症、葡萄糖不耐受、摄食过量、脂肪增加和总体生长减慢(Foukas等，Nature，441：366-370(2006))。这些研究揭露了p110α作为IGF-1、胰岛素和瘦素信号传导的中间物的明确的非冗余的作用，这种作用是其它同种型无法取代的。我们将期待关于p110β激酶死亡基因敲入小鼠的描述以便进一步了解此同种型的功能(小鼠已经产生，但尚未公布；Vanhaesebroeck)。
已均产生P110γ基因敲除和激酶死亡基因敲入小鼠并且它们整体表现出相似的轻微表型，具有先天性免疫系统细胞迁移方面的主要缺点和胸腺发育T细胞的不足(Li等Science，287：1046-1049(2000)；Sasaki等Science，287：1040-1046(2000)；Patrucco等Cell，118：375-387(2004))。
与p110γ类似，已经产生PI3Kδ基因敲除和激酶死亡基因敲入小鼠，并且存活，同时具有轻微的类似表型。p110δD910A突变基因敲入小鼠证实了δ在B细胞发育和功能(其中边缘区B细胞和CD5+B1 细胞几乎不可检测到)以及B细胞和T细胞抗原受体信号传导中的重要作用(Clayton等J.Exp.Med.196：753-763(2002)；Okkenhaug等Science，297：1031-1034(2002))。研究人员已经深入研究了p110δD910A小鼠，并且阐明了δ在免疫系统中起到的不同作用。在p110δD910A中，T细胞依赖性和非T细胞依赖性免疫应答明显减弱，并且TH1(INF-γ)和TH2细胞因子(IL-4、IL-5)的分泌减少(Okkenhaug等，J.Immunol.177：5122-5128(2006))。近来也已经描述过在p110δ中存在突变的人类患者。患有先前未知病因的原发性B细胞免疫缺陷和γ-高球蛋白血症的台湾男孩在p110δ外显子24的密码子1021中存在单碱基对取代m.3256G变为A。这一突变导致在密码子1021处发生错义氨基酸取代(E变为K)，而所述氨基酸位于p110δ蛋白高度保守的催化域中。患者未鉴别出其它突变，而并且其表型与目前所研究的小鼠p110δ缺乏一致。(Jou等，Int.J.Immunogenet.33：361-369(2006))。
已经通过在所有第I类PI3激酶同种型方面取得的成就，开发出同种型选择性小分子化合物(Ito等，J.Pharm.Exp.Therapeut.，321：1-8(2007))。针对α的抑制剂是合乎需要的，因为已在若干实体瘤中鉴别出p110α中的突变；例如，α的扩增突变与50％的卵巢癌、子宫颈癌、肺癌和乳癌相关联，并且活化突变已描述在多于50％的肠癌和25％的乳癌中(Hennessy等Nature Reviews，4：988-1004(2005))。Yamanouchi开发出化合物YM-024，该化合物可均等地抑制α和δ，并且选择性分别是β和γ的8倍和28倍(Ito等，J.Pharm.Exp.Therapeut.，321：1-8(2007))。
血栓的形成涉及到P110β(Jackson等，Nature Med.11：507-514(2005))，并且之后认为对该同种型具有特异性的小分子抑制剂适用于涉及血栓病症的适应症(对于β，TGX-221：0.007uM；选择性是δ的14倍，并且选择性是γ和α的500倍多)(Ito等，J.Pharm.Exp.Therapeut.，321：1-8(2007))。
若干研究小组正在开发针对p110γ的选择性化合物作为用于自身 免疫疾病的免疫抑制剂(Rueckle等Nature Reviews，5：903-918(2006))。应注意，已显示AS 605240在小鼠类风湿性关节炎模型中有效(Camps等Nature Medicine，11：936-943(2005))并且延迟全身性红斑狼疮模型中疾病的发作(Barber等Nature Medicine，11：933-935(205))。
近来也描述了δ选择性抑制剂。选择性最强的化合物包括喹唑啉酮嘌呤抑制剂(PIK39和IC87114)。IC87114可在高纳摩尔浓度范围内(三位数)抑制p110δ，并且选择性是针对p110α的选择性的100倍多，是针对p110β的选择性的52倍，但缺乏对p110γ的选择性(约8倍)。它未表现出针对所测试的任何蛋白激酶的活性(Knight等Cell，125：733-747(2006))。使用δ选择性化合物或基因改造的小鼠(p110δD910A)已经显示，δ除了在B细胞和T细胞活化中起关键作用外，还部分涉及到嗜中性粒细胞迁移和预致敏的嗜中性粒细胞呼吸爆发，并导致抗原-IgE介导的肥大细胞脱粒部分阻断(Condliffe等，Blood，106：1432-1440(2005)；Ali等Nature，431：1007-1011(2002))。因此，p110δ是作为许多关键炎症性反应的重要介体出现，也已知其参与异常炎症性病况，包括但不限于自身免疫疾病和过敏症。为了支持这一观点，从使用遗传工具和药剂进行的研究得到了越来越多的p110δ目标验证数据。因此，使用δ选择性化合物IC 87114和p110δD910A小鼠，Ali等(Nature，431：1007-1011(2002))已证实δ在鼠类过敏性疾病模型中起到至关重要的作用。在不存在功能性δ的情况下，被动皮肤过敏反应(PCA)明显减少，并且可归因于过敏原-IgE诱导的肥大细胞活化和脱粒的减少。此外，已显示在使用卵清蛋白诱导的气道炎症得到的鼠类哮喘模型中，用IC 87114抑制δ可显著改善炎症和疾病(Lee等，FASEB，20：455-465(2006)。利用化合物得到的这些数据在不同研究小组使用相同的p110δD910A突变小鼠过敏性气道炎症模型中得到证实(Nashed等，Eur.J.Immunol.37：416-424(2007))。
迫切需要进一步表征PI3Kδ在炎症性环境和自身免疫环境中的功能。此外，对于PI3Kδ的了解需要进一步阐明p110δ与其调控亚基 和细胞中其它蛋白质的结构相互作用。还需要更具效力和选择性或特异性的PI3Kδ抑制剂，以便避免与同工酶p110α(胰岛素信号传导)和β(血小板活化)活性相关联的潜在毒性。具体说来，需要选择性或特异性PI3Kδ抑制剂来进一步探究所述同工酶的作用以及开发调节所述同工酶活性的优良药物。
概述
本发明包括一种在人类PI3Kδ方面具有改进的特性和生物活性的新型化合物。
详述
本发明的一方面涉及具有如下结构的化合物：


或任何其药学上可接受的盐。
本发明的另一方面涉及一种治疗PI3K介导的病状或病症的方法。
在某些实施方案中，PI3K介导的病状或病症选自类风湿性关节 炎、强直性脊椎炎、骨关节炎、银屑病关节炎、银屑病、炎症性疾病和自身免疫疾病。在其它实施方案中，PI3K介导的病状或病症选自心血管疾病、动脉粥样硬化、高血压、深静脉血栓形成、中风、心肌梗塞、不稳定绞痛、血栓栓塞、肺栓塞、溶解血栓疾病、急性动脉缺血、末梢血栓阻塞和冠状动脉病。在其它实施方案中，PI3K介导的病状或病症选自癌症、结肠癌、成胶质细胞瘤、子宫内膜癌、肝细胞癌、肺癌、黑色素瘤、肾细胞癌、甲状腺癌、细胞淋巴瘤、淋巴组织增生病症、小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌、神经胶质瘤、乳癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌和白血病。在又一实施方案中，PI3K介导的病状或病症选自II型糖尿病。在其它实施方案中，PI3K介导的病状或病症选自呼吸疾病、支气管炎、哮喘和慢性阻塞性肺病。在某些实施方案中，受试者是人类。
本发明的另一方面涉及治疗类风湿性关节炎、强直性脊椎炎、骨关节炎、银屑病关节炎、银屑病、炎症性疾病或自身免疫疾病，所述治疗包括施用根据任何上述实施方案的化合物的步骤。
本发明的另一方面涉及治疗类风湿性关节炎、强直性脊椎炎、骨关节炎、银屑病关节炎、银屑病、炎症性疾病和自身免疫疾病、炎症性肠病症、炎症性眼病症、炎症性或不稳定膀胱病症、含炎症性组分的皮肤病、慢性炎症性病状、自身免疫疾病、全身性红斑狼疮(SLE)、重肌无力症、类风湿性关节炎、急性播散性脑脊髓炎、特发性血小板减少性紫癜、多发性硬化、休尼格综合征(Sjoegren′s syndrome)和自身免疫性溶血性贫血、过敏性病状和过敏反应，所述治疗包括施用根据任何上述或下述实施方案的化合物的步骤。
本发明的另一方面涉及治疗p110δ活性介导、依赖或相关的癌症，所述治疗包括施用根据任何上述或下述实施方案的化合物的步骤。
本发明的另一方面涉及治疗选自以下的癌症：急性骨髓白血病、 骨髓发育不良综合征、骨髓增生性疾病、慢性骨髓白血病、T细胞急性成淋巴细胞白血病、B细胞急性成淋巴细胞白血病、非何杰金氏淋巴瘤(non-hodgkins lymphoma)、B细胞淋巴瘤、实体瘤和乳癌，所述治疗包括施用根据任何上述或下述实施方案的化合物的步骤。
本发明的另一方面涉及一种药物组合物，其包括根据任何上述实施方案的化合物和药学上可接受的稀释剂或载体。
本发明的另一方面涉及根据任何上述实施方案的化合物用作药剂的用途。
本发明的另一方面涉及根据任何上述实施方案的化合物在制造治疗类风湿性关节炎、强直性脊椎炎、骨关节炎、银屑病关节炎、银屑病、炎症性疾病和自身免疫疾病的药剂中的用途。
本发明的化合物一般可具有数个不对称中心并且通常以外消旋混合物形式描绘。本发明意在涵盖外消旋混合物、部分外消旋混合物和分开的对映异构体和非对映异构体。
“药学上可接受的盐”意指通过常规手段制备的盐并且是本领域技术人员所熟知的。“药学上可接受的盐”包含无机酸和有机酸的碱性盐，所述酸包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、苹果酸、乙酸、草酸、酒石酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、丁二酸、马来酸、水杨酸、苯甲酸、苯乙酸、扁桃酸等。当本发明化合物包含酸性官能团(如羧基)时，则适于羧基的药学上可接受的阳离子对是本领域技术人员所熟知的并且包含碱、碱土、铵、季铵阳离子等。关于“药学上可接受的盐”的其它实例，请参看下文和Berge等，J.Pharm.Sci.66：1(1977)。
“离去基团”泛指可容易地被如胺、硫醇或醇亲核试剂这类亲核试剂置换的基团。这类离去基团在本领域中是众所周知的。这类离去基团的实例包括但不限于N-羟基丁二酰亚胺、N-羟基苯并三唑、卤化 物、三氟甲磺酸酯、甲苯磺酸酯等。适当时，本文指示优选的离去基团。
“保护基”泛指本领域中熟知的用于阻止所选反应基团(如羧基、氨基、羟基、巯基等)发生不想要反应(如亲核、亲电子、氧化、还原等)的基团。适当时，本文指示优选的保护基。氨基保护基的实例包括但不限于芳烷基、取代的芳烷基、环烯基烷基和取代的环烯基烷基、烯丙基、取代的烯丙基、酰基、烷氧基羰基、芳烷氧基羰基、硅烷基等。芳烷基的实例包括但不限于苯甲基、邻甲基苯甲基、三苯甲基和二苯甲基，其可任选地被卤素、烷基、烷氧基、羟基、硝基、酰基氨基、酰基等取代，和盐，如鳞盐和铵盐。芳基的实例包括苯基、萘基、茚满基(indanyl)、蒽基、9-(9-苯基芴基)、菲基、均四甲苯基(durenyl)等。环烯基烷基或取代的环烯基烷基的实例优选地具有6-10个碳原子，包括但不限于环己烯基甲基等。合适的酰基、烷氧基羰基和芳烷氧基羰基包含苯甲氧基羰基、叔丁氧基羰基、异丁氧基羰基、苯甲酰基、取代的苯甲酰基、丁酰基、乙酰基、三氟乙酰基、三氯乙酰基、酞酰基等。保护基的混合物可用于保护同一氨基，如伯氨基可被芳烷基与芳烷氧基羰基保护。氨基保护基也可形成含氮杂环，其中氨基保护基连接于氮，例如1，2-双(亚甲基)苯、邻苯二甲酰亚胺基、丁二酰亚胺基、马来酰亚胺基等，并且其中这些杂环基团可进一步包含联接的芳基和环烷基环。另外，杂环基团可被单取代、二取代或三取代，如硝基邻苯二甲酰亚胺基。氨基也可通过形成加成盐(如盐酸盐、甲苯磺酸、三氟乙酸等)被保护以免发生不想要的反应，如氧化。许多氨基保护基也适合保护羧基、羟基和巯基。例如，芳烷基。烷基也是适于保护羧基和巯基的基团，如叔丁基。硅烷基保护基是任选地被一个或多个烷基、芳基和芳烷基取代的硅原子。合适的硅烷基保护基包括但不限于三甲基硅烷基、三乙基硅烷基、三异丙基硅烷基、叔丁基二甲基硅烷基、二甲基苯基硅烷基、1，2-双(二甲基硅烷基)苯、1，2-双(二甲基硅烷基)乙烷和二苯基甲基硅烷基。氨基的硅烷化提供单硅烷基氨基或二硅烷基氨基。氨基醇化合物的硅烷化可产生N，N，O-三 硅烷基衍生物。从硅烷基醚官能团中去除硅烷基官能团能通过用例如金属氢氧化物或氟化铵试剂处理容易地实现，作为个别反应步骤或在与醇基反应期间原位实现。合适的硅烷基化试剂是例如氯化三甲基硅烷基、氯化叔丁基-二甲基硅烷基、氯化苯基二甲基硅烷基、氯化二苯甲基硅烷基或其与咪唑或DMF的组合产物。用于氨基硅烷基化和硅烷基保护基去除的方法是本领域技术人员所熟知的。从相应的氨基酸、氨基酸酰胺或氨基酸酯制备这些氨基衍生物的方法也是有机化学(包括氨基酸/氨基酸酯或氨基醇化学)领域技术人员所熟知的。
保护基在不会影响分子的剩余部分的条件下去除。这些方法在本领域中是熟知的并且包含酸水解、氢解等。优选的方法涉及去除保护基，如通过利用钯/碳于如醇、乙酸等或其混合物的合适溶剂系统中氢解去除苯甲氧基羰基。叔丁氧基羰基保护基可利用无机酸或有机酸(如HCl或三氟乙酸)于如二噁烷或二氯甲烷的合适的溶剂系统中去除。所得氨基盐可容易地被中和，得到游离胺。羧基保护基(如甲基、乙基、苯甲基、叔丁基、4-甲氧基苯基甲基等)可在本领域技术人员熟知的水解和氢解条件下去除。
应注意，本发明化合物可含有可呈互变异构形式的基团，如环状和非环状脒和胍基团、杂原子取代的杂芳基(Y′＝O、S、NR)等，其在以下实例中说明：

并且虽然本文命名、描述、显示和/或主张一种形式，但所有互变异构形式都意在内在地包含在所述名称、描述、显示和/或主张内。
本发明还涵盖本发明化合物的前药。前药是在对患者施用之后，通过如水解、代谢等体内生理作用化学改性为本发明化合物的活性或非活性化合物。制备和使用前药中所涉及的适合性和技术是本领域技术人员所熟知的。关于酯的前药的一般讨论，参看Svensson和Tunek Drug Metabolism Reviews 165(1988)和Bundgaard Design of Prodrugs，Elsevier(1985)。掩蔽羧酸根阴离子的实例包括多种酯，如烷基(例如甲基、乙基)、环烷基(例如环己基)、芳烷基(例如苯甲基、对甲氧苯甲基)和烷基羰氧基烷基(例如特戊酰氧基甲基)。胺已掩蔽成芳基羰氧基甲基取代的衍生物，其在体内被酯酶裂解释放游离药物和甲醛(Bungaard J.Med.Chem.2503(1989))。另外，含如咪唑、酰亚胺、吲哚等酸性NH基团的药物已用N-酰氧基甲基掩蔽(Bundgaard Design of Prodrugs，Elsevier(1985))。羟基已掩蔽成酯和醚。EP 039,051(Sloan 和Little，4/11/81)揭示曼尼希碱异羟肟酸前药、其制备及用途。
本说明书和权利要求书包含使用语言“选自......和......”和“是......或......”(有时称为马库什组)的物质列表。当本申请中使用这一语言时，除非另有说明，否则意指包括这个群整体或其任何单一成 员或其任何子群。使用这一语言仅用于简写目的并且无论如何不意欲限制需要时单个元素或子群的去除。
实验
使用以下缩写：
aq.-       水性的
BINAP-     2，2’-二(二苯基膦酸)-1，1’-联萘
cond-      浓缩的
DCM        二氯甲烷
DMF-       N，N-二甲基甲酰胺
Et2O-      二乙醚
EtOAc-     乙酸乙酯
EtOH-      乙醇
h-         小时
min-       分钟
MeOH-      甲醇
rt         室温
satd-      饱和的
THF-       四氢呋喃
总则
以下所用的试剂和溶剂可自商业来源获得。1H-NMR光谱在Bruker 400MHz和500MHz NMR波谱仪上记录。明显的峰按以下顺序制成表：多重性(s，单峰；d，双峰；t，三重峰；q，四重峰；m，多重峰；br s，宽单峰)，耦合常数(以赫兹(Hz)为单位)和质子数。质谱结果报告为质荷比，接着是每种离子的相对丰度(附带电喷雾离子化(ESI)质谱分析在Agilent 1100系列LC/MSD电喷雾质谱仪上进行)。所有化合物都可以+ESI模式使用含0.1％甲酸的乙腈∶水作为传递溶剂来分析。反相分析HPLC在Agilent Eclipse XDB-C18 5μm柱(4.6×150mm)上使用Agilent 1200系列作为固定相并且用含0.1％TFA的乙腈∶水洗脱来进行。反相半制备型HPLC在Phenomenex GeminiTM10μm C18柱(250×21.20mm)上使用Agilent 1100系列作为固定相并且用含0.1％TFA的乙腈∶H2O来进行。手性化合物使用异丙醇/己烷梯度，AD柱纯化。手性的指定基于生物化学数据。
实施例1：4-氨基-6-(((1S)-1-(8-氟-2-(2-(甲磺酰基)苯基)-3-喹啉基)乙基)氨基)-5-嘧啶甲腈的制备
N-(2-氟苯基)肉桂酰胺

在0℃下经2h向2-氟苯胺(25.0g，225mmol)和碳酸钾(47g，337mmol)在水(112mL)和丙酮(45mL)中的溶液添加肉桂酰氯(37.0g，225mmol，1当量)在丙酮(45mL)中的溶液。将溶液在0℃下搅拌1h，并且骤冷到200mL冰水中。过滤白色结晶固体并且用水洗涤。将固体风干2h，然后用400mL己烷洗涤。将固体真空干燥过夜，得到N-(2-氟苯基)肉桂酰胺(56g，产率103％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δppm8.49(br t，J＝7.8Hz，1H)，7.80(d，J＝15.3Hz，1H)，7.57(m，3H)，7.41(m，3H)，7.17(m，3H)，6.61(d，J＝15.6Hz，1H)。质谱(ESI)m/e＝242.1(M+1)。
8-氟喹啉-2(1H)-酮

将N-(2-氟苯基)肉桂酰胺(10.5g，44mmol)溶解于氯苯(60mL)中并且添加三氯化铝(29.0g，218mmol，5当量)。将反应物加热至125℃并保持3h，接着用时45min冷却至室温。在搅拌下将反应物倒在300g冰上，产生褐色固体。过滤固体并用100mL水和3×100mL己烷洗涤并且在高真空下干燥。固体用1L DCM萃取并过滤以去除不溶性副产物。真空去除溶剂得到8-氟喹啉-2(1H)-酮。1H NMR(400MHz，CDCl3)δppm 10.95(br s，1H)，7.77(dd，J＝9.8，1.6Hz，1H)，7.35(d，J＝7.8Hz，1H)，7.27(ddd，J＝10.2，7.8，1.2Hz，1H)，7.14(td，J＝8.0，5.1Hz，1H)，6.76(d，J＝9.4Hz，1H)。
2-氯-8-氟喹啉

用磷酰三氯(163ml，1.73mol，11当量)使8-氟喹啉-2(1H)-酮(26.0g，159mmol)浆化并加热至125℃保持2h。将反应物冷却至室温并在剧烈搅拌下倒在1.2L冰水上。当混合物已冷却至室温时，过滤橙色固体并用水洗涤并且真空干燥过夜，得到27g粗物质。通过在回流下溶解于约700mL己烷中并从残余焦油中倾析出而使粗物质从己烷重结晶。将己烷溶液冷却至0℃并过滤沉淀2-氯-8-氟喹啉。真空浓缩母液并从己烷重结晶，获得第二批2-氯-8-氟喹啉产物(21.3g，总产率74％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δppm 8.14(dd，J＝8.6，1.2Hz，1H)，7.62(br d，1H)，7.52(td，J＝7.8，4.7Hz，1H)，7.45(m，2H)。
1-(2-氯-8-氟喹啉-3-基)乙醇

2-氯-8-氟喹啉(5.00g，27.5mmol)溶解于THF(60mL)中并冷却至-78℃。用时5min向此溶液添加新鲜制备并滴定的二异丙基酰胺锂(1M溶液于THF中，30mL，30mmol，1.1当量)。允许反应物在-78℃下搅拌20min，之后经由注射器用时30秒添加乙醛(2.3mL，41.3mmol，1.5当量)(放热的)。在-78℃下30min后，用50％的饱和NH4Cl溶液猝灭反应并用EtOAc稀释。分离各层并用盐水洗涤，经MgSO4干燥，并且过滤。将粗反应混合物沉积在30g硅胶上并通过60g硅胶塞，用8∶2己烷∶EtOAc洗脱。收集含有产物的级分和相近(第二)洗脱的区域异构体。浓缩级分并使粗产物在140mL的9∶1己烷∶EtOAc中回流浆化30min。冷却至室温后，过滤固体并用少量的冷9∶1己烷∶EtOAc洗涤，得到纯1-(2-氯-8-氟喹啉-3-基)乙醇(3.1g，13.7mmol，产率50％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δppm 8.43(br s，1H)，7.64(td，J＝7.8，5.1Hz，1H)，7.41(ddd，J＝10.2，7.4，1.2Hz，1H)，5.39(qdd，J＝6.3，3.9，0.8Hz，1H)，2.22(d，J＝3.9Hz，1H)，1.62(d，J＝6.3Hz，3H)。
1-(2-氯-8-氟喹啉-3-基)乙酮

向含有甲苯(183mL)的圆底烧瓶添加1-(2-氯-8-氟喹啉-3-基)乙醇(6.20g，27.5mmol)和二氧化锰(19.1g，220mmol，8当量)。反应物加热至回流2h，冷却至室温，过滤并浓缩。产物用己烷稀释并过滤，得到呈白色固体的1-(2-氯-8-氟喹啉-3-基)乙酮(4.43g，产率72％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δppm 8.40(d，J＝1.6Hz，1H)，7.71(br d，J＝ 8.2Hz，1H)，7.56(td，J＝7.8，5.1Hz，1H)，7.54(ddd，J＝9.8，7.8，1.6Hz，1H)。质谱(ESI)m/e＝223.9(M+1)。
(R)-1-(2-氯-8-氟喹啉-3-基)乙醇

在圆底烧瓶中将(+)-二异松蒎基氯硼烷(商标)(17.5g，540mmol，2.2当量)溶解于无水THF(200mL)中并将溶液冷却至-55℃(使用干冰/MeCN浴)。向此溶液添加1-(2-氯-8-氟喹啉-3-基)乙酮(5.50g，24.5mmol)在THF(50mL)中的溶液。允许反应物缓慢升温至室温过夜。之后，反应用10mL乙酮和100mL的10％Na2CO3猝灭并允许在室温下搅拌2h。添加乙酸乙酯(750mL)并且分离各层。有机相用50％的饱和碳酸氢钠洗涤3次，并用盐水洗涤一次。经MgSO4干燥有机层，过滤并且浓缩。在高真空下在75℃浓缩粗物质以去除蒎烯。在室温下使残余物在150mL己烷和150mL水中浆化，保持3h。形成白色沉淀并过滤且干燥，得到4.9g 98％ee产物。将固体溶解于25mL沸腾EtOAc中并在回流下添加25mL热己烷以形成沉淀。混合物冷却至-15℃，过滤并用冷9∶1己烷∶EtOAc洗涤，得到(R)-1-(2-氯-8-氟喹啉-3-基)乙醇(4.07g，产率73％)。手性HPLC(10％IPA于己烷中，chiralcel AD-H)显示产物＞99.9％ee。在9.6min下洗脱想要的对映异构体，在8.1min下洗脱不想要的对映异构体。1H NMR(400MHz，CDCl3)δppm 8.43(br s)，7.64(br d，J＝8.2Hz，1H)，7.50(td，J＝7.8，4.7Hz，1H)，7.41(ddd，J＝10.2，7.8，1.2Hz，1H)，5.40(qd，J＝5.9，0.8Hz，1H)，2.22(br s，1H)，1.62(d，J＝6.3Hz，3H)。质谱(ESI)m/e＝226.0(M+1)。
(S)-2-(1-(2-氯-8-氟喹啉-3-基)乙基)异吲哚啉-1，3-二酮

在圆底烧瓶中合并邻苯二甲酰亚胺(6.38g，43.3mmol)、三苯基膦(1.14g，43.3mmol)和(R)-1-(2-氯-8-氟喹啉-3-基)乙醇(8.15g，36.2mmol)的THF(240mL)溶液。溶液冷却至0℃并逐滴添加偶氮二羧酸二异丙酯(DIAD，8.5mL，43.3mmol)。允许反应物升温至室温过夜。将反应物浓缩至约100mL的体积并用1L Et2O和200mL水稀释。分离各层并且用200mL的Et2O萃取回水层。用160mL盐水洗涤合并的有机层，经MgSO4干燥，过滤并且浓缩。使用100％DCM进行柱色谱法，得到(S)-2-(1-(2-氯-8-氟喹啉-3-基)乙基)异吲哚啉-1，3-二酮(10.5g，产率82％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δppm 8.60(br s，1H)，7.74(m，2H)，7.64(m，3H)，7.45(td，J＝7.8，4.9Hz，1H)，7.35(ddd，J＝10.2，7.8，1.2Hz，1H)，5.89(q，J＝7.2Hz，1H)，1.90(d，J＝7.0Hz，3H)。
2-((1S)-1-(8-氟-2-(2-(甲硫基)苯基)喹啉-3-基)乙基)异吲哚啉-1，3-二酮

在N2气氛下将(S)-2-(1-(2-氯-8-氟喹啉-3-基)乙基)异吲哚啉-1，3-二酮(14.0g，39.5mmol)、2-(甲硫基)苯基硼酸(9.95g，59.2mmol)和碳酸钾(16.4g，118mmol)合并于300mL无水DMF中。溶液用N2鼓 泡约5min，之后添加PdCl2(dppf)CH2Cl2(3.22g，3.95mmol)。在100℃下加热溶液3h，然后冷却至50℃。真空浓缩溶液，得到棕色残余物，所述残余物用EtOAc(600mL)稀释。接着有机层用H2O(3×80mL)和盐水(1×100mL)先后洗涤。合并的水层用DCM(3×200mL)萃取。合并的有机层经MgSO4干燥，并且接着真空浓缩。所获得的残余物通过硅胶快速色谱法用20％己烷至40％EtOAc/己烷的梯度洗脱来纯化。合并含有纯产物的级分并真空浓缩，得到呈淡黄色泡沫的2-((1S)-1-(8-氟-2-(2-(甲硫基)苯基)喹啉-3-基)乙基)异吲哚啉-1，3-二酮(14.6g，33.0mmol，产率84％)。质子NMR反映出在25℃下阻转异构体53/47的比。1H NMR(500MHz，CDCl3)δppm 8.71(br s，0.53H)，8.65(br s，0.47H)，7.79(m，1H)，7.66(s，4H)，7.55(m，1H)，7.45-7.27(系列单峰，3.6H)，6.87(m，1.4H)，5.70(q J＝6.4Hz，0.47H)，5.63(q，J＝6.8Hz，0.53H)，2.47(br s，1.4H)，1.91(m，3H)，1.52(br s，1.6H)。质谱(ESI)m/e＝443.2(M+1)。
2-((1S)-1-(8-氟-2-(2-(甲磺酰基)苯基)-3-喹啉基)乙基)-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮

向70mL的DCM添加13.56g(1.2g/1mmol底物)的湿蒙脱土(约0.2g H2O/1g粘土)和硫酸氢钾(17.37g，28.2mmol)1。向此悬浮液添加2-((1S)-1-(8-氟-2-(2-(甲硫基)苯基)喹啉-3-基)乙基)异吲哚啉-1，3-二酮(5.0g，11.3mmol)溶解于DCM(10mL)中的溶液。在室温下搅拌此浆液72h，接着通过烧结漏斗过滤。固体用DCM(约600mL)洗涤，并且将滤液真空浓缩，得到呈淡黄色固体的2-((1S)-1-(8-氟-2-(2-(甲磺酰 基)苯基)-3-喹啉基)乙基)-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮(7.11g，97％)。质子NMR反映出在25℃下阻转异构体59/41的比。1H-NMR(500MHz，CDCl3)δppm 8.86(s，0.59H)，8.79(s，0.41H)，8.26(d，J＝7.8Hz，0.41H)，8.04(d，J＝7.8Hz，0.59H)，7.89-7.36(系列单峰，9.6H)，7.20(d，J＝7.6Hz，0.41H)，5.70(q，J＝7.1Hz，0.59H)，5.54(q，J＝7.3Hz，0.41H)，3.19(s，1.75H)，3.15(s，1.25H)，1.98(d，J＝7.3Hz，1.75H)，1.85(d，J＝7.1Hz，1.25H)。质谱(ESI)m/e＝475.0(M+1)。
1.Hirano，M.；Tomaru，J.；Morimoto，T.Bull.Chem.Soc.Jpn.，1991，64，3752-54。
(1S)-1-(8-氟-2-(2-(甲磺酰基)苯基)-3-喹啉基)乙胺

将2-((1S)-1-(8-氟-2-(2-(甲磺酰基)苯基)喹啉-3-基)乙基)异吲哚啉-1，3-二酮(9.10g，19.2mmol)和水合肼(9.32mL，192mmol)添加到中EtOH(190mL)。在65℃下加热3h后，将所得浆液冷却至室温，用900mL EtOAc稀释，并且通过烧结漏斗过滤。滤液用H2O(3×200mL)、盐水(1×200mL)洗涤，并且接着经MgSO4干燥，之后真空浓缩，得到呈淡橙色固体的(1S)-1-(8-氟-2-(2-(甲磺酰基)苯基)喹啉-3-基)乙胺(6.06g，17.6mmol，产率92％)。质子NMR反映出在25℃下阻转异构体73/27的比。1H NMR(500MHz，CDCl3)δppm 8.55(d，J＝1.5Hz，0.73H)，8.50(d，J＝1.5Hz，0.27H)，8.26(dd，J＝8.1，1.2Hz，0.27H)，8.23(dq，J＝7.81.2Hz，0.73H)，7.73(m，3H)，7.52(m，1.27H)，7.40(m，1.73H)，4.16(q，J＝6.6Hz，0.27H)，4.03(q，J＝6.4Hz，0.73H)，3.36(s，0.79H)，3.17(s，2.21H)，1.36(m，3H)。质谱(ESI)m/e＝ 345.2(M+1)。
4-氨基-6-(((1S)-1-(8-氟-2-(2-(甲磺酰基)苯基)-3-喹啉基)乙基)氨基)-5-嘧啶甲腈

将(1S)-1-(8-氟-2-(2-(甲磺酰基)苯基)喹啉-3-基)乙胺(9.16g，26.6mmol)、N-乙基-N-异丙基丙-2-胺(13.7mL，80mmol)和4-氨基-6-氯嘧啶-5-甲腈(4.32g，27.9mmol)溶解于(67mL)中并且接着在N2气氛下加热至110℃。在110℃下3h后，将反应物的温度增加至120℃，保持2h。在冰浴中冷却之后，过滤混合物，余下14g棕色固体。加热滤液至120℃保持3h，冷却至40℃，并真空浓缩余下棕色油。合并油和固体，并且在硅胶快速柱上用2％MeOH/DCM洗脱来纯化。合并含有纯产物的级分并真空浓缩，得到浅黄色固体。合并含有纯产物的级分，并且在硅胶快速柱上用1.5％MeOH/DCM至2％MeOH/DCM的梯度洗脱来纯化。合并含有纯产物的级分并真空浓缩，得到浅黄色固体。在加热下(约60℃)将合并的纯固体溶解于EtOH中并接着真空浓缩，重复溶解于EtOH中接着真空浓缩。接着将所获得的固体在真空管路上在120℃下干燥，直到残余乙醇低于0.5重量％。所获得的固体是4-氨基-6-(((1S)-1-(8-氟-2-(2-(甲磺酰基)苯基)-3-喹啉基)乙基)氨基)-5-嘧啶甲腈(10.3g，产率84％)。质子NMR反映出在25℃下阻转异构体87/13的比。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δppm 8.80(br s，0.13H)，8.58(br s，0.87H)，8.13(dd，J＝7.7，1.2Hz，0.87H)，7.95-7.52(系列单峰，8H)，7.30-6.99(br m，2H)，6.82(d，J＝8.3Hz，1H)，5.62(五重峰，J＝6.9Hz，0.13H)，5.22(五重峰，J＝6.9Hz，0.87H)，3.37(s，2.57 H)，3.319s，0.43H)，1.60(d，J＝6.9Hz，0.4H)，1.35(d，J＝6.9Hz，2.6H)。质谱(ESI)m/e＝463.1(M+1)。
实施例2：(S)-4-氨基-6-((1-(7-氟-2-(2-(甲磺酰基)苯基)喹啉-3-基)乙基)氨基)嘧啶-5-甲腈的制备
2-氯-7-氟喹啉-3-甲醛

在0℃下在装有机械搅拌器的三颈烧瓶中向POCl3(0.837L，9.17mmol)逐滴添加DMF(253mL，3.28mmol)。在室温下搅拌半固体混合物30min，并且一次性添加N-(3-氟苯基)乙酰胺(200g，1.31mol)。将所得的混合物在75℃下加热过夜。冷却至室温后，将反应混合物小心倾入冰水(9kg)中。过滤所得固体，用水、NaHCO3洗涤，并且风干。粗混合物(200g，73％)在EtOAc(5L)中重结晶，得到呈灰白色针状物的2-氯-7-氟喹啉-3-甲醛(150g)。质谱(ESI)m/e＝210(M+1)。
1-(2-氯-7-氟喹啉-3-基)乙醇

在-20℃下将2-氯-7-氟喹啉-3-甲醛(44.7g，213mmol)在THF(600mL)中的悬浮液用MeMgBr(78.0mL，234mmol，1.1当量)处理。搅拌过夜后，反应用NH4Cl溶液猝灭并用Et2O(300mL和100mL)萃取。有机层用水、盐水洗涤，经Na2SO4干燥，浓缩并从EtOAc(100mL)和己烷(1L)重结晶。获得淡黄色固体1-(2-氯-7-氟喹啉-3-基)乙醇(41g，85％)。质谱(ESI)m/e＝226(M+1)。
1-(2-氯-7-氟喹啉-3-基)乙酮

将1-(2-氯-7-氟喹啉-3-基)乙醇(7.7g，34mmol)、MnO2(30g，10当量)和甲苯(200mL)回流加热2h。LC-MS显示反应完成。过滤，然后去除溶剂，得到灰白色固体1-(2-氯-7-氟喹啉-3-基)乙酮(6.2g，81％)。质谱(ESI)m/e＝224(M+1)。
(R)-1-(2-氯-7-氟喹啉-3-基)乙醇

在-45℃(干冰和乙腈)下向1-(2-氯-7-氟喹啉-3-基)乙酮(164g，733mmol)在THF(1.34L)中的溶液逐滴添加(+)-DIP-Cl(517.5g，2.2当量)在THF(3.5L)中的溶液。将反应物缓慢加温至室温过夜。接着在0℃下将反应用丙酮(750mL)和10％Na2CO3(750mL)猝灭并且在室温下搅拌1h，之后添加EtOAc(3.5L)。将混合物加温至室温，并用10％Na2CO3和水洗涤。有机层用盐水干燥，浓缩并用己烷(1.0L)和水(1.8L)处理。在室温下将混合物搅拌40min并过滤。白色固体用水和盐水洗涤，风干过夜(143g)。将此物质在旋转蒸发器上在60℃高真空(2mm Hg)下干燥4h，得到白色粉末(R)-1-(2-氯-7-氟喹啉-3-基)乙醇(122g，73.7％)。AD柱(含异丙醇的己烷，10％)上的手性HPLC显示ee＞99％。质谱(ESI)m/e＝226(M+1)。
(S)-2-(1-(2-氯-7-氟喹啉-3-基)乙基)异吲哚啉-1，3-二酮

在0℃下向(R)-1-(2-氯-7-氟喹啉-3-基)乙醇(3.03g，13.4mmol)、邻苯二甲酰亚胺(2.37g，1.20eq)和PPh3(4.23g，1.20eq)在THF(70mL)中的混合物逐滴添加DIAD(3.13mL，1.20当量)。然后在室温下搅拌混合物过夜，之后在EtOAc(200mL)与水(200mL)间分配混合物。分离有机层，用水、盐水洗涤，经Na2SO4干燥并且浓缩。通过硅胶柱色谱法(DCM)纯化残余物，得到白色粉末(S)-2-(1-(2-氯-7-氟喹啉-3-基)乙基)异吲哚啉-1，3-二酮(3.8g，80％)。质谱(ESI)m/e＝355(M+1)。
(S)-(1-(2-氯-7-氟喹啉-3-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯

在室温下向(S)-2-(1-(2-氯-7-氟喹啉-3-基)乙基)异吲哚啉-1，3-二酮(1.0g，2.8mmol)在EtOH(10mL)中的溶液逐滴添加NH2NH2(10当量，0.88mL)，之后加温至90℃保持30min。冷却至室温后，浓缩反应混合物，在EtOAc(20mL)与水(5mL)间分配反应混合物。分离有机层，用水、盐水洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩，得到无色油，将此无色油溶解于THF(10mL)中并用BOC2O(1.1当量，0.68g)和TEA(1.0当量，0.39mL)在回流下处理。冷却至室温后，浓缩反应混合物并通过硅胶柱色谱法(EtOAc/己烷，1/9)纯化，得到白色固体(S)-(1-(2-氯-7-氟喹啉-3-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(0.70g，76％)。质谱(ESI)m/e＝325(M+1)。
(S)-(1-(7-氟-2-(2-(甲硫基)苯基)喹啉-3-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯

在N2下将(S)-(1-(2-氯-7-氟喹啉-3-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(382mg，1.2mmol)、2-(甲硫基)苯基硼酸(257mg，1.3当量)、Na2CO3(623mg，5.0当量)、Pd(PPh3)4(93mg，5％)、MeCN(9mL)和水(3mL)的混合物加热至85℃过夜。冷却至室温后，在EtOAc(10mL)与水(5mL)间分配反应物。将有机层分离，洗涤，干燥并浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化残余物，得到白色固体(S)-(1-(7-氟-2-(2-(甲硫基)苯基)喹啉-3-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(460mg，94.8％)。质谱(ESI)m/e＝413(M+1)。
(S)-(1-(7-氟-2-(2-(甲磺酰基)苯基)喹啉-3-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯

在N2气氛下，将(S)-(1-(7-氟-2-(2-(甲硫基)苯基)喹啉-3-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(412mg，999μmol)溶解于丙酮(3.00ml，40.8mmol)和水(3mL)中，并且添加NMO(351mg，3.00mmol)随后添加OsO4(12.7mg，0.05mmol)。允许反应在室温下搅拌过夜。LC-MS显示反应未完成。反应再次用OsO4(12.7mg，0.05mmol)处理并搅拌过夜。LC-MS显示只有痕量的起始试剂。通过添加5mL饱和硫代硫酸钠溶液来猝灭反应。反应物用EtOAc稀释并用5％Na2CO3洗涤。然后有机层用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并且真空浓缩。通过用含30％至60％EtOAc的己烷洗脱来纯化粗残余物，得到白色固体(S)-(1-(7-氟-2-(2-(甲磺酰基)苯基)喹啉-3-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(440mg，99％)。质谱(ESI)m/e＝445(M+1)。
(S)-4-氨基-6-((1-(7-氟-2-(2-(甲磺酰基)苯基)喹啉-3-基乙基)氨基)嘧啶-5-甲腈

向(S)-(1-(7-氟-2-(2-(甲磺酰基)苯基)喹啉-3-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(440mg，1.0mmol)添加HCl(4M，1mL)。在室温下搅拌所得混合物1h。去除溶剂，并且不经进一步处理使用粗(S)-1-(7-氟-2-(2-(甲磺酰基)苯基)喹啉-3-基)乙胺。将(1S)-1-(7-氟-2-(2-(甲磺酰基)苯基)喹啉-3-基)乙胺(100mg，290μmol)、4-氨基-6-氯嘧啶-5-甲腈(45mg，290μmol)和DIEA(101μl，581μmol)于DMF(4mL)中的溶液加热至100℃过夜。减压去除溶剂并经制备型TLC使用3％的MeOH/DCM纯化，得到白色粉末(S)-4-氨基-6-((1-(7-氟-2-(2-(甲磺酰基)苯基)喹啉-3-基)乙基)氨基)嘧啶-5-甲腈(6.9mg，5.1％)。1H NMR(500MHz，CD3OD)δppm 1.51(d，J＝7.09Hz，3H)3.17(s，3H)5.43(d，J＝6.85Hz，1H)7.48(d，J＝2.45Hz，1H)7.60-7.63(m，1H)7.66-7.69(m，2H)7.73(d，J＝1.47Hz，1H)7.81(s，1H)8.07(dd，J＝9.05，6.11Hz，1H)8.13-8.17(m，1H)8.49(s，1H)。质谱(ESI)m/e＝463(M+1)。
实施例3：4-氨基-6-((S)-1-(7-氟-2-(3-氟苯基)喹啉-3-基)乙氨基)嘧啶-5-甲腈的制备。
2-((S)-1-(7-氟-2-(3-氟苯基)喹啉-3-基)乙基)异吲哚啉-1，3-二酮

向(S)-2-(1-(2-氯-7-氟喹啉-3-基)乙基)异吲哚啉-1，3-二酮(150mg，423μmol)、3-氟苯基硼酸(65mg，465μmol)和碳酸钠(90mg，846μmol)在MeCN(8mL)和水(2mL)中的溶液鼓吹N2，随后添加Pd(PPh3)4(24mg，21μmol)，并且在90℃下搅拌所得混合物过夜。反应混合物用EtOAc稀释，用水、盐水洗涤并经Na2SO4干燥。使用制备型TLC用100％EtOAc洗脱纯化得到2-(((S)-1-(7-氟-2-(3-氟苯基)喹啉-3-基)乙基)氨甲酰基)苯甲酸(120mg，66％)。质谱(ESI)m/e＝433(M+1)。将2-(((S)-1-(7-氟-2-(3-氟苯基)喹啉-3-基)乙基)氨甲酰基)苯甲酸溶解于EtOH(2mL)中并添加浓HCl(0.1mL)。加热所得溶液至80℃保持4小时。去除溶剂，并且向反应混合物中添加饱和NaHCO3并用EtOAc萃取。有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，浓缩并经制备型TLC使用以NH3气饱和的3％MeOH/DCM纯化，得到白色固体2-((S)-1-(7-氟-2-(3-氟苯基)喹啉-3-基)乙基)异吲哚啉-1，3-二酮(85mg，49％)。质谱(ESI)m/e＝415(M+1)。
4-氨基-6-((S)-1-(7-氟-2-(3-氟苯基)喹啉-3-基)乙氨基)嘧啶-5-甲腈

向2-((S)-1-(7-氟-2-(3-氟苯基)喹啉-3-基)乙基)异吲哚啉-1，3-二酮(60.0mg，145μmol)在EtOH(2mL)中的溶液添加NH2NH2(1.0mL，1.45mmol，10当量)，并且将所得溶液加热至80℃保持2小时。过滤出沉淀并减压去除滤液，得到(1S)-1-(7-氟-2-(3-氟苯基)喹啉-3-基)乙胺。向(1S)-1-(7-氟-2-(3-氟苯基)喹啉-3-基)乙胺于DMF(2mL)中的粗残余物添加4-氨基-6-氯嘧啶-5-甲腈(22mg，145μmol)和DIEA(0.06mL，319μmol)。加热所得混合物至100℃过夜。减压去除溶剂并经 制备型HPLC使用15％-60％的MeCN/H2O w/0.01％TFA纯化，得到白色固体4-氨基-6-((S)-1-(7-氟-2-(3-氟苯基)喹啉-3-基)乙氨基)嘧啶-5-甲腈(9.3mg，16％)。1H NMR(500MHz，CD3OD)δppm 1.63(d，J＝6.85Hz，3H)5.70(q，J＝7.01Hz，1H)7.25-7.34(m，1H)7.44-7.54(m，2H)7.55-7.63(m，2H)7.74(dd，J＝9.78，2.45Hz，1H)8.05(s，1H)8.18(dd，J＝9.05，5.87Hz，1H)8.72(s，1H)。质谱(ESI)m/e＝403(M+1)。
实施例4：(S)-4-氨基-6-((1-(7-氟-2-(吡啶-2-基)喹啉-3-基)乙基)氨基)嘧啶-5-甲腈的制备
2-((S)-1-(7-氟-2-(吡啶-2-基)喹啉-3-基)乙基)异吲哚啉-1，3-二酮

在N2下将(S)-2-(1-(2-氯-7-氟喹啉-3-基)乙基)异吲哚啉-1，3-二酮(85.6g，241mmol)、Pd(PPh3)4(14g，12mmol，0.05当量)和2-(三丁基甲锡烷基)吡啶(107g，289mmol，1.2当量)在二噁烷(3.0L)中的混合物加热至90℃。搅拌过夜后，LC-MS显示完成30％。将反应混合物加热至101℃，持续另外2天。然后将反应混合物冷却至室温，倾析，并将剩余200mL溶液过滤以去除Pd残余物。将合并的溶剂浓缩至300mL并过滤得到褐色固体，所述固体用EtOAc/己烷(1/1)洗涤并干燥得到(82.1g)。将母液浓缩至100mL并用EtOAc/己烷(1/1，200mL)处理，得到第二批产物(2.2g)。总体而言获得褐色固体2-((S)-1-(7-氟-2-(吡啶-2-基)喹啉-3-基)乙基)异吲哚啉-1，3-二酮(84.3g，88％)。质谱(ESI)m/e＝398(M+1)。
(S)-1-(7-氟-2-(吡啶-2-基)喹啉-3-基)乙胺

向浆状2-((S)-1-(7-氟-2-(吡啶-2-基)喹啉-3-基)乙基)异吲哚啉-1，3-二酮(2.1g，5.3mmol)的无水乙醇(15mL)溶液经5分钟逐滴添加NH2NH2(0.85g，26mmol)。加热反应混合物至90℃后持续30min并且冷却至室温。反应混合物过滤并用EtOAc洗涤。所得EtOAc溶液用水、盐水洗涤并经Na2SO4干燥。去除溶剂得到褐色油(S)-1-(7-氟-2-(吡啶-2-基)喹啉-3-基)乙胺(1g，71％)。质谱(ESI)m/e＝468(M+1)。
4-氨基-6-((S)-1-(7-氟-2-(吡啶-2-基)喹啉-3-基)乙氨基)嘧啶-5-甲腈

将(S)-1-(7-氟-2-(吡啶-2-基)喹啉-3-基)乙胺(85mg，0.32mmol)、4，6-二氯-5-氰基嘧啶(55mg，0.32mmol，1.0当量)和N，N-二异丙基乙胺(68μl，0.38mmol，1.2当量)于THF(3mL)中的混合物在室温下搅拌30min，之后加热至50℃。4h后，浓缩混合物并通过柱色谱法(EtOAc/1/1)纯化，得到白色固体，将此白色固体在密封管中在110℃下用饱和的含NH3的二噁烷(3mL)处理过夜。浓缩反应混合物并通过反相HPLC(MeCN/H2O/0.1％TFA)纯化并冻干，得到白色粉末4-氨基-6-((S)-1-(7-氟-2-(吡啶-2-基)喹啉-3-基)乙氨基)嘧啶-5-甲腈(19mg， 15％)。1H NMR(500MHz，CD3OD)δppm 1.78(d，J＝6.85Hz，3H)5.82(q，J＝6.85Hz，1H)7.71(td，J＝8.80，2.45Hz，1H)7.89(dd，J＝9.66，2.32Hz，1H)8.10(ddd，J＝7.83，5.62，0.98Hz，1H)8.19(s，1H)8.27(dd，J＝9.05，5.87Hz，1H)8.45(d，J＝7.83Hz，1H)8.63(td，J＝7.95，1.47Hz，1H)8.94(s，1H)9.03-9.09(m，1H)。质谱(ESI)m/e＝386(M+1)。
实施例5：(S)-4-氨基-6-((1-(5-氯-3-(2-(甲磺酰基)苯基)喹啉-2-基)乙基)氨基)嘧啶-5-甲腈的制备
2-((3-氯-2-硝基苯基)氨基)丁酸

将1-氯-3-氟-2-硝基苯(2.00Kg，11.4mol)、2-氨基丁酸(1.22kg，11.8mol)和K2CO3(1.58Kg，11.4mol)在无水DMSO(4.2L)中的混合物在80℃下加热16h(在起始反应后，内部温度上升至110℃)。此时LC-MS分析显示反应完成。冷却至室温后，在剧烈搅拌下将反应混合物小心倾入水(10L)中。用甲基叔丁基醚(2×5L)洗涤水层以去除有机杂质。然后用浓HCl将水层酸化至pH为约1.5，得到橙色固体。过滤收集橙色固体，用水(2×4L)洗涤并风干，得到2-((3-氯-2-硝基苯基)氨基)丁酸(2.85Kg)，其照原样用于下一步骤。1H NMR(DMSO-d6)δppm 7.35(t，J＝8.3Hz，1H)，6.82-6.91(m，2H)，6.25(d，J＝7.6Hz，1H)，4.14(td，J＝7.4，5.4Hz，1H)，3.4(br.s.，1H)，1.74-1.92(m，2H)，0.88(t，J＝7.4Hz，3H)。质谱(ESI)m/e＝259.2(M+1)。
8-氯-3-乙基-3，4-二氢喹喔啉-2(1H)-酮

向2-((3-氯-2-硝基苯基)氨基)丁酸(1.5Kg，5.8mol)、4N HCl水溶液(4.35L，17.4mol)和EtOH(5.3L)的溶液添加SnCl2.2H2O(3.93Kg，17.4mol)。将反应混合物加热至回流持续5小时。此时LC-MS分析显示反应完成。冷却至室温后，减压蒸发反应混合物。使用冰水浴将所得残余物冷却至0℃，并且在剧烈搅拌下小心添加10N KOH水溶液(12L，180mol)。过滤去除不溶性固体后，滤液用DCM(2×10L)萃取，用水、盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并减压蒸发，得到呈黄色固体的8-氯-3-乙基-3，4-二氢喹喔啉-2(1H)-酮(1.1Kg)，其不经进一步纯化而使用。1H NMR(DMSO-d6)δppm 9.70(s，1H)，6.65-6.83(m，3H)，6.31-6.44(m，1H)，3.66-3.72(m，1H)，1.53-1.71(m，2H)，0.92(t，J＝7.4Hz，3H)。质谱(ESI)m/e＝211.2(M+1)。
8-氯-3-乙基喹喔啉-2(1H)-酮

向8-氯-3-乙基-3，4-二氢喹喔啉-2(1H)-酮(1.30Kg，6.17mol)在无水1，4-二噁烷(15L)中的溶液添加DDQ(1.47Kg，6.48mol)。反应混合物搅拌3h(添加DDQ后内部温度升至45℃)。在这之后，LC-MS分析显示反应完成。减压蒸发混合物，得到棕色残余物。向此残余物添加2M NaOH水溶液以调节pH至7-8。过滤收集所得黄色固体，悬浮于饱和NaHCO3水溶液中，搅拌1h并且过滤得到浅绿色固体。将浅绿色固体悬浮于饱和NaHCO3水溶液中，搅拌，过滤并用饱和NaHCO3水溶液和水洗涤，得到灰白色固体。将灰白色固体悬浮于水中，充分混合，过滤，用水洗涤，风干过夜，并在高真空下在50℃ 干燥，得到8-氯-3-乙基喹喔啉-2(1H)-酮。1H NMR(DMSO-d6)δppm7.69-7.75(m，1H)，7.59-7.65(m，1H)，7.29(t，J＝8.0Hz，1H)，2.84(q，J＝7.4Hz，2H)，1.23(t，J＝7.4Hz，3H)。质谱(ESI)m/e＝209.1(M+1)。
3，5-二氯-2-乙基喹喔啉

将8-氯-3-乙基喹喔啉-2(1H)-酮(1.00Kg，4.79mol)在POCl3(2.68L，28.8mol)中的稠浆液在100℃下搅拌2h。此时LC-MS分析显示反应完成。减压去除大部分POCl3后，将残余物小心倒入冰水中并用2M NaOH水溶液与饱和NaHCO3水溶液的组合中和。将所得悬浮液用DCM(3×4L)萃取。有机相用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，过滤并且减压蒸发。通过快速柱色谱法使用己烷/EtOAc(30/1)洗脱来纯化粗物质，得到呈白色固体的3，5-二氯-2-乙基喹喔啉(840g)。1H NMR(DMSO-d6)δppm 8.01-8.08(m，2H)，7.84(t，J＝8.0Hz，1H)，3.10-3.17(d，J＝7.3Hz，2H)，1.36(t，J＝7.3Hz，3H)。质谱(ESI)m/z＝227.1(M+1)。
2-(1-溴乙基)-3，5-二氯喹喔啉

在室温下将3，5-二氯-2-乙基喹喔啉(1.10Kg，4.84mol)溶解于CCl4(4.4L)中。然后添加1，3-二溴-5，5-二甲基乙内酰脲(762g，2.66mol)和过氧化苯甲酰(116g，0.48mol)将所得悬浮液回流加热2h。此时LC-MS分析显示反应完成。冷却至室温后，在反应容器中形成白色晶体。过滤收集白色晶体，用饱和NaHCO3水溶液(3×5L)洗涤并且在高真空下干燥，得到呈白色固体的2-(1-溴乙基)-3，5-二氯喹喔啉 (1.05Kg)。1H NMR(DMSO-d6)δppm 8.04-8.12(m，2H)，7.78-7.90(m，1H)，5.76-5.84(m，1H)，2.09(d，J＝6.7Hz，3H)。质谱(ESI)m/z＝304.8[(M+1)(79Br)]，306.9[(M+1)(81Br)]。
2-(1-(3，5-二氯喹喔啉-2-基)乙基)异吲哚啉-1，3-二酮

向2-(1-溴乙基)-3，5-二氯喹喔啉(1.00Kg，3.27mol)在DMF(8.2L)中的溶液添加邻苯二甲酰亚胺钾(1.21Kg，6.54mol)。将反应混合物搅拌3h。此时LC-MS分析显示反应完成。将混合物转移至50L分离漏斗中并且在搅拌下添加水(12L)和EtOAc(6L)。大量白色固体析出，并通过过滤收集。分离水相并且用EtOAc(2×4L)再次萃取。合并的有机相用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，过滤并且在减压下将体积减至5L。冷却至室温后，获得呈白色固体的产物。过滤白色固体，用己烷研磨并且真空干燥，得到2-(1-(3，5-二氯喹喔啉-2-基)乙基)异吲哚啉-1，3-二酮(1.24Kg)。1H NMR(DMSO-d6)δppm 8.02-8.21(2H，m)，7.83-8.02(m，5H)，5.89(q，J＝6.8Hz，1H)，1.87(d，J＝6.8Hz，3H)。质谱(ESI)m/z＝372.0(M+1)。
(S)-2-(1-(3，5-二氯喹喔啉-2-基)乙基)异吲哚啉-1，3-二酮

在Novasep HPLC单元上纯化外消旋的2-(1-(3，5-二氯喹喔啉-2- 基)乙基)异吲哚啉-1，3-二酮(1Kg)。用于分离过程的操作条件是：
柱：AS 20μM，11cm id×25cm L
流动相：己烷-IPA 70-30
流动速率：400mL/min
温度：25℃
UV检测：340nm
在流动相中的溶解度是1g/L。为保持样品处于溶解状态，需要搅拌和加热。在使用前过滤溶液。注入体积是每8.0分钟510mL。从色谱过程收集的级分使用Artisan薄膜蒸发器和旋转蒸发器在45℃下蒸发。去除溶剂后，在40℃真空烘箱中干燥产物至重量恒定，得到：(S)-2-(1-(3，5-二氯喹喔啉-2-基)乙基)异吲哚啉-1，3-二酮，第一对映异构体(425.7g，产率85.1％，98.7％e.e.)和(R)-2-(1-(3，5-二氯喹喔啉-2-基)乙基)异吲哚啉-1，3-二酮，第二对映异构体(432.5g，产率86.2％，97.7％e.e.)。
2-((1S)-1-(5-氯-3-(2-(甲硫基)苯基)喹喔啉-2-基)乙基)异吲哚啉-1，3-二酮

将装有机械搅拌器、冷凝器、氮气入口和温度探头的5L三颈圆底烧瓶中装有DMF(2.16L)、(S)-2-(1-(3，5-二氯喹喔啉-2-基)乙基)异吲哚啉-1，3-二酮(273g，733mmol)和2-(甲硫基)苯基硼酸(136g，807 mmol)。向混合物添加碳酸钾(203g，147mmol)和[1，1-双(二苯基膦基)二茂铁]钯(ii)氯化物与DCM的络合物(29.9g，36.7mmol)。混合物用N2(2×)真空鼓吹并加热至100℃。通过LC-MS监测反应，并且认为在4h后反应完成。反应物冷却至室温(21℃)，并且接着分成两批。在4L分液漏斗中在EtOAc(1.08L)与水(1.35L)间分配每批反应物。分离相后，有机层用盐水(2×500mL)洗涤并浓缩，得到粗产物。将合并的粗物质批次装载到硅胶上并通过快速色谱法(ISCO/RediSepTM)(己烷∶EtOAc＝10∶0至6∶4)纯化，提供呈浅棕色固体的产物320g，LC纯度为98％且产率为95％。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 8.15-8.31(m，1H)，8.07(m，1H)，7.93(m，1H)，7.77(m，2H)，7.64(br.s.，2H)，7.16-7.55(m，3H)，6.58-7.02(m，1H)，5.72-5.98(m，1H)，3.29(s，3H)，1.79(d，J＝6.9Hz，3H)质谱(ESI)m/z＝460.0(M+1)。
2-((1S)-1-(5-氯-3-(2-(甲磺酰基)苯基)喹喔啉-2-基)乙基)异吲哚啉-1，3-二酮

向装有添加漏斗、氮气入口、顶置式搅拌器和热电偶的5L三颈圆底烧瓶中装有蒙脱土K10(274g，274mmol)和水(54.2mL)。剧烈搅拌混合物约10min，获得自由流动粉末。此时添加DCM(1.26mL)，随后添加硫酸氢钾(421g，685mmol)。反应温度下降至15℃。在室温(18℃-20℃)下通过添加漏斗将2-((1S)-1-(5-氯-3-(2-(甲硫基)苯基)喹喔啉-2-基)乙基)异吲哚啉-1，3-二酮(126g，274mmol)在DCM(630mL)中的溶液添加至蒙脱土/硫酸氢钾悬浮液中，并且通过水/冰浴将 内部温度控制在21℃以下。在室温(19℃-21℃)下搅拌反应并通过LC进行监测。认为在96h后反应完成。过滤反应混合物并用DCM(2×250mL)洗涤固体。合并的有机溶液用10wt％的Na2SO3水溶液(2×250mL)洗涤，浓缩并且干燥，得到呈浅黄色固体的产物110g，LC纯度为97.6％且产率为82％。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 8.14-8.29(m，1H)，7.64-8.14(m，8H)，7.52(dd，J＝5.5，3.0Hz，1H)，7.21-7.38(m，1H)，5.59-5.94(m，1H)，3.10-3.27(m，3H)，1.66-1.91(m，3H)质谱(ESI)m/z＝492.0(M+1)。
(S)-1-(5-氯-3-(2-(甲磺酰基)苯基)喹喔啉-2-基)乙胺

将装有顶置式搅拌器、热电偶和回流冷凝器与氮气入口的5L三颈圆底烧瓶中装有(S)-2-(1-(5-氯-3-(2-(甲磺酰基)苯基)喹喔啉-2-基)乙基)异吲哚啉-1，3-二酮(193g，392mmol)、水(1351mL)和35wt.％的肼的水溶液(711mL，785mmol)。将所得白色浆液在65℃氮气下剧烈搅拌6h，并且接着允许其冷却至室温过夜。在这之后，LC-MS分析显示完全转换成想要的产物。过滤分离白色固体，用水洗涤并且在氮气流下在玻璃过滤器上干燥4h，得到(S)-1-(5-氯-3-(2-(甲磺酰基)苯基)喹喔啉-2-基)乙胺(129.7g)。质谱(ESI)m/z＝362.0(M+1)。
(S)-4-氨基-6-((1-(5-氯-3-(2-(甲磺酰基)苯基)喹喔啉-2-基)乙基)氨基)嘧啶-5-甲腈

将装有顶置式搅拌器、氮气入口和热电偶的3L三颈圆底烧瓶中装有(1S)-1-(5-氯-3-(2-(甲磺酰基)苯基)喹喔啉-2-基)乙胺(130g，358mmol)、4-氨基-6-氯嘧啶-5-甲腈(55.4g，358mmol)、丁-1-醇(920mL)和N，N-二异丙基乙胺(187mL，1.08mol)。将反应混合物加热至内部温度为95℃-100℃，持续6h，接着允许其冷却至室温过夜。在这之后，将反应加热至内部温度为100℃并且接着冷却至内部温度为50℃。在50℃下添加乙酸乙酯(约1.5L)并且允许反应冷却至室温。所得溶液用水(3×1L)、10wt％NaHSO4水溶液(4×1L)和盐水(1×500mL)洗涤。分离的有机层经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。所得残余物悬浮于甲苯(1L)中，真空蒸发并且在高真空下干燥36h(获得247g粗物质)。将粗物质悬浮于EtOAc(2L)中，过滤并且用10wt％NaHSO4水溶液(4×1L)洗涤。在EtOAc层中开始形成白色固体。添加机械搅拌棒，并且将悬浮液在室温下搅拌过夜并且在0℃下搅拌2h。通过过滤EtOAc而分离白色固体，并且在玻璃过滤器上在氮气流下干燥两天，留出EtOAc滤液(滤液A)。然后将白色固体(51g)悬浮于EtOAc(2L)中，并且添加饱和NaHCO3水溶液(1L)。将所得悬浮液搅拌15min，得到两层混合物。分离有机层，经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩，得到想要的产物。然后将滤液A真空浓缩，吸附在硅胶上并且通过MPLC(DCM/MeOH+10％NH4OH：100/0至90/10)纯化，得到92g想要的产物。合并两种分离的产物并且溶解于EtOH(500mL)中。将所得溶液真空浓缩。溶解于EtOH中并且浓缩的此过程重复三次(3×500mL)。将所得固体研磨(研钵和研杵)成粉末并且在真空烘箱(温度：90℃-100℃)中经P2O5干燥84h。之后再次研磨该物质，将其转移至超大号盘中并且在高真空100℃-110℃下干燥24h，得到(S)-4- 氨基-6-((1-(5-氯-3-(2-(甲基磺酰基)苯基)喹啉-2-基)乙基)氨基)嘧啶-5-甲腈(127.9g)。1H NMR(DMSO-d6)δppm 8.06-8.20(m，3H)，7.96-7.77(m，5H)，7.64-7.65和6.79-6.80(m，1H)，7.28(br.s.，2H)，5.42-5.45(m，1H)，3.32和3.22(s，3H)，1.51和1.40(d，J＝6.6Hz，3H)。质谱(ESI)m/z＝480.0(M+1)。对分析样品进行的Karl Fisher和GC分析显示该物质含有0.45wt％的水和0.55wt％的EtOH。
实施例6：2-((S)-1-(6-氨基-5-氰基嘧啶-4-基氨基)乙基)-3-(2-(甲磺酰基)苯基)喹喔啉-5-甲腈的制备
2-((S)-1-(1，3-二氧异吲哚啉-2-基)乙基)-3-(2-(甲磺酰基)苯基)喹喔啉-5-甲腈

将装有冷凝器、氮气入口、顶置式搅拌器和热电偶的5L三颈圆底烧瓶中装有2-((1S)-1-(5-氯-3-(2-(甲磺酰基)苯基)喹喔啉-2-基)乙基)异吲哚啉-1，3-二酮(400g，813mmol)、二氰基锌(143g，1.22mol)和1，4-二噁烷(4.0L)。剧烈搅拌溶液并且用Ar脱气1h。向该溶液添加XPhos催化剂前体(66.1g，89mmol)。混合物用Ar脱气1h并且加热至90℃。通过LC监测反应，并且认为在8h后反应完成。反应冷却至室温(20℃-21℃)，并且分成两批。对于每批化合物，添加EtOAc(2.0L)、NaHCO3(400mL)和水(400mL)。将混合物搅拌10min并且形成沉淀。过滤沉淀得到呈白色固体的纯产物201.5g。用盐水(800mL)洗涤母液，并且浓缩有机层，得到粗产物约400g。然后在室温下使粗物质在EtOAc(1.2L)中浆化30min。过滤固体，用EtOAc(2×400mL)洗涤并且干燥，得到呈褐色固体的产物220g。合并所有固体，在适 度真空和N2流下在玻璃料上干燥2天，得到呈白色固体的产物378g，LC纯度为99.6％且产率为96％。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm8.47-8.68(m，2H)，7.66-8.19(m，7H)，7.52(dd，J＝5.5，3.0Hz，1H)，7.22-7.40(m，1H)，5.61-5.95(m，1H)，3.11-3.27(m，3H)，1.68-1.93(m，3H)质谱(ESI)m/z＝483.0(M+1)。
2-((S)-1-氨乙基)-3-(2-(甲磺酰基)苯基)喹喔啉-5-甲腈

向装有氮气入口、顶置式搅拌器和热电偶的5L三颈圆底烧瓶中装有水合肼(381mL，783mmol)和EtOH(3.0L)。然后向此溶液一次性添加2-((S)-1-(1，3-二氧异吲哚啉-2-基)乙基)-3-(2-(甲磺酰基)苯基)喹喔啉-5-甲腈(378g，783mmol)并且加热至80℃。通过LC监测反应，并且一旦反应再次达到80℃就认为反应完成。在添加DCM(3.0L)和饱和NaHCO3溶液(600mL)时，将反应物冷却至室温(20℃-21℃)。分离相后，有机层用盐水(2×600mL)洗涤，浓缩并且在真空和N2流下干燥24h，得到呈浅黄色固体的产物257.7g，LC纯度为94.4％(未检测到R对映异构体)且产率为93％。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 8.45-8.54(m，2H)，8.18(dt，J＝7.7，1.5Hz，1H)，8.05(dd，J＝8.5，7.4Hz，1H)，7.76-8.00(m，3H)，3.83-4.03(m，1H)，3.25-3.32(m，3H)，1.19-1.39(m，3H)质谱(ESI)m/z＝353.0(M+1)。
2-((S)-1-(6-氨基-5-氰基嘧啶-4-基氨基)乙基)-3-(2-(甲磺酰基)苯基)喹喔啉-5-甲腈

将装有机械搅拌棒、冷凝器、氮气入口和温度探头的5L三颈圆底烧瓶中装有2-((S)-1-氨乙基)-3-(2-(甲磺酰基)苯基)喹喔啉-5-甲腈(257.7g，731mmol)、4-氨基-6-氯嘧啶-5-甲腈(120g，775mmol)和丁-1-醇(2.5L)。在室温(19℃-22℃)下搅拌溶液5min并且一次性添加N，N-二异丙基乙胺(363mL，219mmol)。将溶液加热至95℃，通过LC监测，并且认为在4h后反应完成。当加入EtOAc(2.0L)与水(500mL)时，将反应冷却至室温。分离两层，并且有机层用盐水(500mL)洗涤，浓缩直到去除大部分EtOAc并且形成沉淀。过滤沉淀并且用最小量的MeOH洗涤。真空干燥固体18h，得到浅黄色固体305g。浓缩母液，直到沉淀出更多产物。过滤固体，用MeOH(2×200mL)洗涤，真空干燥24h，得到呈固体的产物(45g)。向装有机械搅拌器、氮气入口和温度探头的5L三颈圆底烧瓶中装有合并的350g粗产物和MeOH(3.5L)。在室温(19℃-22℃)下将混合物搅拌2天。过滤固体，用MeOH(2×350mL)洗涤，在真空和N2流下干燥24h，得到米色固体(276.2g)，LC纯度为99.4％(未检测到R对映异构体)且产率为80％。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 8.43-8.59(m，2H)，8.01-8.23(m，2H)，7.71-7.99(m，4H)，7.61(d，J＝7.0Hz，1H)，7.24(br.s.，2H)，5.33-5.68(m，1H)，3.19-3.33(m，3H)，1.34-1.55(m，3H)
质谱(ESI)m/z＝471.1(M+1)。
实施例7：(S)-4-氨基-6-((1-(6-氟-3-(吡啶-2-基)喹喔啉-2-基)乙基)氨基)嘧啶-5-甲腈的制备
2-((4-氟-2-硝基苯基)氨基)丁酸

将2，5-二氟硝基苯(119ml，110mol)、2-氨基丁酸(114g，1.10mol)和碳酸钾(152.2g，1.10mol)在二甲亚砜(410ml，1.10mol)中的混合物在80℃下搅拌23h。([注意1]：混合物颜色为深橙红色。将混合物的内部温度升至约110℃，持续1h，然后降至80℃)。23h后，将反应物冷却至室温并且小心倾入水(2L+1L)中。水性混合物用二乙醚(1L×2)洗涤以去除有机杂质。然后用浓HCl(300mL)将水层酸化至pH为约1.5，产生黄色固体。过滤收集黄色固体，用水(3L)洗涤并且风干，得到想要的产物-湿的橙色固体。将湿的橙色固体从3L甲苯重结晶，并且在室温下静置过夜，得到呈橙色结晶固体的想要产物。过滤橙色结晶固体，用甲苯(2L)洗涤并且在高真空80℃下干燥4h，接着在冻干机上干燥过夜，得到呈橙色结晶固体的2-(4-氟-2-硝基苯基氨基)丁酸(203.6g，产率76.4％)。橙色结晶固体不经进一步纯化就用于下一步骤。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 13.30(br.s.1H)，8.28(d，J＝7.4Hz，1H)，7.90(dd，J＝9.4，2.9Hz，1H)，7.49-7.60(m，1H)，7.09(dd，J＝9.6，4.7Hz，1H)，4.49(dt，J＝7.2，5.5Hz，1H)，1.79-2.00(m，2H)，0.85-0.93(m，3H)，质谱(ESI)m/e＝243.1(M+1)。
3-乙基-7-氟-3，4-二氢喹喔啉-2(1H)-酮

向5-L三颈圆底烧瓶中的2-(4-氟-2-硝基苯基氨基)丁酸(181.7g，750.0mmol)、3N HCl水溶液(750.0ml，2250mmol)和乙醇(1923ml， 750.0mmol)的非均质混合物添加氯化Tin(II)二水合物(507.7g，2250mmol)，并且在使用顶置式搅拌器搅拌下在78℃下加热橙色混合物4h([注意1]：所述橙色非均质混合物变为橙色均质混合物，并且在约2小时内橙色变为红色)。4h后，将混合物冷却至室温并且减压浓缩以去除乙醇，并且在室温下保持48h。过滤收集所得的黄色固体，并且用水(500mL)洗涤。将黄色固体悬浮于冰水(1L)中，并且用KOH(约250g)将混合物的pH调节至约13。非均质混合物用DCM(1L×3)萃取。合并的有机层用水(1L×1)和盐水(1L×1)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并且减压浓缩，得到呈浅黄色固体的3-乙基-7-氟-3，4-二氢喹喔啉-2(1H)-酮(60.92g，产率41.8％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 10.26(s，1H)，6.68(dd，J＝8.6，5.5Hz，1H)，6.47-6.61(m，2H)，5.95(d，J＝1.2Hz，1H)，3.62(ddd，J＝6.7，5.0，2.0Hz，1H)，1.50-1.72(m，2H)，0.92(t，J＝7.4Hz，3H)，质谱(ESI)m/e＝195.1(M+1)。
3-乙基-7-氟喹喔啉-2(1H)-酮

向3-乙基-7-氟-3，4-二氢喹喔啉-2(1H)-酮(60.61g，312.1mmol)和1，4-二噁烷(1350ml)的均质溶液添加2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌(75.91g，327.7mmol)，并且在室温下使用顶置式搅拌器搅拌混合物2.5h。此时，减压浓缩混合物，得到棕色残余物。将棕色残余物悬浮于饱和NaHCO3水溶液(2L)中，搅拌30min，过滤，用饱和NaHCO3水溶液(1L)洗涤，得到浅绿色固体。将浅绿色固体重悬浮于饱和NaHCO3水溶液(500mL)中，充分混合，过滤并用饱和NaHCO3水溶液(500mL)洗涤，得到灰白色固体。将灰白色固体悬浮于水(500mL)中，充分混合，过滤，用水(1L)洗涤，风干过夜并且在高真空下在22℃干燥2h，得到呈灰白色固体的3-乙基-7-氟喹喔啉-2(1H)-酮(56.87g，产率94.8％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 12.36(br.S，1H.)，7.76(dd，J＝9.0，5.9Hz，1H)，7.11(td，J＝8.8，2.7Hz，1H)，7.00(dd， J＝9.6，2.7Hz，1H)，2.78(q，J＝7.4Hz，2H)，1.20(t，J＝7.4Hz，3H)质谱(ESI)m/e＝193.0(M+1)。
3-(1-溴乙基)-7-氟喹喔啉-2(1H)-酮

将3-乙基-7-氟喹喔啉-2(1H)-酮(20.61g，107.2mmol)和1，3-二溴-5，5-二甲基乙内酰脲(18.77g，64.34mmol)悬浮于四氯化碳(1072ml，107.2mmol)中。向此非均质化合物添加过氧化苯甲酰(3.463g，10.72mmol)，并且在搅拌下回流加热混合物(油浴温度：80℃)20h。20h后，将混合物冷却至室温。冷却后，在搅拌下将混合物倒入饱和的碳酸氢钠水溶液(1L)中。过滤收集沉淀并且用水(1L)洗涤，得到呈褐色固体的3-(1-溴乙基)-7-氟喹喔啉-2(1H)-酮(23.19g，产率79.8％)：
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 12.68(br.S，1H.)，7.85(dd，J＝9.0，5.9Hz，1H)，7.19(td，J＝8.8，2.7Hz，1H)，7.05(dd，J＝9.8，2.7Hz，1H)，5.62(q，J＝6.7Hz，1H)，1.99(d，J＝6.7Hz，3H)，纯度约90％
质谱(ESI)m/e＝271.0[(M+H)(79Br)]+和273.0[(M+H)(81Br)]+
2-(1-溴乙基)-3-氯-6-氟喹喔啉
3-氯-2-(1-氯乙基)-6-氟喹喔啉

将1L圆底烧瓶中的3-(1-溴乙基)-7-氟喹喔啉-2(1H)-酮(58.86g，217.1mmol)和三氯氧磷(198.8ml，2171mmol)的非均质混合物在100℃下搅拌2h。在反应开始时该混合物是非均质的，然后在1h内变 为均质黑色溶液。2h后，将混合物冷却至室温并且减压浓缩。在搅拌下向黑色残余物小心分批添加冰(约400ml)，随后添加水(200ml)。在搅拌下将混合物用NH4OH(200ml)和冰(约200ml)中和。过滤收集所得沉淀，用水(1L)冲洗并且在高真空下干燥过夜，得到呈棕色固体的包括3-氯-2-(1-氯乙基)-6-氟喹喔啉的2-(1-溴乙基)-3-氯-6-氟喹喔啉(58.31g，产率92.8％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)，溴乙基类似物与氯乙烯类似物的比＝2.5∶1质谱(ESI)m/e＝288.9[M+H(79Br)]+和291.0[M+H(81Br)]+
2-(1-(3-氯-6-氟喹喔啉-2-基)乙基)异吲哚啉-1，3-二酮

在室温下向包含3-氯-2-(1-氯乙基)-6-氟喹喔啉(48.39g，197.5mmol)的2-(1-溴乙基)-3-氯-6-氟喹喔啉(57.17g，197.5mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(700.0ml，197.5mmol)中的混合物添加邻苯二甲酰亚胺钾(91.43g，493.6mmol)并且将混合物在室温下搅拌1h。1h后，向混合物添加水(2L)。混合物用DCM(500mL×3)萃取。合并的有机层用盐水(1L×1)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并且减压浓缩，得到红色液体。将红色液体通过硅胶塞(5.5英寸直径×5高度)过滤，并且依次用含20％己烷的EtOAc、含30％己烷的EtOAc、100％的EtOAc作为洗脱液来洗脱，得到两个级分。第二个级分，想要的产物2-(1-(3-氯-6-氟喹喔啉-2-基)乙基)异吲哚啉-1，3-二酮(53.367g，产率75.97％)，呈粉色固体状。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 8.25(dd，J＝9.4，5.9Hz，1H)，7.81-7.95(m，6H)，5.86(q，J＝6.8Hz，1H)，1.86(d，J＝7.0Hz，3H)。质谱(ESI)m/e＝356.0(M+1)。
2-(1-(6-氟-3-(吡啶-2-基)喹喔啉-2-基)乙基)异吲哚啉-1，3-二酮

将2-(1-(3-氯-6-氟喹喔啉-2-基)乙基)异吲哚啉-1，3-二酮(50.14g，140.9mmol)、2-三-正丁基正锡烷基吡啶(纯度80％)(76.95ml，211.4mmol)和四(三苯基膦)合钯(0)(16.29g，14.09mmol)在1，4-二噁烷(1175ml，140.9mmol)中的溶液在110℃下搅拌29h。29h后，将混合物冷却至室温并且减压浓缩，得到绿色浆状固体。向残余物添加DCM(200mL)。在搅拌下将混合物回流加热20min，然后冷却至0℃。过滤收集固体并且用EtOAc-己烷(1∶5，500mL)洗涤，得到想要的产物(52.82g，产率94.07％)。将暗棕色固体溶解于CH2Cl2∶MeOH(9∶1，400mL，暖的)中，通过硅胶塞(150g，8.5cm直径×5.5cm高度)过滤以去除残余钯，并且用CH2Cl2∶MeOH(9∶1，600mL)洗涤。减压浓缩滤液，得到棕色固体(49.94g，产率88.9％)。将棕色固体悬浮于EtOAc-己烷(1∶9，400mL)中，并且将混合物回流加热40min。将混合物冷却至室温，过滤，用EtOAc-己烷(1∶9，600mL)洗涤并且干燥，得到呈褐色固体的想要产物2-(1-(6-氟-3-(吡啶-2-基)喹喔啉-2-基)乙基)异吲哚啉-1，3-二酮(47.76g，产率85.06％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 8.47-8.53(m，1H)，8.20(dd，J＝9.4，5.9Hz，1H)，7.94(dd，J＝9.4，2.7Hz，1H)，7.85(td，J＝8.9，2.9Hz，1H)，7.64-7.80(m，6H)，7.30-7.37(m，1H)，6.42(q，J＝6.9Hz，1H)，1.76(d，J＝7.0Hz，3H)。质谱(ESI)m/e＝399.1(M+1)。
1-(6-氟-3-(吡啶-2-基)喹喔啉-2-基)乙胺

向2-(1-(6-氟-3-(吡啶-2-基)喹喔啉-2-基)乙基)异吲哚啉-1，3-二酮(47.26g，118.6mmol)在乙醇(768.3ml，118.6mmol)中的非均质混合物添加肼-水合物(28.77ml，593.1mmol)，并且在95℃下搅拌混合物1h。非均质反应混合物在15min后溶解，但随后形成大量白色沉淀。1h后，将混合物冷却至室温。用刮刀打碎沉淀，过滤并且用EtOAc(3×250mL，多次)洗涤。减压浓缩滤液。将残余物再溶解于EtOAc(600mL)与水(300mL)中。分离有机层并且用EtOAc(100mL×3)萃取水层。合并的有机层经MgSO4干燥，过滤并且减压浓缩，得到呈棕色固体的1-(6-氟-3-(吡啶-2-基)喹喔啉-2-基)乙胺(30.95g，产率97.25％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 8.75(dq，J＝4.7，0.9Hz，1H)，8.20(dd，J＝9.0，5.9Hz，1H)，7.98-8.11(m，2H)，7.91(dd，J＝9.4，2.7Hz，1H)，7.78-7.86(m，1H)，7.56-7.61(m，1H)，4.66(q，J＝6.7Hz，1H)，2.08(br.S，2H)，1.35(d，J＝6.7Hz，3H)。质谱(ESI)m/e＝269.0(M+1)。[手性HPLC](Chiralpak AD-H柱，0.46×250mm，5um)使用含10％等度的异丙醇的己烷作为洗脱液：在254m处两个峰在9.350min和10.678min；(Chiralpak OD-H柱，0.46×250mm，5um)使用含10％等度的异丙醇的己烷作为洗脱液：在254nm处两个峰在9.69min和11.22min。
(S)-1-(6-氟-3-(吡啶-2-基)喹喔啉-2-基)乙胺
(R)-1-(6-氟-3-(吡啶-2-基)喹喔啉-2-基)乙胺

手性分离：使用SFC对外消旋混合物(30.95g)进行手性分离。将样品溶解于800mL MeOH(+痕量TFA)中，每次注入1.3mL样品溶液，即50.3mg到分离系统上。如下进行半制备型超临界流体色谱法(SFC)：使用Thar 350SFC(出口压力117巴，327nm)，利用AS-H柱，250×30mm(5微米)，流动相：36g/min MeOH(0.2％DEA)+54g/minCO2(温度＝22℃)手性分离后，将每个级分与甲苯和乙醇共蒸发两次以去除二乙胺。AS-H柱上的第一个峰和AD-H柱上的第二个峰(10.678min)：呈棕色固体的(R)-1-(6-氟-3-(吡啶-2-基)喹喔啉-2-基)乙胺(13.5173g，50.4mmol，产率43.7％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 8.76(dq，J＝4.7，0.9Hz，1H)，8.20(dd，J＝9.0，5.9Hz，1H)，7.99-8.10(m，2H)，7.91(dd，J＝9.4，2.7Hz，1H)，7.82(td，J＝8.9，2.9Hz，1H)，7.56-7.61(m，1H)，4.66(q，J＝6.7Hz，1H)，2.07(s，2H)，1.35(d，J＝6.7Hz，3H)，它含有三苯基氧膦；质谱(ESI)m/e＝269.0(M+1)。[HPLC]一个峰在4.996min，在254nm处纯度99.56％；[手性HPLC](Chiralpak AD-H柱，0.46×250mm，5mm)使用含10％等度的异丙醇的己烷作为洗脱液：在254nm处一个峰在11.432min(第二洗脱对映异构体)；[对映异构体过量分析]：99％ee，在AS-H柱上的第一洗脱对映异构体。AS-H柱上的第二个峰和AD-H柱上的第一个峰(9.350min)：呈棕色浆状固体的(S)-1-(6-氟-3-(吡啶-2-基)喹喔啉-2-基)乙胺(12.6738g，47.2mmol，产率40.9％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 8.73-8.78(m，J＝4.8，1.2，0.9，0.9Hz，1H)，8.20(dd，J＝9.4，5.9Hz，1H)，7.99-8.10(m，2H)，7.91(dd，J＝9.4，2.7Hz，1H)，7.82(td，J＝8.9，2.9Hz，1H)，7.58(ddd，J＝7.4，4.9，1.4Hz，1H)，4.66(q，J＝6.4Hz，1H)，2.07(br.s.，2H)，1.35(d，J＝6.7Hz，3H)；质谱(ESI)m/e＝269.0(M+1)。[手性HPLC](Chiralpak AD-H柱，0.46×250mm，5mm)使用含10％等度的异丙醇的己烷作为洗脱液：在254nm处一个峰在9.135min(第一洗脱对映 异构体)；[对映异构体过量分析]：98.86％ee，在AS-H柱上的第二洗脱对映异构体。在下一步骤中，该立体化学被确认为S-异构体。
(S)-4-氨基-6-((1-(6-氟-3-(吡啶-2-基)喹喔啉-2-基)乙基)氨基)嘧啶-5-甲腈

将4-氨基-6-氯吡啶-5-甲腈(0.060g，0.39mmol)、(S)-1-(6-氟-3-(吡啶-2-基)喹喔啉-2-基)乙胺(0.105g，0.391mmol)和N，N-二异丙基乙胺(0.205mL，1.17mmol)在丁-1-醇(3.91mL)中的混合物在120℃下搅拌3h。3h后，将混合物去热，并保持在室温下。减压浓缩混合物，得到黄色固体。向所述黄色固体添加水(30mL)。过滤所得固体，用水(30mL)洗涤并且风干，得到呈橙色固体的产物。将棕色固体通过在40g的Redi-Sep柱上的柱色谱法使用0至50％梯度的CH2Cl2∶MeOH∶NH4OH(89∶9∶1)的CH2Cl2溶液(14min)，接着50％等度的CH2Cl2∶MeOH∶NH4OH(89∶9∶1)的CH2Cl2溶液(14min)作为洗脱液来纯化，得到浅黄色固体(0.1246g)。将浅黄色固体悬浮于EtOAc-己烷(1∶4)中，过滤并且干燥，得到呈褐色固体的(S)-4-氨基-6-((1-(6-氟-3-(吡啶-2-基)喹喔啉-2-基)乙基)氨基)嘧啶-5-甲腈(0.1121g，0.290mmol，产率74.1％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 8.66-8.74(m，1H)，8.19(dd，J＝9.4，5.9Hz，1H)，7.99-8.09(m，2H)，7.95(dd，J＝9.4，2.7Hz，1H)，7.80-7.89(m，2H)，7.70(d，J＝7.4Hz，1H)，7.53(ddd，J＝6.9，5.0，1.8Hz，1H)，7.20(br.s.，2H)，6.09-6.21(m，1H)，1.54(d，J＝6.7Hz，3H)；质谱(ESI)m/e＝387.1(M+1)。[手性HPLC](Chiralpak AD-H柱， 0.46×250mm，5mm)使用含10％等度的异丙醇的己烷作为洗脱液：在254nm处一个峰在16.038min。
生物测定
PI3K的重组表达
N末端被polyHis标记物标记的PI3kα、β和δ的全长p110亚单元与p85一起用Baculo病毒表达载体共表达于sf9昆虫细胞中。依次利用Ni-NTA、Q-HP、Superdex-100色谱法纯化P110/p85异二聚体。纯化的α、β和δ同工酶于20mM Tris(pH8)、0.2M NaCl、50％甘油、5mM DTT、2mM胆酸钠中储藏在-20℃下。N末端被polyHis标记物标记的截断的PI3Kγ，残基114-1102用Baculo病毒表达于Hi5昆虫细胞中。依次利用Ni-NTA、Superdex-200、Q-HP色谱法纯化γ同工酶。γ同工酶于NaH2PO4(pH 8)、0.2M NaCl、1％乙二醇、2mMβ-巯基乙醇中冷冻储藏于-80℃下。
 αβδγ50mM TrispH 8pH 7.5pH 7.5pH 8MgCl215mM10mM10mM15mM胆酸钠2mM1mM0.5mM2mMDTT2mM1mM1mM2mMATP1uM0.5uM0.5uM1uMPIP2无2.5uM2.5uM无时间1h2h2h1h[酶]15nM40nM15nM50nM
体外酶测定。
测定在白色聚丙烯板(Costar 3355)中以25μL上述最终浓度的组分进行。磷脂酰肌醇磷酸受体PtdIns(4，5)P2 P4508来自Echelon Biosciences。α和γ同工酶的ATPase活性在这些条件下不大幅度地受PtdIns(4，5)P2刺激，并且因此自这些同工酶的测定中省去。测试化合物溶解于二甲亚砜中并且用三倍连续稀释液稀释。每测试孔添加含化 合物的DMSO(1μL)，并且测定有和无酶时相对于不含化合物的反应的抑制。在室温下测定孵育后，停止反应并且根据制造商的说明书通过添加等体积的商业ATP生物发光试剂盒(Perkin Elmer EasyLite)测定残余ATP并使用AnalystGT光度计检测。
由抗IgM刺激人类B细胞增殖
分离人类B细胞：
从Leukopac或从人类新鲜血液中分离PBMC。通过使用Miltenyi方案和B细胞分离试剂盒II分离人类B细胞。-通过使用AutoMacs柱纯化人类B细胞。
活化人类B细胞
使用96孔平底板，每孔涂铺50000个于B细胞增殖培养基(DMEM+5％FCS，10mM Hepes，50μM 2-巯基乙醇)中的纯化的B细胞；150μL培养基含有250ng/mL CD40L-LZ重组蛋白质(Amgen)和2μg/mL抗人类IgM抗体(Jackson ImmunoReseach Lab.#109-006-129)，与50μL含有PI3K抑制剂的B细胞培养基混合并且在37℃孵育箱中孵育72小时。72小时后，每孔用0.5-1uCi 3H胸苷脉冲标记B细胞过夜，约18h，并且使用TOM收集器收集细胞。
由IL-4刺激人类B细胞增殖
分离人类B细胞：
从Leukopac或从人类新鲜血液中分离人类PBMC。使用Miltenyi方案-B细胞分离试剂盒分离人类B细胞。由AutoMacs柱纯化人类B细胞。
活化人类B细胞
使用96孔平底板，每孔涂铺50000个于B细胞增殖培养基 (DMEM+5％FCS，50μM 2-巯基乙醇，10mM Hepes)中的纯化的B细胞。培养基(150μL)含有250ng/mL CD40L-LZ重组蛋白质(Amgen)和10ng/mL IL-4(R&D系统#204-IL-025)，与50150μL含有化合物的B细胞培养基混合并且在37℃孵育箱中孵育72小时。72小时后，每孔用0.5-1uCi 3H胸苷脉冲标记B细胞过夜，约18h，并且使用TOM收集器收集细胞。
特异性T抗原(破伤风类毒素)诱导的人类PBMC增殖测定
由冷冻储备液制备人类PBMC或使用Ficoll梯度从新鲜人类血液纯化。使用96孔圆底板，并且每孔涂铺2×105个于培养基(RPMI1640+10％FCS，50uM 2-巯基乙醇，10mM Hepes)中的PBMC。对于IC50测定，从10μM到0.001μM测试PI3K抑制剂，以半对数(half log)为增量并且一式三份。添加1μg/mL的破伤风类毒素，即T细胞特异性抗原(University of Massachusetts Lab)并且在37℃孵育箱中孵育6天。6天后收集上清液用于IL2 ELISA测定，然后用3H-胸苷脉冲细胞约18小时以测量增殖。
用于检测Ia类和III类PI3K抑制的GFP测定
由有丝分裂因子(IGF-1、PDGF、胰岛素、凝血酶、NGF等)活化的Ia类PI3K调控AKT1(PKBa)。应答促有丝分裂刺激，AKT1从细胞质中移位到质膜中
叉头(FKHRL1)是AKT1的底物。当通过AKT(存活/生长)磷酸化时，它是细胞质的。AKT的抑制(停滞/细胞凋亡)-叉头移位到细胞核中
FYVE域结合PI(3)P。大部分由III类PI3K的组成性作用产生
AKT膜边缘波动测定(CHO-IR-AKT1-EGFP细胞/GE Healthcare)
用测定缓冲液洗涤细胞。用于测定缓冲液中的化合物处理1小时。添加10ng/mL胰岛素。10min后在室温下固定并成像
叉头移位测定(MDA MB468叉头-DiversaGFP细胞)
用于生长培养基中的化合物处理细胞1小时。固定并成像。
III类PI(3)P测定(U2OS EGFP-2XFYVE细胞/GE Healthcare)
用测定缓冲液洗涤细胞。用于测定缓冲液中的化合物处理1小时。固定并成像。
所有3个测定的对照都是10uM渥曼青霉素：
AKT是细胞质的
叉头是细胞核的
耗竭来自核内体的PI(3)P
生物标志物测定：CD69或B7.2(CD86)表达的B细胞受体刺激
用10μg/mL抗IgD(Southern Biotech，#9030-01)刺激肝素化的人类全血。然后给96孔板的每孔等分90μL刺激的血液并用10μL于IMDM+10％FBS(Gibco)中稀释的各种浓度的阻断化合物(10-0.0003μM)处理。样品一起在37℃下孵育4小时(对于CD69表达)到6小时(对于B7.2表达)。将处理的血液(50μL)转移到96孔深孔板(Nunc)中用于以各10μLCD45-PerCP(BD Biosciences，#347464)、CD 19-FITC(BD Biosciences，#340719)和CD69-PE(BD Biosciences，#341652)给抗体染色。将第二份50μL处理的血液转移到第二个96孔深孔板中用于以各10μL CD 19-FITC(BD Biosciences，#340719)和CD86-PeCy5(BD Biosciences，#555666)给抗体染色。所有染色都在黑暗中在室温下进行15-30min。然后细胞溶解血液并且在室温下使用450μLFACS细胞溶解溶液(BD Biosciences，#349202)固定15min。然后以PBS+2％ FBS洗涤样品2次，之后进行FACS分析。将样品对CD45/CD19双阳性细胞(对于CD69染色)或CD19阳性细胞(对于CD86染色)筛选。
γ反向筛选(Counterscreen)：刺激人类单核细胞以进行phospho-AKT表达
人类单核细胞细胞系THP-1维持在RPMI+10％FBS(Gibco)中。在刺激前一天，使用锥虫蓝排阻在血细胞计数器上计数细胞并悬浮，浓度为每毫升培养基1×106个细胞。然后给4个96孔深孔皿(Nunc)的每孔等分100μL细胞+培养基(1×105个细胞)以测试8种不同的化合物。使细胞静置过夜，之后用各种浓度(10-0.0003μM)的阻断化合物处理。在37℃下向细胞中添加于培养基(12μL)中稀释的化合物持续10min。在培养基中稀释人类MCP-1(12μL，R&D Diagnostics，#279-MC)，并且添加到各孔中，最终浓度为50ng/mL。在室温下持续刺激2min。向各孔中添加预热的FACS Phosflow细胞溶解/固定缓冲液(1mL，37℃)(BD Biosciences，#558049)。然后在37℃下孵育板，持续另外的10-15min。在1500rpm下旋转板10min，吸出上清液，且在剧烈振荡下向各孔中添加1mL冰冷的90％MEOH。然后在-70℃下孵育板过夜或在冰上孵育30min，之后给抗体染色。旋转板并且以PBS+2％FBS(Gibco)洗涤2次。吸出洗涤液，并且细胞悬浮于剩余缓冲液中。在室温下在振荡下向各样品中添加兔pAKT(50μL，Cell Signaling，#4058L)(1∶100)持续1小时。洗涤细胞并且在1500rpm下旋转10min。吸出上清液，并且细胞悬浮于剩余缓冲液中。在室温下在振荡下添加二次抗体山羊抗兔Alexa 647(50μL，Invitrogen，#A21245)(1∶500)，持续30min。然后于缓冲液中洗涤细胞1次并悬浮于150μL缓冲液中以用于FACS分析。细胞需要通过吸移充分分散，之后在流式细胞仪上操作。在LSR II(Becton Dickinson)上操作细胞并且在前置和侧向散射器上筛选以测定pAKT于单核细胞群中的表达水平。
γ反向筛选：刺激单核细胞以在小鼠骨髓中进行phospho-AKT表达
从五只雌性BALB/小鼠(Charles River Labs.)切割小鼠股骨并且收集到RPMI+10％FBS培养基中(Gibco)。通过切割股骨端并用25号针以1mL培养基冲洗取出小鼠骨髓。然后使用21号针将骨髓分散于培养基中。培养基体积增至20mL并且使用锥虫蓝排阻在血细胞计数器上计数细胞。然后细胞混悬液增至每1毫升培养基7.5×106个细胞并且给4个96孔深孔皿(Nunc)的每孔等分100μL(7.5×105个细胞)以测试8种不同的化合物。使细胞在37℃下静置2小时，之后用各种浓度(10-0.0003μM)的阻断化合物处理。在37℃下向骨髓细胞中添加于培养基(12μL)中稀释的化合物持续10min。在培养基中稀释小鼠MCP-1(12μL，R&D Diagnostics，#479-JE)，并且添加到各孔中，最终浓度为50ng/mL。在室温下持续刺激2min。向各孔中添加1mL 37℃的预热的FACS Phosflow细胞溶解/固定缓冲液(BD Biosciences，#558049)。然后在37℃下孵育板，持续另外的10-15min。在1500rpm下旋转板10min。吸出上清液，并且在剧烈振荡下向各孔中添加1mL冰冷的90％MEOH。然后在-70℃下孵育板过夜或在冰上孵育30min，之后给抗体染色。旋转板并且以PBS+2％FBS(Gibco)洗涤2次。吸出洗涤液，并且细胞悬浮于剩余缓冲液中。然后在室温下每孔添加Fc阻断液(2μL，BD Pharmingen，#553140)持续10min。阻断后，在室温下在振荡下向各样品中添加50μL于缓冲液中稀释的一次抗体CD11b-Alexa488(BD Biosciences，#557672)(1∶50)，CD64-PE(BD Biosciences，#558455)(1∶50)，和兔pAKT(Cell Signaling，#4058L)(1∶100)，持续1h。向细胞添加洗涤缓冲液并且在1500rpm下旋转10min。吸出上清液，并且细胞悬浮于剩余缓冲液中。在室温下在振荡下添加二次抗体山羊抗兔Alexa 647(50μL，Invitrogen，#A21245)(1∶500)，持续30min。然后于缓冲液中洗涤细胞1次并悬浮于100μL缓冲液中以用于FACS分析。在LSR II(Becton Dickinson)上操作细胞并且对CD11b/CD64双阳性细胞筛选以测定pAKT于单核细胞群中的表达水平。
pAKT体内测定
通过强饲法(口服强饲针，Popper&Sons，New Hyde Park，NY)给小鼠(转基因细胞系3751，雌性，10-12周，Amgen Inc，Thousand Oaks，CA)经口施用媒介物和化合物(0.2mL)，15min之后经静脉注射(0.2mL)抗IgM FITC(50ug/小鼠)(Jackson Immuno Research，West Grove，PA)。45min后，在CO2腔室内将小鼠致死。经由心脏穿刺(0.3mL)(1cc25g注射器，Sherwood，St.Louis，MO)抽取血液并转移到15mL锥形小瓶(Nalge/Nunc International，Denmark)中。立刻用6.0mL BD Phosflow细胞溶解/固定缓冲液(BD Bioscience，San Jose，CA)固定血液，翻转3次并且放置在37℃水浴中。去除一半脾并且转移到含有0.5mL PBS(Invitrogen Corp，Grand Island，NY)的eppendorf试管中。使用组织研磨器粉碎脾(Pellet Pestle，Kimble/Kontes，Vineland，NJ)并且立刻用6.0mL BD Phosflow细胞溶解/固定缓冲液固定，翻转3次并且放置在37℃水浴中。一旦收集到组织，就将小鼠颈脱位并处置尸体。15min后，自37℃水浴中移出15mL锥形小瓶并放置在冰上直到组织进一步被处理。经70μm细胞过滤器(BD Bioscience，Bedford，MA)过滤粉碎的脾到另一15mL锥形小瓶中，并用9mL PBS洗涤。在2,000rpm下旋转脾细胞和血液10min(冷)，并且吸出缓冲液。细胞再悬浮于2.0mL冷(-20℃)90％甲醇(Mallinckrodt Chemicals，Phillipsburg，NJ)中。缓慢添加MeOH，同时快速使锥形小瓶旋涡。然后将组织储藏在-20℃下直到细胞可染色用于FACS分析。
多剂量TNP免疫
在免疫前第0天，通过从7-8周龄BALB/c雌性小鼠(Charles River Labs.)球后眼放血收集血液。允许血液凝结30min并且在10,000rpm下于microtainer血浆试管(Becton Dickinson)中旋转10min。收集血浆，在Matrix试管(Matrix Tech.Corp.)中等分并储藏在-70℃下直到进行ELISA。免疫之前以及在基于分子使用寿命的后续时间经口给予小鼠化合物。然后用含50μg TNP-LPS(Biosearch Tech.，#T-5065)、50μg TNP-Ficoll(Biosearch Tech.，#F-1300)或100μg TNP-KLH(Biosearch Tech.，#T-5060)+1％明矾(Brenntag，#3501)的PBS使小鼠免疫。在免疫 之前，通过每10min轻轻翻转混合物3-5次，持续1小时制备TNP-KLH+明矾溶液。第5天，最后处理之后，将小鼠CO2致死并且心脏穿刺。允许血液凝结30min并且在10,000rpm下于microtainer血浆试管中旋转10min。收集血浆，在Matrix试管中等分并储藏在-70℃下直到进行进一步分析。然后经由ELISA测量血清中TNP特异性IgG1、IgG2a、IgG3和IgM的水平。使用TNP-BSA(Biosearch Tech.，#T-5050)捕获TNP特异性抗体。使用TNP-BSA(10μg/mL)涂布384孔ELISA板(Corning Costar)过夜。然后洗涤板，并且使用10％BSAELISA阻断溶液(KPL)阻断1小时。阻断之后，洗涤ELISA板并且连续稀释血清样品/标准物，并且使之结合板1小时。洗涤板并且1∶5000稀释Ig-HRP偶联的二次抗体(山羊抗小鼠IgG1，Southern Biotech#1070-05，山羊抗小鼠IgG2a，Southern Biotech#1080-05，山羊抗小鼠IgM，Southern Biotech#1020-05，山羊抗小鼠IgG3，Southern Biotech#1100-05)并于板上孵育1h。使用TMB过氧化酶溶液(SureBlue Reserve TMB，来自KPL)观察抗体。洗涤板，并且于TMB溶液中使样品显色约5-20min，视所分析的Ig而定。用2M硫酸停止反应并且在450nm OD下读取板。


对于PI3Kδ介导的疾病的治疗，所述疾病如类风湿性关节炎、强直性脊椎炎、骨关节炎、银屑病关节炎、银屑病、炎症性疾病和自身免疫疾病，本发明化合物可于含有常规药学上可接受的载体、佐剂和媒介物的剂量单位制剂中经口、肠胃外、吸入喷雾、直肠或局部施用。如本文所用的术语肠胃外包括皮下、静脉内、肌肉内、胸骨内、输注技术或腹膜内。
本文中疾病和病症的治疗还意在包括对被认为需要预防性治疗(例如像类风湿性关节炎、强直性脊椎炎、骨关节炎、银屑病关节炎、银屑病、炎症性疾病和自身免疫疾病等)的受试者(即动物，优选哺乳动物，最优选人类)预防性施用本发明的化合物、其药物盐或药物组合物。
用本发明的化合物和/或本发明的组合物治疗PI3Kδ介导的疾病、癌症和/或高血糖症的给药方案基于多种因素，包括疾病类型，患者年龄、体重、性别、医学病状、病状严重性、给药途径和所采用的特定化合物。因此，给药方案可广泛变化，但通常可使用标准方法确定。约每天每千克体重约0.01mg至30mg、优选约0.1mg至10mg/kg、更优选约0.25mg至1mg/kg数量级的剂量水平适用于本文公开使用的所有方法。
本发明的药学活性化合物可根据药剂学常规方法加工产生医学试剂以对包括人类和其它哺乳动物的患者施用。
对经口施用来说，药物组合物可呈例如胶囊、片剂、混悬液或液体形式。药物组合物优选呈含有指定量的活性成分的剂量单位形式。例如，这些可含有的活性成分的量为约1至2000mg、优选约1至500mg、更优选约5至150mg。适合于人类或其它哺乳动物的日剂量可广泛变化，视患者病状和其它因素而定，但是同样可使用常规方法确定。
活性成分也可通过以与适合的载体(包括盐水、右旋糖或水)的组合物形式注射施用。每日肠胃外给药方案应为每千克总体重约0.1至约30mg、优选约0.1至约10mg/kg、并且更优选约0.25mg至1mg/kg。
可注射制剂，如无菌可注射水性或油性混悬液可根据已知技术使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制。无菌可注射制剂也可为在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或混悬液，例如为在1，3-丁二醇中的溶液。可使用的可接受的媒介物和溶剂为水、林格氏液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的不挥发油通常用作溶剂或悬浮介质。出于此目的，可以采用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。另外，如油酸的脂肪酸在可注射制剂中获得应用。
药物的直肠施用的栓剂可通过混合药物与在常温下呈固体但在直肠温度下呈液体并且因此将在直肠中融化并释放药物的适合的无刺激性的赋形剂(如可可脂和聚乙二醇)来制备。
本发明化合物的活性成分的适合的局部剂量为0.1mg至150mg，每日施用一至四次，优选一次或两次。对局部施用来说，活性成分可占制剂的0.001％至10％w/w，例如1％至2％w/w，虽然它可占制剂的多达10％w/w，但优选不超过5％w/w，并且更优选0.1％至1％。
适合局部施用的制剂包括适合渗透皮肤的液体或半液体制剂(例如擦剂、洗剂、膏剂、乳膏或糊剂)和适合眼、耳或鼻施用的滴剂。
施用时，本发明的化合物通常与一种或多种适于指示的给药途径的佐剂组合。化合物可与乳糖、蔗糖、淀粉、烷酸的纤维素酯、硬脂酸、滑石、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸和硫酸的钠盐和钙盐、阿拉伯胶、明胶、海藻酸钠、聚乙烯吡咯啶和/或聚乙烯醇混合，并且常规施用时制成片剂或胶囊。或者，本发明的化合物可溶解于盐水、水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇、玉米油、花生油、棉花子油、芝麻油、黄蓍胶和/或各种缓冲液中。其它佐剂和给药模式在药学领域中是众所周知的。载体或佐剂可包括延时物质，如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯单独或与蜡一起，或本领域中众所周知的其它物质。
药物组合物可呈固体形式(包括颗粒剂、散剂或栓剂)或液体形式(例如溶液、混悬液或乳液)。药物组合物可进行常规医药操作，如灭菌，和/或可含有常规佐剂，如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、缓冲液等。
用于经口施用的固体剂型可包括胶囊、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物可与至少一种惰性稀释剂(如蔗糖、乳糖或淀粉)混合。这些剂型也可如在标准实践中包含除惰性稀释剂以外的其它物质，例如润滑剂，如硬脂酸镁。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型也可包含缓冲剂。片剂和丸剂可另外用肠溶衣制备。
用于经口施用的液体剂型可包括含有本领域中常用的惰性稀释剂(如水)的药学上可接受的乳液、溶液、混悬液、糖浆和酏剂。这些组合物也可包含佐剂，如润湿剂、增甜剂、调味剂和芳香剂。
本发明的化合物可具有一个或多个不对称碳原子，并且因此能够呈光学异构体形式以及呈其外消旋或非外消旋混合物形式。光学异构体可根据常规方法通过拆分外消旋混合物来获得，例如通过形成非对映异构体盐、通过用光学活性酸或碱处理。适当的酸的实例为酒石酸、 二乙酰基酒石酸、二苯甲酰基酒石酸和樟脑磺酸，然后通过结晶分离非对映异构体混合物，接着从这些盐中释放光学活性碱。分离光学异构体的另一种方法涉及使用最佳选择用于最大化对映异构体的分离的手性色谱柱。又一种可利用的方法涉及通过使本发明化合物与呈活性形式的光学纯酸或光学纯异氰酸盐反应合成共价非对映异构体分子。合成的非对映异构体可利用常规方法(如色谱法、蒸馏、结晶或升华)分离，然后水解以递送对映异构纯的化合物。本发明的光学活性化合物同样可通过使用活性起始物质获得。这些异构体可呈游离酸、游离碱、酯或盐形式。
同样地，本发明化合物可呈异构体形式，即具有相同分子式但彼此间的原子排列不同的化合物。具体来说，本发明化合物的亚烷基取代基通常并且优选如关于这些基团每个的定义所指示排列和插在分子中，从左到右阅读。然而，在某些情况下，本领域技术人员应了解，有可能制备这些取代基方向相对于分子中的其它原子反向的本发明化合物。也就是，欲插入的取代基可与上述取代基相同，只是其在相反方向上插入分子中。本领域技术人员应了解，本发明化合物的这些异构形式应理解为涵盖在本发明的范围内。
本发明化合物可呈衍生自无机酸或有机酸的盐形式使用。这些盐包括但不限于：乙酸盐、已二酸盐、海藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、葡萄糖酸盐、环戊烷丙酸盐、十二烷基硫酸盐、乙烷磺酸盐、葡糖庚酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙烷磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、2-苯基丙酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、丁二酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、甲磺酸盐以及十一烷酸盐。另外，碱性含氮基团可用如下试剂季铵化：如低级烷基卤化物，如甲基、乙基、丙基和丁基的氯化物、溴化物和碘化物；硫酸二烷酯，如硫酸二甲酯、硫酸二乙酯、硫酸二丁酯和硫酸二戊酯；长链卤化物，如癸基、 月桂基、十四烷基和十八烷基的氯化物、溴化物和碘化物；芳烷基卤化物，如苯甲基和苯乙基溴化物等。因此获得水或油可溶性或可分散性产物。
可用于形成药学上可接受的酸加成盐的酸的实例包括无机酸，如盐酸、硫酸和磷酸，和有机酸，如草酸、马来酸、丁二酸和柠檬酸。其它实例包括与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)或有机碱形成的盐。
本发明的范围内还涵盖含羧酸或羟基的基团的药学上可接受的酯，包括本发明化合物的代谢不稳定酯或前药形式。代谢不稳定酯是可导致例如血液水平增加并延长化合物的相应非酯化形式功效的酯。前药形式是施用时不为分子的活性形式但在一些体内活性或生物转型(如代谢，例如酶促或水解裂解)之后变成治疗活性的形式。关于酯的前药的一般讨论，参看Svensson和Tunek Drug Metabolism Reviews165(1988)和Bundgaard Design of Prodrugs，Elsevier(1985)。掩蔽羧酸根阴离子的实例包括多种酯，如烷基(例如甲基、乙基)、环烷基(例如环己基)、芳烷基(例如苯甲基、对甲氧苯甲基)和烷基羰氧基烷基(例如特戊酰氧基甲基)。胺已掩蔽成芳基羰氧基甲基取代的衍生物，其在体内被酯酶裂解释放游离药物和甲醛(Bungaard J.Med.Chem.2503(1989))。另外，含如咪唑、酰亚胺、吲哚等酸性NH基团的药物已用N-酰氧基甲基掩蔽(Bundgaard Design of Prodrugs，Elsevier(1985))。羟基已掩蔽成酯和醚。EP 039,051(Sloan和Little，4/11/81)揭示曼尼希碱异羟肟酸前药、其制备及用途。本发明化合物的酯可包括例如甲基、乙基、丙基和丁基酯以及在酸性部分与含羟基部分之间形成的其它适合的酯。代谢不稳定酯可包括例如甲氧基甲基、乙氧基甲基、异丙氧基甲基、α-甲氧基乙基；如α-((C1-C4)烷氧基)乙基的基团，例如甲氧基乙基、乙氧基乙基、丙氧基乙基、异丙氧基乙基等；2-氧代-1，3-二氧杂环戊烯-4-基甲基，如5-甲基-2-氧代-1，3-二氧杂环戊烯-4-基甲基等；C1-C3烷基硫代甲基，例如甲基硫代甲基、乙基硫代甲基、异丙基硫代甲基等；酰氧基甲基，例如特戊酰氧甲基、α-乙酰氧基甲基等； 乙氧基羰基-1-甲基；或α-酰氧基-α-取代甲基，例如α-乙酰氧基乙基。
另外，本发明化合物可呈结晶固体形式，其可自如乙醇、N，N-二甲基甲酰胺、水等常用溶剂中结晶。因此，本发明化合物的结晶形式可呈母体化合物或其药学上可接受的盐的多晶形、溶剂化物和/或水合物形式。所有这些形式同样应理解为属于本发明的范围。
虽然本发明化合物可以单一活性药剂施用，但其也可与一种或多种本发明化合物或其它试剂组合使用。当组合施用时，治疗剂可配制成分开的组合物，即同时或不同时给予，或治疗剂可以单一组合物形式给予。
上文仅说明本发明并且不意在将本发明局限于所公开的化合物。本领域技术人员显而易见的变更和变化也意欲在所附权利要求书内定义的本发明的范围和性质内。
从上文描述，本领域技术人员可容易地探知本发明的必需特性，并且在不脱离本发明精神和范围的情况下，可对本发明进行各种变化和修饰以使之适于各种使用和条件。