一种提取小球藻中油脂的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104312720 A (43)申请公布日 2015.01.28 CN 104312720 A (21)申请号 201410632017.9 (22)申请日 2014.11.11 C11B 1/10(2006.01) C11B 1/04(2006.01) (71)申请人 甘肃德福生物科技有限公司 地址 743000 甘肃省定西市安定区循环经济 产业园区 (72)发明人 白玉龙 张国威 (54) 发明名称 一种提取小球藻中油脂的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种提取小球藻中油脂的方 法， 属于微藻生化工程技术领域， 包括细胞破碎、 萃取、 制备藻油和回收小球藻细胞三。

2、个步骤。 该方 法不需要加入絮凝剂、 不需要进行浓缩、 不需要进 行离心或者干燥制藻粉， 具有提藻油工艺流程短、 操作过程简单、 提取时间短、 能耗低、 成本低、 藻油 收率高、 适于直接从发酵液中提油的优点。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 (10)申请公布号 CN 104312720 A CN 104312720 A 1/1 页 2 1. 一种提取小球藻中油脂的方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： 1) 细胞破碎 ： 将新鲜小球藻与磷酸盐缓冲溶液混合， 配制成小球藻溶液， 。

3、再加入纤维 素酶， 然后将超声破碎仪的超声探头插入小球藻溶液中进行细胞破碎 ； 2) 萃取 ： 向上述步骤 1) 破碎后的小球藻溶液中加入疏水性有机溶剂对油脂成分进行 萃取， 萃取过程继续使用超声破碎仪 ； 3) 制备藻油和回收小球藻细胞 ： 萃取结束后， 加入 10氢氧化钾溶液沉淀小球藻细胞 进行回收， 摇匀静止 10 分钟后收集上层有机相， 然后旋转蒸发获得油脂。 2.根据权利要求1所述的一种提取小球藻中油脂的方法， 其特征在于， 所述步骤1)中， 小球藻溶液浓度是 11010 个藻细胞 /mL。 3.根据权利要求1所述的一种提取小球藻中油脂的方法， 其特征在于， 所述步骤1)中， 纤维素。

4、酶加入量为 1 5mg/1mL 小球藻溶液， 活性单位为 20 万。 4.根据权利要求1所述的一种提取小球藻中油脂的方法， 其特征在于， 所述步骤1)中， 超声破碎仪功率为 250W， 探头距离溶液底部 1 厘米。 5.根据权利要求1所述的一种提取小球藻中油脂的方法， 其特征在于， 所述步骤1)中， 反应所需环境条件是 25 35， pH 6.0。 6.根据权利要求1所述的一种提取小球藻中油脂的方法， 其特征在于， 所述步骤1)中， 细胞破碎时间是 1 小时。 7.根据权利要求1所述的一种提取小球藻中油脂的方法， 其特征在于， 所述步骤2)中， 疏水性有机溶剂采用石油醚 2( 沸程 60 90。

5、 )， 添加量为小球藻溶液体积的 1/2。 8.根据权利要求1所述的一种提取小球藻中油脂的方法， 其特征在于， 所述步骤2)中， 萃取时间为 1 小时， 萃取温度 30 40， 萃取过程中需要进行振荡。 9.根据权利要求1所述的一种提取小球藻中油脂的方法， 其特征在于， 所述步骤2)中， 超声破碎仪用法同步骤 1)。 权 利 要 求 书 CN 104312720 A 2 1/5 页 3 一种提取小球藻中油脂的方法 技术领域 0001 本发明属于微藻生化工程技术领域， 具体涉及一种提取小球藻中油脂的方法。 背景技术 0002 全球变暖和石油危机催生着低碳经济的发展， 替代能源的研究变得刻不容缓。。

6、微 藻生物柴油作为一种新型绿色能源， 由于能够减少 CO2的排放、 脂质含量高、 产量高、 土地占 用面积小等优点， 成为目前世界各国研究的热点。 0003 利用小球藻进行油脂生产是一个复杂的系统工程， 涵盖多个技术环节， 包括小球 藻的筛选和培育、 小球藻的规模培养、 油脂的收集和加工等几个方面。 每个环节都对设备和 生产水平有较高的要求。微藻胞壁坚韧， 细胞胞体较油料作物小， 所以传统的压榨法、 有机 溶剂提取法往往很难实现微藻油脂的高效提取。 因此探索适合微藻脂质提取工艺方法是必 要的。目前利用藻类制备油脂整体成本都比较高， 因此寻找工艺简单、 能耗少、 效率高的提 取途径关系到藻类制备。

7、油脂前景。 0004 中国专利 200810138499.7 公开了一种微生物油脂分离提取方法， 但是该方法需 要先在搅拌的状态下使用分子筛对藻液进行浓缩。 这个过程需要消耗大量的时间、 能量。 另 外回收分子筛的过程中， 分子筛和藻细胞混在一起， 会造成藻细胞的损失或分子筛的堵塞。 在分子筛再生的过程中， 还需要进行加热或减压才能恢复分子筛的脱水性能， 这个过程同 样需要消耗大量的能源， 总体成本高， 不利于推广和工厂化生产。 0005 中国专利 CN102559376B 公开了一种提取异养小球藻中性油脂的方法， 但该方法 需要先离心收集藻细胞， 在整个离心的过程中需要消耗较多的能源。在异养。

8、小球藻的发酵 过程中， 会有部分藻细胞因溶氧、 营养物质缺乏而死亡或自溶， 生物量 ( 干重 ) 越高这种现 象越明显， 当生物量 ( 干重 ) 超过 100g/L 时， 其死亡或自溶量约占总量的 20 35。在离 心时候， 会发生分层 ： 细胞碎片会集聚在最上方， 中间是水， 最下层是正常细胞。 采用离心会 导致死亡或自溶部分所产生的油脂损失。 0006 中国专利 201210431210.7 公开了一种藻类细胞中的生物油脂及其制备方法和应 用， 该方法使用了臭氧与高压共同处理藻细胞， 不断打压、 泄压反复处理 40 80 次来达到 细胞破碎的效果， 这个过程操作麻烦能耗高， 而且快速泄压有。

9、较大的噪音。 0007 中国专利 CN103725413A 公开了一种从小球藻中提取海藻油的方法， 该方法通过 反复冻融技术对小球藻进行破壁处理， 用乙醇做溶剂提取海藻油， 操作简单、 能耗小， 但是 破壁效果差， 油脂提取率低。 0008 综上所述， 现有公开的的藻油提取技术， 均存在工艺复杂、 能耗较高、 提取率低、 提 取速率慢的缺点。 发明内容 0009 为了解决现有技术中存在的上述问题， 本发明提供了一种提取小球藻中油脂的方 法， 该方法不需要加入絮凝剂、 不需要进行浓缩、 不需要进行离心或者干燥制藻粉， 具有提 说 明 书 CN 104312720 A 3 2/5 页 4 藻油工艺。

10、流程短、 操作过程简单、 提取时间短、 能耗低、 成本低、 藻油收率高、 适于直接从发 酵液中提油的优点。 0010 为实现上述发明目的， 本发明提供的具体技术方案如下 ： 0011 一种提取小球藻中油脂的方法， 包括以下步骤 ： 0012 1) 细胞破碎 ： 将新鲜小球藻与磷酸盐缓冲溶液混合， 配制成小球藻溶液， 再加入 纤维素酶， 然后将超声破碎仪的超声探头插入小球藻溶液中进行细胞破碎 ； 0013 2) 萃取 ： 向上述步骤 1) 破碎后的小球藻溶液中加入疏水性有机溶剂对油脂成分 进行萃取， 萃取过程继续使用超声破碎仪 ； 0014 3) 制备藻油和回收小球藻细胞 ： 萃取结束后， 加入。

11、 10氢氧化钾溶液沉淀小球藻 细胞进行回收， 摇匀静止 10 分钟后收集上层有机相， 然后旋转蒸发获得油脂。 0015 所述步骤 1) 细胞破碎中， 小球藻溶液浓度是 11010个藻细胞 /mL。 0016 所述步骤 1) 细胞破碎中， 纤维素酶加入量为 1 5mg/1mL 小球藻溶液， 活性单位 为 20 万。 0017 所述步骤 1) 细胞破碎中， 超声破碎仪功率为 250W， 探头距离溶液底部 1 厘米。 0018 所述步骤 1) 细胞破碎中， 反应所需环境条件是 25 35， pH 6.0。 0019 所述步骤 1) 细胞破碎中， 细胞破碎时间是 1 小时。 0020 所述步骤 2) 。

12、萃取中， 疏水性有机溶剂采用石油醚 2( 沸程 60 90 )， 添加量为 小球藻溶液体积的 1/2。 0021 所述步骤 2) 萃取中， 萃取时间为 1 小时， 萃取温度 30 40， 萃取过程中需要进 行振荡。 0022 所述步骤 2) 萃取中， 超声破碎仪用法同步骤 1)。 0023 本发明的有益之处是 ： 0024 (1) 不需要反复调节压力和温度、 不需要加入絮凝剂、 不需要进行离心或者干燥制 藻粉， 而是直接进行细胞破碎， 破碎液在利用疏水性有机溶剂萃取时可以直接将里面的油 脂萃取出来， 提藻油的工艺流程极短， 只有三步就可以获得藻油， 藻油的提取率高， 减少了 工艺流程、 减少了。

13、物料损失、 减少了能源消耗。 0025 (2)25 35， PH 6.0 能够保证油品的质量和色泽， 同时结合纤维素酶和超声破 碎仪， 极大提高小球藻细胞破壁率和油脂提取率。 0026 (3) 回收的小球藻经过破壁， 其中所富含的各种营养成分能够完全释放出来被人 体吸收， 用于小球藻产品制造， 不会造成浪费， 而且营养价值更高。 具体实施方式 0027 实施例 1 0028 1) 细胞破碎 ： 将新鲜小球藻与磷酸盐缓冲溶液混合， 配制成小球藻溶液 100mL， 浓 度是 11010个藻细胞 /mL， 再加入 100mg 活性单位为 20 万的纤维素酶， 然后将功率为 250W 的超声破碎仪的超。

14、声探头插入小球藻溶液距离底部 1 厘米处， 在 25 35， pH 6.0 环境条 件下进行细胞破碎 1 小时， 细胞破碎率为 96.3 ； 0029 2) 萃取 ： 向上述步骤 1) 破碎后的小球藻溶液中加入疏水性有机溶剂石油醚 2( 沸 程 60 90 )50mL， 30 40温度条件下对油脂成分萃取 1 小时， 萃取过程进行间歇性振 说 明 书 CN 104312720 A 4 3/5 页 5 荡 ； 0030 3) 制备藻油和回收小球藻细胞 ： 萃取结束后， 加入 10氢氧化钾溶液沉淀小球藻 细胞进行回收， 摇匀静止 10 分钟后收集上层有机相， 然后旋转蒸发获得油脂， 油脂提取率 为。

15、 78.7。 0031 实施例 2 0032 1) 细胞破碎 ： 将新鲜小球藻与磷酸盐缓冲溶液混合， 配制成小球藻溶液 100mL， 浓 度是 11010个藻细胞 /mL， 再加入 300mg 活性单位为 20 万的纤维素酶， 然后将功率为 250W 的超声破碎仪的超声探头插入小球藻溶液距离底部 1 厘米处， 在 25 35， pH 6.0 环境条 件下进行细胞破碎 1 小时， 测得细胞破碎率为 99.2 ； 0033 2) 萃取 ： 向上述步骤 1) 破碎后的小球藻溶液中加入疏水性有机溶剂石油醚 2( 沸 程 60 90 )50mL， 30 40温度条件下对油脂成分萃取 1 小时， 萃取过程。

16、进行间歇性振 荡 ； 0034 3) 制备藻油和回收小球藻细胞 ： 萃取结束后， 加入 10氢氧化钾溶液沉淀小球藻 细胞进行回收， 摇匀静止 10 分钟后收集上层有机相， 然后旋转蒸发获得油脂， 油脂提取率 为 86.4。 0035 实施例 3 0036 1) 细胞破碎 ： 将新鲜小球藻与磷酸盐缓冲溶液混合， 配制成小球藻溶液 100mL， 浓 度是 11010个藻细胞 /mL， 再加入 500mg 活性单位为 20 万的纤维素酶， 然后将功率为 250W 的超声破碎仪的超声探头插入小球藻溶液距离底部 1 厘米处， 在 25 35， pH 6.0 环境条 件下进行细胞破碎 1 小时， 测得细胞。

17、破碎率为 99.5 ； 0037 2) 萃取 ： 向上述步骤 1) 破碎后的小球藻溶液中加入疏水性有机溶剂石油醚 2( 沸 程 60 90 )50mL， 30 40温度条件下对油脂成分萃取 1 小时， 萃取过程进行间歇性振 荡 ； 0038 3) 制备藻油和回收小球藻细胞 ： 萃取结束后， 加入 10氢氧化钾溶液沉淀小球藻 细胞进行回收， 摇匀静止 10 分钟后收集上层有机相， 然后旋转蒸发获得油脂， 油脂提取率 为 89.7。 0039 实施例 4 0040 1) 细胞破碎 ： 将新鲜小球藻与磷酸盐缓冲溶液混合， 配制成小球藻溶液 100mL， 浓 度是 11010个藻细胞 /mL， 再加入。

18、 100mg 活性单位为 20 万的纤维素酶， 在 25 35， pH 6.0 环境条件下进行细胞破碎 1 小时， 测得细胞破碎率为 62.9 ； 0041 2) 萃取 ： 向上述步骤 1) 将功率为 250W 的超声破碎仪的超声探头插入破碎后的小 球藻溶液距离底部 1 厘米处， 然后加入疏水性有机溶剂石油醚 2( 沸程 60 90 )50mL， 30 40温度条件下对油脂成分萃取 1 小时， 萃取过程进行间歇性振荡 ； 0042 3) 制备藻油和回收小球藻细胞 ： 萃取结束后， 加入 10氢氧化钾溶液沉淀小球藻 细胞进行回收， 摇匀静止 10 分钟后收集上层有机相， 然后旋转蒸发获得油脂， 。

19、油脂提取率 为 81.6。 0043 实施例 5 0044 1) 细胞破碎 ： 将新鲜小球藻与磷酸盐缓冲溶液混合， 配制成小球藻溶液 100mL， 浓 度是 11010个藻细胞 /mL， 再加入 300mg 活性单位为 20 万的纤维素酶， 在 25 35， pH 说 明 书 CN 104312720 A 5 4/5 页 6 6.0 环境条件下进行细胞破碎 1 小时， 测得细胞破碎率为 68.1 ； 0045 2) 萃取 ： 向上述步骤 1) 将功率为 250W 的超声破碎仪的超声探头插入破碎后的小 球藻溶液距离底部 1 厘米处， 然后加入疏水性有机溶剂石油醚 2( 沸程 60 90 )50m。

20、L， 30 40温度条件下对油脂成分萃取 1 小时， 萃取过程进行间歇性振荡 ； 0046 3) 制备藻油和回收小球藻细胞 ： 萃取结束后， 加入 10氢氧化钾溶液沉淀小球藻 细胞进行回收， 摇匀静止 10 分钟后收集上层有机相， 然后旋转蒸发获得油脂， 油脂提取率 为 84.8。 0047 实施例 6 0048 1) 细胞破碎 ： 将新鲜小球藻与磷酸盐缓冲溶液混合， 配制成小球藻溶液 100mL， 浓 度是 11010个藻细胞 /mL， 再加入 300mg 活性单位为 20 万的纤维素酶， 在 25 35， pH 6.0 环境条件下进行细胞破碎 1 小时， 测得细胞破碎率为 69.5 ； 0。

21、049 2) 萃取 ： 向上述步骤 1) 将功率为 250W 的超声破碎仪的超声探头插入破碎后的小 球藻溶液距离底部 1 厘米处， 然后加入疏水性有机溶剂石油醚 2( 沸程 60 90 )50mL， 30 40温度条件下对油脂成分萃取 1 小时， 萃取过程进行间歇性振荡 ； 0050 3) 制备藻油和回收小球藻细胞 ： 萃取结束后， 加入 10氢氧化钾溶液沉淀小球藻 细胞进行回收， 摇匀静止 10 分钟后收集上层有机相， 然后旋转蒸发获得油脂， 油脂提取率 为 88.7。 0051 实施例 7 0052 1) 细胞破碎 ： 将新鲜小球藻与磷酸盐缓冲溶液混合， 配制成小球藻溶液 100mL， 浓。

22、 度是 11010个藻细胞 /mL， 再加入 100mg 活性单位为 20 万的纤维素酶， 然后将功率为 250W 的超声破碎仪的超声探头插入小球藻溶液距离底部 1 厘米处， 在 25 35， pH 6.0 环境条 件下进行细胞破碎 1 小时， 测得细胞破碎率为 96.3 ； 0053 2) 萃取 ： 向上述步骤 1) 将功率为 250W 的超声破碎仪的超声探头插入破碎后的小 球藻溶液距离底部 1 厘米处， 然后加入疏水性有机溶剂石油醚 2( 沸程 60 90 )50mL， 30 40温度条件下对油脂成分萃取 1 小时， 萃取过程进行间歇性振荡 ； 0054 3) 制备藻油和回收小球藻细胞 ：。

23、 萃取结束后， 加入 10氢氧化钾溶液沉淀小球藻 细胞进行回收， 摇匀静止 10 分钟后收集上层有机相， 然后旋转蒸发获得油脂， 油脂提取率 为 87.2。 0055 实施例 8 0056 1) 细胞破碎 ： 将新鲜小球藻与磷酸盐缓冲溶液混合， 配制成小球藻溶液 100mL， 浓 度是 11010个藻细胞 /mL， 再加入 300mg 活性单位为 20 万的纤维素酶， 然后将功率为 250W 的超声破碎仪的超声探头插入小球藻溶液距离底部 1 厘米处， 在 25 35， pH 6.0 环境条 件下进行细胞破碎 1 小时， 测得细胞破碎率为 99.2 ； 0057 2) 萃取 ： 向上述步骤 1)。

24、 将功率为 250W 的超声破碎仪的超声探头插入破碎后的小 球藻溶液距离底部 1 厘米处， 然后加入疏水性有机溶剂石油醚 2( 沸程 60 90 )50mL， 30 40温度条件下对油脂成分萃取 1 小时， 萃取过程进行间歇性振荡 ； 0058 3) 制备藻油和回收小球藻细胞 ： 萃取结束后， 加入 10氢氧化钾溶液沉淀小球藻 细胞进行回收， 摇匀静止 10 分钟后收集上层有机相， 然后旋转蒸发获得油脂， 油脂提取率 为 95.6。 说 明 书 CN 104312720 A 6 5/5 页 7 0059 实施例 9 0060 1) 细胞破碎 ： 将新鲜小球藻与磷酸盐缓冲溶液混合， 配制成小球藻。

25、溶液 100mL， 浓 度是 11010个藻细胞 /mL， 再加入 300mg 活性单位为 20 万的纤维素酶， 然后将功率为 250W 的超声破碎仪的超声探头插入小球藻溶液距离底部 1 厘米处， 在 25 35， pH 6.0 环境条 件下进行细胞破碎 1 小时， 测得细胞破碎率为 99.5 ； 0061 2) 萃取 ： 向上述步骤 1) 将功率为 250W 的超声破碎仪的超声探头插入破碎后的小 球藻溶液距离底部 1 厘米处， 然后加入疏水性有机溶剂石油醚 2( 沸程 60 90 )50mL， 30 40温度条件下对油脂成分萃取 1 小时， 萃取过程进行间歇性振荡 ； 0062 3) 制备藻。

26、油和回收小球藻细胞 ： 萃取结束后， 加入 10氢氧化钾溶液沉淀小球藻 细胞进行回收， 摇匀静止 10 分钟后收集上层有机相， 然后旋转蒸发获得油脂， 油脂提取率 为 96.1。 0063 上述实施例 1、 2、 3 是仅在细胞破碎过程中使用超声破碎仪， 纤维素酶的用量对小 球藻细胞破碎率和油脂提取率的影响， 可以看出， 在其他因素相同的条件下， 小球藻细胞破 碎率和油脂提取率随着纤维素酶用量的增加而增大， 而纤维素酶用量在300mg和500mg时， 细胞破碎率和油脂提取率差异不明显， 因此纤维素酶的最佳用量为 3mg/1mL 小球藻溶液。 0064 实施例 4、 5、 6 是仅在萃取过程中使。

27、用超声破碎仪， 纤维素酶的用量对小球藻细胞 破碎率和油脂提取率的影响， 结果同上。 0065 实施例 7、 8、 9 是在细胞破碎和萃取两个步骤中均使用超声破碎仪， 纤维素酶的用 量对小球藻细胞破碎率和油脂提取率的影响， 结果同上， 但仅在细胞破碎过程中使用超声 破碎仪， 油脂提取率较低， 仅在萃取过程中使用超声破碎仪， 细胞破碎率和油脂提取率都较 低， 而在细胞破碎和萃取两个步骤中均使用超声破碎仪， 细胞破碎率和油脂提取率都达到 很高水平， 藻细胞破壁率最高可达到 99.5， 油脂提取率最高可达到 96.1。 0066 综上所述， 本发明最佳的实施方案是实施例 9 所述方案。本发明不需要反复。

28、调节 压力和温度、 不需要加入絮凝剂、 不需要进行离心或者干燥制藻粉， 而是直接进行细胞破 碎， 破碎液在利用疏水性有机溶剂萃取时可以直接将里面的油脂萃取出来， 提藻油的工艺 流程极短， 只有三步就可以获得藻油， 藻油的提取率高， 减少了工艺流程、 减少了物料损失、 减少了能源消耗， 在 25 35， PH 6.0 条件下能够保证油品的质量和色泽， 同时结合纤维 素酶和超声破碎仪， 极大提高小球藻细胞破壁率和油脂提取率， 回收的小球藻经过破壁， 其 中所富含的各种营养成分能够完全释放出来被人体吸收， 用于小球藻产品制造， 不会造成 浪费， 而且营养价值更高。 说 明 书 CN 104312720 A 7 。