一种与植物抗逆性相关蛋白及其编码基因GSSKP21与应用.pdf

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410577857.X (22)申请日 2014.10.24 C07K 14/415(2006.01) C12N 15/29(2006.01) C12N 15/74(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 15/84(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (71)申请人 东北农业大学 地址 150030 黑龙江省哈尔滨市香坊区木材 街 59 号 申请人 黑龙江八一农垦大学 (72)发明人 朱延明 孙晓丽 刘艾林 端木慧子 肖佳雷 于洋 孙明哲 段香波 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权。

2、代理有限 公司 11245 代理人 关畅 陈晓庆 (54) 发明名称 一种与植物抗逆性相关蛋白及其编码基因 GsSKP21 与应用 (57) 摘要 本发明公开了一种与植物耐碱性相关蛋白及 其编码基因GsSKP21与应用。 该蛋白质， 是如下a) 或b)的蛋白质 ： a)由序列表中序列2所示的氨基 酸序列组成的蛋白质 ； b) 将序列表中序列 2 所示 的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代 和 / 或缺失和 / 或添加且与植物抗逆性相关的蛋 白质。 本发明通过实验证明， 本发明的蛋白具有提 高植物抗逆性的功能， 该蛋白在植物育种方面具 有重要应用价值。 (51)Int.Cl. (19)中华。

3、人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 序列表6页 附图6页 (10)申请公布号 CN 104387461 A (43)申请公布日 2015.03.04 CN 104387461 A 1/1 页 2 1. 蛋白质， 是如下 a) 或 b) 的蛋白质 ： a) 由序列表中序列 2 所示的氨基酸序列组成的蛋白质 ； b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和 / 或添加且与植物抗逆性相关的蛋白质。 2. 与权利要求 1 所述蛋白质相关的生物材料， 为下述 B1) 至 B3) 中的任一种 ： B1) 编码权利要求 1 所述蛋白。

4、的核酸分子 ； B2) 含有 B1) 所述核酸分子的重组载体 ； B3) 含有 B1) 所述核酸分子的重组菌、 或含有 B2) 所述重组载体的重组菌。 3.根据权利要求2所述的相关生物材料， 其特征在于 ： B1)所述核酸分子的核苷酸序列 是序列表中序列 1。 4. 权利要求 1 所述蛋白质、 或权利要求 2 或 3 所述相关生物材料在提高植物抗逆性中 的应用。 5. 根据权利要求 4 所述的应用， 其特征在于 ： 所述抗逆性为抗碱胁迫。 6. 一种构建转基因植物的方法， 包括如下步骤 ： 使权利要求 1 所述蛋白质在出发植物 中过表达， 进而使植物的抗逆性提高和 / 或使植物对 ABA 的敏。

5、感性降低。 7. 根据权利要求 6 所述的方法， 其特征在于 ： 所述使权利要求 1 所述蛋白质在受体植 物中过表达的方法为 ： 向出发植物中导入权利要求 1 所述蛋白质的编码基因， 得到转基因 植物 ； 转基因植物与出发植物相比， 抗逆性提高和 / 或对 ABA 的敏感性降低。 8. 根据权利要求 6 或 7 所述的方法， 其特征在于 ： 所述蛋白质的编码基因是序列表序 列 1 中第 1-1041 位核苷酸的 DNA 分子。 9. 根据权利要求 6-8 所述的方法， 其特征在于 ： 所述抗逆性为抗碱胁迫。 10. 根据权利要求 6-9 中任一所述的方法， 其特征在于 ： 所述出发植物为单子叶。

6、植物或 双子叶植物 ； 所述双子叶植物具体为拟南芥。 权 利 要 求 书 CN 104387461 A 2 1/7 页 3 一种与植物抗逆性相关蛋白及其编码基因 GsSKP21 与应用 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 具体为一种与植物抗逆性相关蛋白及其编码基因 GsSKP21 与应用。 背景技术 0002 盐碱胁迫是影响农作物生产的主要因素之一， 严重影响作物的产量与质量， 是制 约我国农业生产和亟待解决的重要问题。与盐胁迫相比， 碱胁迫除了土壤水势降低产生的 渗透胁迫和细胞内高浓度盐分累积产生的离子毒害外， 还使土壤保持较高 pH 值 (8.0)。 由于碱性盐离子 CO32-和。

7、 HCO3-的存在， 可以直接破坏根细胞的结构和功能， 使 Ca2+， Mg2+， H2PO4-离子发生沉淀， 从而破坏植物细胞的动态离子平衡。 植物应对不利的环境变化有复杂 的调控机制和传导系统， 近年来， 对植物胁迫应答机制的研究已经取得了巨大的成绩， 如调 控渗透胁迫的 MAPK 信号传导途径和介导离子胁迫的 SOS 信号转导通路。然而大部分机制 研究主要是集中在盐胁迫中， 对碱胁迫的信号传导通路研究仍非常有限。 发明内容 0003 本发明的一个目的是提供一种蛋白质。 0004 本发明提供的蛋白质， 是如下 a) 或 b) 的蛋白质 ： 0005 a) 由序列表中序列 2 所示的氨基酸序。

8、列组成的蛋白质 ； 0006 b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和 / 或添加且与植物抗逆性相关的蛋白质。 0007 本发明还提供了与上述蛋白质相关的生物材料， 为下述 B1) 至 B3) 中的任一种 ： 0008 B1) 编码上述蛋白质的核酸分子 ； 0009 B2) 含有 B1) 所述核酸分子的重组载体 ； 0010 B3) 含有 B1) 所述核酸分子的重组菌、 或含有 B2) 所述重组载体的重组菌。 0011 上述生物材料中， B1) 所述核酸分子的核苷酸序列如序列表中序列 1 所示。 0012 本发明另一个目的是提供上述所述蛋白质或所述相关生。

9、物材料在提高植物抗逆 性中的应用。 0013 上述应用中， 所述抗逆性为抗碱胁迫。 0014 本发明最后一个目的是提供一种构建转基因植物的方法。 0015 本发明所提供的构建转基因植物的方法， 包括如下步骤 ： 使上述蛋白质在出发植 物中过表达， 进而使植物的抗逆性提高和 / 或使植物对 ABA 的敏感性降低。 0016 上述方法中， 所述蛋白质在受体植物中过表达的方法为 ： 向出发植物中导入上述 蛋白质的编码基因， 得到转基因植物 ； 转基因植物与出发植物相比， 抗逆性提高和 / 或对 ABA 的敏感性降低。 0017 上述方法中， 所述蛋白质的编码基因是序列表序列 1 中第 1-1041 。

10、位核苷酸的 DNA 分子。 说 明 书 CN 104387461 A 3 2/7 页 4 0018 上述方法中， 所述抗逆性为抗碱胁迫。 0019 上述方法中， 所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物 ； 所述双子叶植物具体为 拟南芥。 0020 本发明提供了一种与植物耐碱性相关蛋白及其编码基因 GsSKP21 与应用。本发明 通过实验证明， 本发明的蛋白具有提高植物抗逆性的功能， 该蛋白在植物育种方面具有重 要应用价值。 附图说明 0021 图 1 为基因枪轰击洋葱表皮后观察 GsSKP21 蛋白亚细胞定位结果。 0022 图 2 为野生大豆中在盐和碱处理下 GsSKP21 基因转录水平表达量。

11、的变化。 0023 图 3 为转基因拟南芥在种子萌发期及幼苗期对碱胁迫的响应。图 3A 为转基因拟 南芥与野生型拟南芥种子在碱胁迫下种子的萌发情况 ； 图 3B 为转基因拟南芥与野生型拟 南芥种子在碱胁迫下的萌发率 ； 图 3C 为转基因拟南芥与野生型拟南芥种子在碱胁迫下的 展叶率 ； 图 3D 为转基因拟南芥与野生型拟南芥幼苗在碱胁迫下的生长情况 ； 图 3E 为转基 因拟南芥与野生型拟南芥幼苗在碱胁迫下的根长。 0024 图 4 为转基因拟南芥成苗与野生型拟南芥成苗在碱胁迫下的生长情况。 0025 图 5 为转基因拟南芥在种子萌发期及幼苗期对 ABA 的响应。图 5A 为转基因与野 生型拟。

12、南芥种子在 ABA 处理下的种子萌发情况 ； 图 5B 为转基因与野生型拟南芥种子在 ABA 处理下的萌发率 ； 图 5C 为转基因与野生型拟南芥种子在 ABA 处理下的展叶率 ； 图 5D 为转 基因与野生型拟南芥幼苗在ABA处理下的生长情况 ； 图5E为转基因与野生型拟南芥幼苗在 ABA 处理下的根长。 0026 图 6 为非生物胁迫相关 Marker 基因在野生型拟南芥和 GsSKP21 超表达拟南芥中 的碱胁迫表达模式。 0027 图 7 为 ABA 信号通路相关基因在野生型拟南芥和 GsSKP21 超表达拟南芥中的 ABA 胁迫表达模式。 具体实施方式 0028 以下的实施例便于更好。

13、地理解本发明， 但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的试验材料， 如无特殊说明， 均为自 常规生化试剂商店购买得到的。 0029 实验材料为野生大豆 G07256 种子， 在文献 “Mingzhe Sun,Xiaoli Sun,Yang Zhao,Hua Cai,Chaoyue Zhao,Wei Ji,Huizi DuanMu,Yang Yu,Yanming Zhu.Ectopic expression of GsPPCK3and SCMRP in Medicago Sativa enhances plant alkaline stre。

14、ss tolerance and methionine content.PLOS ONE 2014,9(2):e89578” 中公开过， 公 众可以从吉林省农业科学院获得。 0030 实施例 1、 野生大豆中耐碱相关蛋白编码基因 GsSKP21 的获得 0031 1、 植物材料处理 0032 挑选饱满的野生大豆 G07256 种子于浓 H2SO4中处理 10min， 去除泥膜。倒净浓 H2SO4， 用无菌水冲洗34遍后放置于湿润的滤纸上， 25暗培养3d催芽。 待芽长到约1 说 明 书 CN 104387461 A 4 3/7 页 5 2cm 时， 将其转移到盛有 30草炭土、 70普通土的育。

15、苗盆中， 并将其放置于人工气候箱中 培养。待幼苗长至 3 周龄， 迅速取新鲜叶片及根部 3cm， 置于 -80保存。 0033 2、 植物总 RNA 的提取 0034 RNA 提取具体步骤参见 TIANGEN 公司 RNA prep pure 试剂盒说明书。 0035 3、 cDNA 第一链的合成 0036 以 OligodT 为引物进行 cDNA 第一条链的合成， 方法参见 Invitrogen 公司 SuperScriptTM Reverse Transcriptase 说明书。 0037 4、 目的基因 GsSKP21 全长序列的扩增 0038 以野生大豆总 cDNA 为模板， 采用 G。

16、sSKP21sense 和 GsSKP21antisence 引物 PCR 扩 增目的基因 GsSKP21。引物序列如下 ： 0039 GsSKP21sense ： 5 -ATGTCAGAAATTGACATGGCAGTTAT-3 ； 0040 GsSKP21antisence ： 5 -TCAAGCGTTTCGCCTCAGAAAACTAT-3 。 0041 PCR 反应的体系 ： 20L 5PrimeSTARTM HS PCR 缓冲液、 8L dNTP 混合物 (A、 G、 T、 C 各 2.5mM)、 2L 上下游引物 (10M)、 1L 稀释 5 倍的通用模板、 1L PrimeSTART。

17、M HS DNA Polymerase、 ddH2O 补足体积 ( 总体积 100L)。 0042 PCR反应的条件(采用降落的方法) ： 945min9430s6530s(-0.5/ circle)7280s209430s5530s7280s107210min4。 0043 将大小符合要求的目的基因电泳条带回收、 克隆至 pGEM-T 载体 ( 购于 Promega 公 司 )， 转化大肠杆菌 DH5( 全式金， CD201-01) 后送交测序， 对测序结果进行 DNAMAN 分析， 确定目的基因的全长序列为 1041bp。 0044 实施例 2、 GsSKP21 在植物细胞内的亚细胞定位分。

18、析 0045 1、 洋葱表皮细胞的准备 0046 在超净工作台上将洋葱剥掉1-2外层葱片， 将靠近心部的葱片切成1.5cm x l.5cm 左右的小块， 小心撕取内表皮， 平铺于 1/2MS 固体培养基上 25暗培养 6 小时。 0047 2、 亚细胞定位载体的基因枪轰击 0048 金粉的洗涤和质粒 DNA 包埋参见美国 Bio-Rad 伯乐 Helios 基因枪系统说明书。 采用 SalI、 BamHI 限制性酶切位点， 将 GsSKP21 全长 CDS 区克隆到亚细胞定位载体 pBSK II-eGFP， 得到 GsSKP21 亚细胞定位载体 pBSK II-GsSKP21-eGFP。引物序。

19、列如下 ： 0049 S-GsSKP21sense:5-GCGTCGACATGTCAGAAATTGACATGGCAG-3 0050 S-GsSKP21antisense:5-CGGGATCCAGCGTTTCGCCTCAGAAAACTA-3 0051 采用基因枪轰击介导的瞬时表达方法将构建的 pBSK II-GsSKP21-eGFP 和 pBSK II-eGFP( 阴性对照 ) 亚细胞定位载体分别轰击于洋葱表皮上。 0052 3、 转染后的洋葱表皮细胞的培养 0053 将轰击了含目的基因的亚细胞定位载体的洋葱表皮置于新 MS 培养基上， 暗培养 12 小时以便后续观察。 0054 4. 激光扫描。

20、共聚焦显微镜观察 0055 剪取洋葱表皮细胞装片， 利用激光共聚焦显微镜下观察， GFP 的激发波长为 488nm。结果表明 ： GsSKP21-eGFP 融合蛋白定位于细胞核， 而阴性对照 eGFP 则无定位倾向， 如图 1 所示。 说 明 书 CN 104387461 A 5 4/7 页 6 0056 实施例 3、 GsSKP21 在盐碱胁迫条件下的表达特性分析 0057 一、 植物材料的处理 0058 取 3 周龄的野生大豆幼苗， 分别置于 200mM NaCl( 高盐胁迫 )、 50mM NaHCO3( 模拟 碱胁迫 ) 条件下处理 0h、 1h、 3h、 6h、 12h、 24h、 。

21、48h 后迅速剪取幼嫩的叶片和根置于 -80保 存 ； 同时取未处理 0h、 1h、 3h、 6h、 12h、 24h、 48h 幼嫩的叶片和根作为对照。 0059 二、 野生大豆材料的 RNA 提取及基因组 DNA 的去除 0060 1、 取经上述不同方法处理后的野生大豆材料各约 100mg， 液氮研磨， 用 plant RNAprep Plant Kit(TIANGEN,cat no:DP402) 试剂盒并参照试剂盒说明书提取 RNA。 0061 2、 采 用 TaKaRa 公 司 的 DNase I 于 37 反 应 20-30min， 去 除 RNA 中 的 基 因 组 DNA。反应体。

22、系如下 ： RNA 40L、 10DNase I Buffer 5L、 DNase I 2L、 RNAase Inhibitor0.5L、 RNAase-free ddH2O 2.5L。 0062 3、 加入 50L 的酚氯仿抽提一次， 取上清， 用等体积的异丙醇沉淀 RNA， 用 70乙 醇洗沉淀 2 次， 将 RNA 溶于 40L 无菌 RNAase-free ddH2O。 0063 4、 通过电泳和紫外分光光度计检测 RNA 的浓度和完整度。 0064 三、 通过 Real-time PCR 对 GsSKP21 基因进行表达量检测 0065 以 上 述 总 RNA 反 转 录 获 得 的。

23、 cDNA 为 模 板，采 用 R-GsSKP21sense 和 R-GsSKP21antisense 引物序列， 通过 Real-time PCR 对 GsSKP21 基因进行表达量检测。引 物序列如下所示 ： 0066 R-GsSKP21sense:5 -GGCTTTGTGAGTTGACATCTGC-3 ； 0067 R-GsSKP21antisense:5 -GTATCTCCTCTGGTGTTTTCCCT-3 。 0068 PCR 反应的体系为 ： 2SYBR Premix ExTaq 12.5L、 MgCl2(25mM)10L、 5 PCR and 3 PCR Primer(10M)0。

24、.5L、 cDNA 模板 1L、 PCR-Grade H2O 补足总体积至 25L。 PCR反应条件为 ： 502min952min9515s6030s40951min5530s 95 30s。 0069 Real-time PCR采用比较CT法(CT)计算基因表达量， 以野生大豆GAPDH基因 为内参基因， 以未经处理的样品作为对照。目标基因表达差异通过经过处理的样本相对于 每个时间点未经处理的样本的倍数来表示。每个样品包括 3 次生物学重复和技术重复， 数 据取 3 次重复的平均值， 如果有一个数值的偏差比较大则取两个数据的平均值。原始数据 经标准化处理。标准化处理后的数据经 T-test。

25、 进行差异显著性分析。相对表达量计算方 法 ： 2-CT 2-(CT 处理 -CT 对照 ) 2-(CT 处理目的基因 -CT 处理内参基因 )-(CT 对照目的基因 -CT 对照内参基因 )。 0070 结果表明 ： GsSKP21 基因在野生大豆根和叶组织中， 均可以被盐胁迫和碱胁迫诱 导表达， 如图 2 所示。 0071 实施例 4、 转基因拟南芥的获得及鉴定 0072 一、 GsSKP21 基因植物表达载体的构建及农杆菌的转化 0073 1、以 野 生 大 豆 RNA 反 转 录 的 cDNA 为 模 板，采 用 T-GsSKP21-sense 和 T-GsSKP21-antisens。

26、e PCR 扩增 GsSKP21 基因的全长 CDS 区。引物分别引入 SalI 和 BamHI 酶切位点。引物序列 ( 下划线代表酶切位点 ) 如下 ： 0074 T-GsSKP21-sense ： 5 -GCGTCGACATGTCAGAAATTGACATGGCAGTTAT-3 ； 0075 T-GsSKP21-antisense ： 5 -CGGGATCCTCAAGCGTTTCGCCTCAGAAAACTAT-3 。 说 明 书 CN 104387461 A 6 5/7 页 7 0076 2、 用限制性内切酶 SalI 和 BamHI 分别对获得的目的片段和 pCAMBIA-2300 载体 。

27、( 购于广州吉赛生物科技有限公司， geneseed798) 进行双酶切， 将酶切产物进行连接， 转化 大肠杆菌DH5， 经PCR检测与酶切鉴定， 得到植物表达载体， 命名为pCAM2300-SKP21， 并送 交测序。 0077 测序结果表明 ： 插入 pCAMBIA-2300 载体上 SalI 和 BamHI 酶切位点间的外源基因 序列如 SEQ ID No.1 所示， 该基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列 2 所示。将测序正确的 阳性克隆转化至农杆菌 LBA4404( 购于 InvitrogenTM， 18313-015)， 即获得了重组农杆菌， 并 经 PCR 鉴定得到阳性转化子， 用于。

28、侵染拟南芥植株。 0078 二、 GsSKP21 转基因的拟南芥的获得及鉴定 0079 1、 将拟南芥种子 ( 哥伦比亚生态型 )4春化 3-7d 后， 播种于营养钵中 ( 营养土、 君子兰土和蛭石按1:1:1混合)， 置于温室中培养(22， 光照16h/天)， 待拟南芥抽出初生 苔后， 剪去初生苔， 待其抽出更多的次生苔且花开较盛时， 可用于下述转化。 0080 2、 挑取转化有 pCAM2300-SKP21 的重组农杆菌单菌落接种于 5mL YEB( 利福平 100mg/L、 卡那霉素 50mg/L) 液体培养基中， 28 230rpm 培养 30h， 按 1 ： 100 转接入 500m。

29、L 新鲜的 YEB( 利福平 100mg/L、 卡那霉素 50mg/L) 液体培养基中， 28 230rpm 培养 16-24h， 测得 OD600 约为 1.5 ； 4 5000rpm 离心 10min 收集菌体， 然后重悬于 500mL 的 5蔗糖溶液 ( 含 0.02 silwet-77) 中。 0081 3、 将已经结夹的花蕾剪掉， 把花序倒置浸入所得的含有重组农杆菌的蔗糖溶液 30s， 转化完毕后， 将植株套上塑料袋保湿， 水平放置于低光强度下生长 24h， 即可正常培养。 一周后， 重复侵染一次， 可提高转化效率。 0082 4、 将侵染后所收集的 T0代种子进行消毒春化后， 播种。

30、于含有 50mg/L 卡那霉素的 1/2MS 固体培养基上。待种子萌发后， 将绿色的阳性植株 (T0代 ) 移栽至营养钵 ( 营养土， 君子兰土， 蛭石按 1 ： 1 ： 1 混合 ) 中培养， 并收集种子进行 T1代筛选。 0083 5、 将 T1代抗性苗移栽至营养钵中培养， 提取基因组 DNA， 进行 PCR 鉴定。采 用 Trizol 法 提 取 转 基 因 拟 南 芥 植 株 的 RNA 并 反 转 录 成 cDNA， 以cDNA 为 模 板 采 用 GsSKP21-sense 和 GsSKP21-antisense 引物序列， 通过 Real-time PCR 对转基因拟南芥的 Gs。

31、SKP21 基因进行表达量检测。引物序列如下 ： 0084 GsSKP21-sense ： 5 -GCGGCTATGTGAGTTGACATCT-3 ； 0085 GsSKP21-antisense ： 5 -CTCGCGTATCTCCTCTGGAG-3 。 0086 以拟南芥 Actin2 基因为内参基因， 以野生型拟南芥样品作为对照。目的基因表达 通过转基因植株与非转基因植物样本的差异倍数来表示。每个样品包括 3 次生物学重复和 技术重复， 数据取 3 次重复的平均值， 如果有一个数值的偏差比较大则取两个数据的平均 值。原始数据经标准化处理。标准化处理后的数据经 T 检验进行差异显著性分析。。

32、 0087 6、 将 RT-PCR 阳性的 T1代转基因拟南芥单株收种子， 并分别播种于含 50mg/L 卡那 霉素的 1/2MS 培养基上进行筛选， 观察 T2代分离情况。如此重复， 直至得到 T3代转基因拟 南芥纯合体株系。 0088 实施例 5、 转基因拟南芥的抗逆功能分析 0089 一、 转基因拟南芥的抗碱实验 0090 1、 种子萌发期分析 说 明 书 CN 104387461 A 7 6/7 页 8 0091 选取饱满的野生型拟南芥 ( 哥伦比亚生态型 ) 和 GsSKP21 超量表达的拟南芥纯合 体种子， 用 5次氯酸钠消毒液消毒 10min 后， 于 4春化 3-7d。一部分播。

33、种于正常 1/2MS 固体培养基上， 观察表型并统计萌发率 ； 一部分播种于含有 7mM、 8mM 和 9mMNaHCO3的 1/2MS 固体培养基上， 每天观察表型并统计萌发率。所有实验技术重复和生物学重复各 3 次。 0092 结果表明 ： GsSKP21 超量表达拟南芥种子的萌发率比野生型的萌发率高， 同时幼 苗展叶率也高于野生型， 说明 GsSKP21 超量表达拟南芥植株具有更强的抗碱能力， 如图 3A、 图 3B、 图 3C 所示。 0093 2、 幼苗期分析 0094 选取饱满的野生型拟南芥 ( 哥伦比亚生态型 ) 和 GsSKP21 超量表达拟南芥纯合体 种子， 用 5次氯酸钠消。

34、毒液消毒 10min 后， 于 4春化 3d， 播种于 1/2MS 固体培养基上。1 周后， 挑选长势一致的转基因拟南芥和野生型拟南芥幼苗水平摆放于含有 8mM NaHCO3胁迫 培养基的平皿中， 竖直生长， 12d 后观察各处理组和非处理组的拟南芥长势， 3 次生物学重 复。统计根长数据。所有实验技术重复和生物学重复各 3 次。T 检验进行差异显著性分析。 0095 结果表明 ： GsSKP21 超量表达拟南芥幼苗的根长比野生型植株长， 叶子也比野生 型植株大， 说明 GsSKP21 超量表达拟南芥植株具有更强的抗碱能力， 如图 3D 和图 3E 所示。 0096 3、 成苗期分析 0097。

35、 选取饱满的野生型拟南芥 ( 哥伦比亚生态型 ) 和 GsSKP21 超量表达拟南芥纯合体 种子， 4春化3d后， 播种于营养钵中(营养土， 君子兰土， 蛭石按1 ： 1 ： 1混合)， 置于温室中 培养 (22， 光照 16h/d)。对于碱处理的苗每 3d 浇灌一次 150mM NaHCO3溶液。14d 后观察 各处理组和非处理组的拟南芥长势统计存活率。所有实验技术重复和生物学重复各 3 次。 0098 结果表明 ： GsSKP21 超量表达拟南芥幼苗的生长状态要比野生型植株好， 并具有 绿色的叶子， 说明 GsSKP21 超量表达能够提高植株的抗碱胁迫能力， 如图 4 所示。 0099 二。

36、、 转基因拟南芥对 ABA 敏感性的检测 0100 1、 种子萌发期分析 0101 选取饱满的野生型拟南芥 ( 哥伦比亚生态型 ) 和 GsSKP21 超量表达拟南芥纯合体 种子， 用5次氯酸钠消毒液消毒10min后， 于4春化3-7d， 一部分播种于正常1/2MS固体 培养基上， 观察表型并统计萌发率 ； 一部分播种于含有0.8M或0.9M ABA的1/2MS固体 培养基上， 每天观察表型并统计萌发率。所有实验技术重复和生物学重复各 3 次。 0102 结果表明 ： GsSKP21 超量表达拟南芥种子的萌发率比野生型的萌发率高， 同时幼 苗展叶率也高于野生型， 说明 GsSKP21 超量表达。

37、降低了拟南芥植株对 ABA 的敏感性， 如图 5A、 图 5B、 图 5C 所示。 0103 2、 幼苗期分析 0104 选取饱满的野生型拟南芥 ( 哥伦比亚生态型 ) 和 GsSKP21 超量表达拟南芥纯合体 种子， 用 5次氯酸钠消毒液消毒 10min 后， 于 4春化 3d， 播种于 1/2MS 固体培养基上。1 周后， 挑选长势一致的转基因和野生型拟南芥幼苗水平摆放于含有 20M 或 30M ABA 胁 迫培养基的平皿中， 竖直生长， 12d 后观察各处理组和非处理组的拟南芥长势， 3 次生物学 重复。统计根长数据。所有实验技术重复和生物学重复各 3 次。T 检验进行差异显著性分 析。。

38、 0105 结果表明 ： GsSKP21 超量表达拟南芥幼苗的根长比野生型植株长， 叶子也比野生 说 明 书 CN 104387461 A 8 7/7 页 9 型植株大， 说明 GsSKP21 超量表达降低了转基因拟南芥植株对 ABA 的敏感性， 如图 5D 和图 5E 所示。 0106 3、 非生物胁迫及 ABA 相关 Marker 基因的表达量分析 0107 将 14 日龄野生型和超量表达植株拟南芥分别置于 100M ABA 条件下处理 0h、 6h 后迅速剪取植株幼嫩的部分， 置于 -80保存。采用 Trizol 法提取野生型和转基因拟南芥 植株的 RNA 并反转录成 cDNA， 以拟南。

39、芥 Actin2 基因为内参基因， 以野生型拟南芥未处理 (0h) 样品作为对照。进行 Real-time RT-PCR 分析及数据处理。T 检验进行差异显著性分 析。引物序列如表 1 所示。 0108 表 1 引物序列 0109 0110 0111 结果表明 ： GsSKP21 基因的超量表达， 提高了碱胁迫处理下非生物胁迫相关 Marker基因的表达量， 同时改变了ABA信号通路中关键基因的表达， 说明GsSKP21基因通过 ABA 通路调控了植物的耐碱能力， 如图 6 和图 7 所示。 说 明 书 CN 104387461 A 9 1/6 页 10 0001 0002 序 列 表 CN 。

40、104387461 A 10 2/6 页 11 0003 序 列 表 CN 104387461 A 11 3/6 页 12 0004 序 列 表 CN 104387461 A 12 4/6 页 13 0005 序 列 表 CN 104387461 A 13 5/6 页 14 0006 序 列 表 CN 104387461 A 14 6/6 页 15 序 列 表 CN 104387461 A 15 1/6 页 16 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104387461 A 16 2/6 页 17 图 3 说 明 书 附 图 CN 104387461 A 17 3/6 页 18 图 4 说 明 书 附 图 CN 104387461 A 18 4/6 页 19 图 5 说 明 书 附 图 CN 104387461 A 19 5/6 页 20 图 6 说 明 书 附 图 CN 104387461 A 20 6/6 页 21 图 7 说 明 书 附 图 CN 104387461 A 21 。