一种PCR反应液及试剂盒和PCR方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104328170 A (43)申请公布日 2015.02.04 CN 104328170 A (21)申请号 201410581850.5 (22)申请日 2014.10.24 C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 福建师范大学 地址 350000 福建省福州市闽侯县上街镇大 学城福建师范大学科技处 (72)发明人 王清水 余彦 (74)专利代理机构 福州市鼓楼区博深专利代理 事务所 ( 普通合伙 ) 35214 代理人 林志峥 (54) 发明名称 一种 PCR 反应液及试剂盒和 PCR 方法 (57) 摘要 本发明涉及生物技术领域， 具体涉及一种P。

2、CR 反应液及试剂盒和 PCR 方法。所述 PCR 反应液， 包括如下原料制备而成 ： 二甲亚砜， 牛血清蛋白， DNTP， 10PCR buffer， 溴酚蓝溶液， 溶质体积百 分数为30的甘油溶液和rTaq酶。 本发明优化了 PCR实验的PCR反应液， 特别是加入一定比例的甘 油溶液， 并加入BSA与DMSO的组合， 保证了Tag酶 的稳定性及活性， 并减少引物二聚体的形成， 减少 PCR 反应液配置时间， 在琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物时， 只需加入核酸染料即可检测， 可以大量节 省 PCR 产品检测时间， 提高 PCR 的扩增效率。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明。

3、书 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104328170 A CN 104328170 A 1/1 页 2 1. 一种 PCR 反应液， 其特征在于， 包括如下的原料制备而成 ： 二甲亚砜， 牛血清蛋白， DNTP， 10PCR buffer， 溴酚蓝溶液， 溶质体积百分数为 30的甘油溶液和 rTaq 酶。 2. 根据权利要求 1 所述的 PCR 反应液， 其特征在于， 包括如下的原料制备而成 ： 6-8l 二甲亚砜， 6-8l 质量体积百分数为 0.1的牛血清蛋白溶液， 9-11。

4、l10mM DNTP 溶液， 18-22l 10PCR buffer， 2-4l 溴酚蓝溶液， 45-55l 溶质体积百分数为 30甘油溶 液和 4-6l rTaq 酶。 3. 根据权利要求 1 所述的 PCR 反应液， 其特征在于， 包括如下的原料制备而成 ： 7.5l 二甲亚砜， 7.5l 质量体积百分数为 0.1牛血清蛋白溶液 10l 10mM DNTP 溶液， 20l 10PCR buffer， 5l 溴酚蓝溶液， 47l 溶质体积百分数为 30甘油溶液和 5l rTaq 酶。 4. 根据权利要求 1 所述的 PCR 反应液， 其特征在于， 所述 10PCR buffer 包含 50-。

5、150mM 的 PH 为 8.3 的 Tris-Hcl， 250-750mM Kcl 和 5-20mM Mgcl2。 5.根据权利要求1所述的PCR反应液， 其特征在于， 所述溴酚蓝溶液包含体积百分数为 30的甘油和质量体积百分数为 0.05溴酚蓝粉末。 6. 一种 PCR 试剂盒， 其特征在于， 其包含权利要求 1-5 任一项所述的 PCR 反应液。 7. 一种 PCR 方法， 其特征在于， 包含使用权利要求 1-5 任一项所述的 PCR 反应液的步 骤。 权 利 要 求 书 CN 104328170 A 2 1/3 页 3 一种 PCR 反应液及试剂盒和 PCR 方法 技术领域 0001 。

6、本发明涉及生物技术领域， 具体涉及一种 PCR 反应液及试剂盒和 PCR 方法。 背景技术 0002 聚合酶链式反应 (Polymerase chain reaction， PCR) 是一种体外快速扩增特定 DNA 片段的技术， 它是现代分子生物学最重要的手段之一。其基本原理是根据获诺贝尔 1953年生理学奖的DNA双螺旋模型所建立的体细胞复制的机制以及双链DNA在体外可随温 度变化发生变性与复性的特点设计。 1985年Randll.K.Skaii等利用Klenow DNA聚合酶建 立了聚合酶链式反应技术， 并将其应用于镰刀形贫血病的基因诊断。它是 80 年代分子生物 学领域的一项革命性突破，。

7、 被誉为分子生物学资源发展史上的又一里程碑。此项技术一经 问世就因其操作简单、 快速、 灵敏度高和特异性强等优点迅速在与分子生物学相关的学科 得到广泛应用， 如分子生物学研究、 医学检验、 动植物检验、 法医鉴定及考古等各个领域。 0003 在 PCR 过程中， DNA 聚合酶起着关键性作用。目前已有 100 多个 DNA 聚合酶的相 关基因被克隆和测序， Thermus aquaticus 是一种水生嗜热菌， 从该菌中分离出的 DNA 聚合 酶 (Taq DNA 聚合酶 ) 具有催化以 DNA 为模板合成 DNA 的功能。 0004 Taq NDA 聚合酶是 Mg2+依赖性酶， 该酶的催化活。

8、性对 Mg2+浓度非常敏感。研究表 明， Mg2+浓度低于 lmM， dNTP 过多， 鳌合 Mg2+作用强时， Mg2+对 Taq DNA 聚合酶的催化作用几 乎丧失， 不产生扩增产物。 随着Mg2+浓度的增加， 其催化作用增强， 扩增产物增多， 但产物浓 度增大的同时， 背景也明显增强。 0005 常规的 PCR 扩增体系配置， 往往是将 DNTP、 Buffer、 rTaq 酶等试剂单独保存， 待要 进行PCR扩增时， 将样品分别加到同一PCR管中， 在操作过程中除了经常忘记加入个别试剂 的缺点外， 多次的取用会对试剂造成污染， 影响后续使用。因此， 急需研发一种 PCR 扩增体 系对于。

9、减少 PCR 扩增体系配置时间以及提高 PCR 体系配置的准确性和减少 PCR 扩增过程中 的污染。 发明内容 0006 本发明所要解决的技术问题是 ： 提供一种减少 PCR 反应液配置时间的含有溴酚蓝 指示剂的 PCR 反应液的配置方法。 0007 为了解决上述技术问题， 本发明采用的技术方案为 ： 提供一种 PCR 反应液， 包括如 下的原料制备而成 ： 二甲亚砜， 牛血清蛋白， DNTP， 10PCR buffer， 溴酚蓝溶液， 溶质体积 百分数为 30的甘油溶液和 rTaq 酶。 0008 本发明的另一技术方案为提供一种 PCR 试剂盒， 其包含上述的 PCR 反应液。 0009 本。

10、发明的又一技术方案为提供一种PCR方法， 包含使用上述的PCR反应液的步骤。 0010 本发明的有益效果在于 ： 本发明优化了PCR实验的PCR反应液， 特别是加入一定比 例的甘油溶液， 以保证 rTaq 酶的活性， 加入 BSA 与 DMSO 的组合保证了 Tag 酶的稳定性及活 性， 并减少引物二聚体的形成， 减少 PCR 反应液配置时间， 在琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物 说 明 书 CN 104328170 A 3 2/3 页 4 时， 只需加入核酸染料即可检测， 与常规的 PCR 检测相比， 使用本发明 PCR 反应液无需再加 入溴酚蓝指示剂， 可以大量节省PCR产品检测时间， 提。

11、高PCR的扩增效率， 适用于大批量PCR 产品的检测。 附图说明 0011 图 1 为本发明具体实施方式中的转基因水稻 GUS 基因结果检测图 ； 0012 其中泳道 1， 2 是常规 PCR 方法配置的 PCR 检测结果， 泳道 3、 4 是含有溴酚蓝指示 剂的 PCR 反应液的 PCR 检测结果， 泳道 5 是 DNA marker。 具体实施方式 0013 为详细说明本发明的技术内容、 所实现目的及效果， 以下结合实施方式并配合附 图予以说明。 0014 本发明最关键的构思在于 ： 本发明在 PCR 反应液中加入甘油、 BSA 与 DMSO 有保证 Tag 酶的稳定性及活性， 制备出可以。

12、直接使用的 PCR 混合液提高 PCR 的扩增效率。 0015 实施例 1 0016 一种PCR反应液， 包括如下原料制备而成 ： 6-8l二甲亚砜， 6-8l质量体积百分 数为0.1的牛血清蛋白溶液， 9-11l 10mM DNTP溶液， 18-22l 10PCRbuffer， 2-4l 溴酚蓝溶液， 45-55l 溶质体积百分数为 30甘油溶液和 4-6l rTaq 酶。 0017 传统配制 PCR 反应液时， 将 DNTP、 Buffer、 rTaq 酶等试剂进行混合， 制备出可以直 接使用的 PCR 混合液， 将 PCR 混合液放于 -20保存， rTaq 酶的活性会下降。因此， 本发。

13、明 在混合液中加入一定比例的甘油溶液和 BSA 与 DMSO 的组合保证了 Tag 酶的稳定性及活性， 并减少引物二聚体的形成。 0018 一种PCR反应液， 所述反应液由如下组分混合而成 ： 6l二甲亚砜， 6l质量体积 百分数为 0.1的牛血清蛋白溶液， 9l 10mM DNTP 溶液， 18l 10PCRbuffer， 2l 溴 酚蓝溶液， 45l 溶质体积百分数为 30甘油溶液和 4l rTaq 酶。 0019 一种PCR反应液， 所述反应液由如下组分混合而成 ： 8l二甲亚砜， 8l质量体积 百分数为0.1的牛血清蛋白溶液， 11l 10mM DNTP溶液， 22l 10PCR bu。

14、ffer， 4l溴 酚蓝溶液， 55l 溶质体积百分数为 30甘油溶液和 6l rTaq 酶。 0020 实施例 2 0021 一种 PCR 反应液， 所述反应液包括 7.5l 二甲亚砜， 7.5l 质量体积百分数为 0.1牛血清蛋白溶液 10l 10mM DNTP 溶液， 20l 10PCR buffer， 5l 溴酚蓝溶液， 47l 溶质体积百分数为 30甘油溶液和 5l rTaq 酶。将配置好的溶液混匀后离心， 存 放于 -20冰箱中。 0022 进一步的， 上述的PCR反应液中， 所述10PCR buffer包含50-150mM的PH为8.3 的 Tris-Hcl， 250-750mM。

15、 Kcl 和 5-20mM Mgcl2。 0023 进一步的， 上述的 PCR 反应液中， 所述溴酚蓝溶液包含体积百分数为 30的甘油 和质量体积百分数为 0.05溴酚蓝粉末。 0024 一种 PCR 试剂盒， 其特征在于， 其包含上述任一项的 PCR 反应液。 0025 上述 PCR 反应液的使用 ： 从冰箱中取出 2PCR 反应液， 配置 PCR 体系， 20l 的 说 明 书 CN 104328170 A 4 3/3 页 5 PCR 体系配置如下 ： 2PCR 反应液 10l， 引物 R 1l， 引物 F 1l， 转基因水稻基因组模 板 1l， 灭菌水 7l。进行 PCR 后， PCR 。

16、程序如下 ； 0026 0027 PCR 扩增结束后吸取 5l PCR 产物， 加入 1l 核酸染料进行检测 0028 其中 10PCR buffer 的配置方法如下 ： 100mM Tris-Hcl(PH 8.3)， 500mM Kcl， 15mM Mgcl2。 0029 溴酚蓝溶液的配置方法如下 ： 30 (v/v) 甘油、 0.05 (w/v) 溴酚蓝粉末 0030 对比例 ： 0031 对照案例为常规 PCR 反应液的配置使用方法， 对比例所用的 PCR 反应液的配置方 法如下 ： 0.75l 二甲亚砜 (DMSO) 溶液， 0.75l 0.1牛血清蛋白 (BSA) 溶液， 1l 10。

17、mM DNTP 溶液， 2l 10PCR buffe， 引物 R 1l， 引物 F 1l， 转基因水稻基因组模板 1l， 0.5l rTaq 酶， 12l ddH2O. 将配置好的 PCR 产物进行 PCR 扩增， 扩增程序如下 ： 0032 0033 PCR 扩增结束后吸取 5l PCR 产物， 加入 1l 溴酚蓝反应液以及 1l 核酸染料 进行检测。 0034 图 1 为本发明具体实施方式中实施例 2 和对照例的的转基因水稻 GUS 基因结果检 测图 ； 其中泳道 1， 2 是常规 PCR 方法配置的 PCR 检测结果， 泳道 3、 4 是含有溴酚蓝指示剂的 PCR 反应液的 PCR 检测结果， 泳道 5 是 DNA marker。从电泳结果图中可看出常规法配置的 PCR 体系与本发明的反应体系具有相同的扩增效果， 但是本发明相对常规方法可不仅可节 省大量 PCR 反应体系配置时间， 同时还可减少 PCR 产物检测时间。 0035 以上所述仅为本发明的实施例， 并非因此限制本发明的专利范围， 凡是利用本发 明说明书及附图内容所作的等同变换， 或直接或间接运用在相关的技术领域， 均同理包括 在本发明的专利保护范围内。 说 明 书 CN 104328170 A 5 1/1 页 6 图 1 说 明 书 附 图 CN 104328170 A 6 。