BCRABL融合基因快速检测方法的引物和试剂盒.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104328213 A (43)申请公布日 2015.02.04 CN 104328213 A (21)申请号 201410682584.5 (22)申请日 2014.11.24 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 济南市中心医院 地址 250013 山东省济南市解放路 105 号 (72)发明人 杨炜华 汪运山 (74)专利代理机构 济南圣达知识产权代理有限 公司 37221 代理人 赵妍 (54) 发明名称 BCR-ABL 融合基因快速检测方法的引物和试 剂盒 (57) 摘要 本发明公开了一种 BCR-AB。

2、L 融合基因快速检 测方法的引物和试剂盒， 本发明提供了用环介导 等温扩增方法检测 BCR-ABL 基因的引物， 建立了 白血病微小残留病 BCR-ABL 基因检测新方法。扩 增效率高、 特异性好、 对仪器设备要求低， 只需要 恒温水浴锅即可， 临床上容易做到， 检测时间不 超过 1 个小时， 是一种快速、 准确诊断基因的新方 法。本试剂盒实现了基因扩增和结果判定一步完 成， 操作简单、 结果准确直观、 特异性与敏感性高、 对人体安全、 不污染环境， 适合于各级医院快速诊 断白血病微小残留病， 排除了基层医院难以开展 此类检查的障碍， 患者可以就近检查， 而不用再长 途奔波到条件好的大医院， 。

3、方便了患者， 节省了费 用， 为救治生命节约了宝贵时间。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 2 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104328213 A CN 104328213 A 1/1 页 2 1. 一种 BCR-ABL 融合基因快速检测方法的引物， 其特征在于， 包括 ： 引物 P1， 其核苷酸 序列如 SEQ ID NO ： 1 所示 ； 引物 P2， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 2 所示 ； 引物 P3， 其核苷酸 序。

4、列如 SEQ ID NO ： 3 所示 ； 引物 P4， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 4 所示。 2. 一种 BCR-ABL 融合基因快速检测方法的试剂盒， 其特征在于， 内含 LAMP 反应液、 阳性对照、 阴性对照， 所述 LAMP 反应液的成分为 ： 0.04mol/L 的 pH 8.8 的 Tris-HCl， 0.02mol/L 的 KCl， 0.016mol/L 的 MgSO4， 0.02mol/L 的 (HN4)2SO4， 0.002l/ L 的 Tween20， 1.6mol/L 的甜菜碱， 0.0028mol/L 的 4 种 dNTPs， 10U/L 的逆转 录酶，。

5、 8U/L 的 Bst DNA 聚合酶， 0.00005mol/L 的钙黄绿素， 1.6pmol/L 的引物 P1， 1.6pmol/L 的引物 P2， 0.2pmol/L 的引物 P3， 0.2pmol/L 的引物 P4 ； 所述阳性对照为 ： 反应时在反应液中加入 BCR-ABL 基因表达阳性的 K562 细胞基因组 RNA ； 阴性对照为 ： 反应时在反应液中加入超纯水。 3. 如权利要求 2 所述的试剂盒， 其特征在于， LAMP 反应液为 1ml、 阳性对照 50L、 阴性 对照 1ml。 4. 如权利要求 3 所述的试剂盒， 其特征在于， 上述试剂盒还包括 ： 反应管 50 个， 。

6、1-10L 移液器头 100 个。 5.如权利要求2-4任一所述的试剂盒的使用方法， 其特征在于， 取20L反应液置于反 应管中， 将 5L 待检 RNA 加入反应液内， 用移液器吹打混匀， 盖好反应管的盖子， 将反应管 置于水浴锅中进行扩增， 扩增条件为 ： 60-65水浴恒温反应 40-45min， 观察颜色变化。 6. 如权利要求 5 所述的使用方法， 其特征在于， 初次使用本试剂盒时设置阴性对照和 阳性对照。 权 利 要 求 书 CN 104328213 A 2 1/6 页 3 BCR-ABL 融合基因快速检测方法的引物和试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及基因的快速检测方法， 尤其。

7、涉及一种 BCR-ABL 融合基因快速检测方法 的引物和试剂盒。 背景技术 0002 白血病是一种造血系统恶性疾病， 严重危害人类健康。 随着医学进步， 白血病经过 积极治疗， 多数患者能取得缓解， 但很多患者缓解后体内仍残留少量白血病细胞， 即存在白 血病微小残留病 (MRD)。白血病微小残留病是白血病复发的首要原因。白血病患者完全缓 解后， 检测体内残留白血病细胞， 可以预防及防止复发， 指导个性化治疗， 因此， 对患者进行 白血病微小残留病监测具有重要意义。 0003 慢性粒细胞白血病 (CML) 是骨髓造血干细胞恶性克隆增生性疾病， 约 95 CML 可 发生 t(9 ； 22)(q3。

8、4 ； q11) 基因易位， 形成 BCR-ABL 融合基因， BCR-ABL 融合基因编码的蛋白 具有升高酪氨酸激酶活性， 在 CML 的病理过程中起重要作用， 其表达可作为微小残留病的 标志。既往多用逆转录 - 聚合酶链反应 (RT-PCR) 检测 BCR-ABL 融合基因。PCR 存在反应后 要开盖进行后续检测， 常存在污染和非特异性扩增导致的假阳性， 另外还存在耗时长、 操作 复杂、 劳动强度大、 重复性差、 定量标准不统一， 并且检测需要 4-5 个小时， 而且 PCR 结束之 后需要通过电泳判断结果， 电泳所用 DNA 染料 EB 有剧毒等诸多缺点。 0004 环介导等温扩增法 (。

9、loop-mediated isothermal amplifi cation,LAMP) 是 2000 年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法， 与常规 PCR 相比， 不需要模板的热变性、 温度循 环、 电泳及紫外观察等过程， 具有简单、 快速、 特异性强的特点， 可以不依赖任何专门的仪器 设备实现现场高通量快速检测， 检测成本远低于荧光定量 PCR， 该方法推广期主要面对微 生物检测， 现在已经广泛应用于微生物检测领域， 并有很多相关专利获得授权， 但因研究人 员了解不足， 而且人体基因比微生物更复杂， 目前国内外均未见使用 LAMP 方法检测白血病 BCR-ABL 基因的报道。 发明内容 。

10、0005 本发明的目的就是为了解决上述问题， 提供一种 BCR-ABL 融合基因快速检测方法 的引物和试剂盒。 0006 为了实现上述目的， 本发明采用如下技术方案 ： 0007 一种 BCR-ABL 融合基因快速检测方法的引物， 包括 ： 引物 P1， 其核苷酸序列如 SEQ IDNO ： 1 所示 ； 引物 P2， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 2 所示 ； 引物 P3， 其核苷酸序列如 SEQID NO ： 3 所示 ； 引物 P4， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 4 所示。 0008 上述引物在检测慢性粒细胞白血病微小残留病中的应用。 0009 一种BCR-ABL融。

11、合基因快速检测方法的试剂盒， 内含LAMP反应液、 阳性对照、 阴性 对照， 所述 LAMP 反应液的成分为 ： 0.04mol/L pH 为 8.8 的 Tris-HCl， 0.02mol/L 的 KCl， 0.016mol/L 的 MgSO4， 0.02mol/L 的 (HN4)2SO4， 0.002l/L 的 Tween20， 说 明 书 CN 104328213 A 3 2/6 页 4 1.6mol/L 的甜菜碱， 0.0028mol/L4 种 dNTPs， 10U/L 逆转录酶， 8U/L 的 Bst DNA 聚合酶， 0.00005mol/L 的钙黄绿素， 1.6pmol/L 的引。

12、物 P1， 1.6pmol/L 的引物 P2， 0.2pmol/L 的引物 P3， 0.2pmol/L 的引物 P4 ； 0010 所述阳性对照为 ： 反应时在反应液中加入BCR-ABL基因表达阳性的K562细胞基因 组 RNA ； 0011 阴性对照为 ： 反应时在反应液中加入超纯水。 0012 上述试剂盒中 LAMP 反应液为 1ml、 阳性对照 50L、 阴性对照 1ml。 0013 上述试剂盒还包括 ： 反应管 50 个， 1-10L 移液器头 100 个。 0014 上述试剂盒的使用方法 ： 取 20L 反应液置于反应管中， 将 5L 待检 RNA 加入反 应液内， 用移液器吹打混匀。

13、， 盖好反应管的盖子， 将反应管置于水浴锅中进行扩增， 扩增条 件为 ： 60-65水浴恒温反应 40-45min， 观察颜色变化 ； 用户在初次使用时需要设置阴性对 照和阳性对照。 0015 本发明的有益效果 ： 0016 为了解决以往白血病微小残留病检测中易出现假阳性、 检测成本高、 操作复杂、 检 测时间长的问题， 本发明提供了用环介导等温扩增方法检测 BCR-ABL 基因的引物， 建立了 白血病微小残留病 BCR-ABL 基因检测新方法。 0017 该方法扩增效率高、 特异性好、 对仪器设备要求低， 只需要恒温水浴锅即可， 临床 上容易做到， 检测时间不超过 1 个小时， 是一种快速、。

14、 准确诊断基因的新方法。 0018 反应液中预先加有逆转录酶， 逆转录和基因扩增一步完成， 而不需要预先将 RNA 逆转录成 cDNA 再进行 DNA 扩增， 简化了操作步骤。 0019 采用本试剂盒通过检测 BCR-ABL 基因诊断 CML 微小残留病， 从取得样本到结果判 定结束可以控制在 2h 内， 采用本试剂盒， 实现了基因扩增和结果判定一步完成， 操作简单、 结果准确直观、 特异性与敏感性高、 对人体安全、 不污染环境， 适合于各级医院快速诊断慢 性粒细胞白血病微小残留病， 排除了基层医院难以开展此类检查的障碍， 患者可以就近检 查， 而不用再长途奔波到条件好的大医院， 方便了患者，。

15、 节省了费用， 为救治生命节约了宝 贵时间。 附图说明 0020 图1为裸眼目视观察反应结果， 其中， 1号管为检测管， 2号管为阳性对照， 3号管为 阴性对照 ； 0021 图2为LAMP法目视检测试剂盒灵敏性结果， 其中， 1-5号管中加入的为倍比稀释的 RNA， 浓度依次为 1000、 100、 10、 1、 0.1ng/l， 1-4 号为阳性， 5 号为阴性 ； 0022 图 3 为 LAMP 法目视检测试剂盒特异性结果， 1-5 号管为 CML 患者样本， 6-10 号管 为正常人样本 ； 1-5 号为阳性， 6-10 为阴性。 具体实施方式 0023 下面结合附图与实施例对本发明作。

16、进一步说明。 0024 1. 材料与方法 0025 1.1 样本 ： 用培养的 K562 细胞 ( 慢性髓原白血病细胞 ) 的基因组总 RNA 作为标准 说 明 书 CN 104328213 A 4 3/6 页 5 品用于本方法的建立， 临床样本采用抗凝外周血或骨髓 0.2-1.0ml。 0026 1.2 基因组总 RNA 提取 ： 利用商品化的 RNA 提取试剂盒 ( 购自北京天恩泽生物技 术有限公司， 型号为 3701-50) 抽提总 RNA， 室温操作。 0027 抽提总 RNA 具体操作步骤 ： 0028 (1) 将 0.2-1.5mL 抗凝全血 13000g 离心 3 分钟， 弃上清。

17、 ； 0029 (2) 将 1mL 溶液 A 加入到血液细胞沉淀中， 用移液枪吹打沉淀使细胞裂解 ； 0030 (3) 将 0.3mL 的溶液 B 和 0.2mL 氯仿加入离心管， 剧烈震荡 30 秒， 13000g 离心 5 分钟， 将上清液转移到另一干净离心管中 ； 0031 (4) 加入 0.5mL 的溶液 C 和 0.2mL 的氯仿到上清液中， 剧烈摇晃 30 秒， 13000g 室 温离心 3 分钟， 将上清液转移到另一干净离心管中 ； 0032 (5) 在上清液中加入体积为其 1/2 的溶液 D， 剧烈摇晃 30 秒， 13000g 离心 5 分钟， 移弃上清液 ； 0033 (6。

18、) 在离心管中加入 1mL 体积分数为 75的乙醇， 振荡器上振荡混均 30 秒， 离心 13000g 1 分钟， 吸弃上清液 ； 0034 (7) 室温放置 2 分钟， 加入 10-30L 无 RNase 水使 RNA 沉淀溶解， 即为总 RNA。 0035 1.3 引物设计及筛选 0036 根据 BCR-ABL 融合基因 mRNA 序列， 利用 Primer Explorer V4 软件 (https:/ primerexplorer.jp) 设计多组引物， 每引物组包括 4 条， 根据反应时间及特异性对不同引 物的反应进程和结果进行监测、 筛选， 确定反应快、 特异性高的最佳引物。筛选到。

19、的引物序 列见表 1。 0037 表 1 筛选到的 BCR-ABL 融合基因的环介导等温扩增检测方法的最佳引物名称与 序列 0038 0039 BCR-ABL 融合基因 mRNA 序列， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 5 所示。 0040 1.4LAMP 反应体系 0041 LAMP 反应总体系为 25L， 反应时加入 20L 反应液， 再加入 5L 待检测 RNA。同 时设阳性对照和阴性对照。 0042 阳性对照为 ： 反应时在反应液中加入 K562 基因组 RNA 5L ； 0043 阴性对照为 ： 反应时在反应液中加入超纯水 5L。 0044 20L 反应液成分及含量见表 2。。

20、 0045 表 2 反应缓冲液成分及含量 0046 说 明 书 CN 104328213 A 5 4/6 页 6 0047 0048 1.5 试剂盒设置 0049 试剂盒内含 LAMP 反应液、 阳性对照、 阴性对照 3 管试剂， 以 50 次反应计， 试剂盒组 装如表 3 所示。 0050 表 3 BCR-ABL 融合基因的环介导等温扩增检测方法的试剂盒设置 0051 0052 1.6 反应条件 0053 取 20L 反应液置于反应管中， 将 5L 待检 RNA 加入反应液内， 用移液器吹打混 匀， 盖好反应管的盖子， 将反应管置于水浴锅中进行扩增， 扩增条件为 ： 60-65水浴恒温反 应。

21、 40-45min。初次使用本试剂盒建议设置阴性对照和阳性对照， 但不是必要步骤。 0054 2. 结果判定 说 明 书 CN 104328213 A 6 5/6 页 7 0055 在 LAMP 反应进行的过程中， 随着大量 DNA 的合成， 还产生一种副产物焦磷酸根离 子， 焦磷酸根离子浓度与 DNA 的生成量成正比。反应初期， 钙黄绿素与荧光淬灭剂锰离子结 合而不发荧光。由于焦磷酸根离子更易与锰离子结合从而释放了钙黄绿素。游离的钙黄绿 素可以自发荧光， 在镁离子存在的条件下， 这种荧光效果得到了加强。 而且这种荧光在自然 光下可被裸眼观察到。扩增反应前， 反应液为淡橙色， 待检测样本 DN。

22、A 被扩增后反应液变为 绿色。因此从反应开始至结果判读均不需要打开反应管， 可以有效避免因形成气溶胶而导 致的 DNA 污染及假阳性的产生。 0056 所以， 反应液变为绿色的为阳性结果 ； 反应液不变色仍为淡橙色的为阴性结果， 如 图 1 所示， 1 号管为检测管， 2 号管为阳性对照， 反应至 40-45min 后， 取出离心管， 裸眼观察 结果， 1、 2 号管中的液体变为绿色， 为阳性， 3 号管中的液体仍保持淡橙色， 为阴性。若反应 时间延长至 45min 以上， 可能会出现假阳性， 随反应时间继续延长， 假阳性出现的几率随之 升高， 所以结果判定以 40-45min 时为准。 00。

23、57 3. 敏感性检测 0058 用微量分光光度计 ( 购自美国 Nanodrop 公司， 型号为 ND-1000) 检测样本 RNA 的 浓度， 并将 RNA 的浓度调整为 1000ng/l， 用无 RNA 酶的双蒸水对待检测 RNA 进行 10 倍梯 度稀释， 得到所需要的不同浓度， 即100、 10、 1、 0.1ng/l。 按照1.6条件进行LAMP反应， 检 测出现阳性反应的最低模板浓度。如图 2 所示， 1-4 号管浓度为 1000、 100、 10、 1ng/l， 反 应结束后变为绿色， 为阳性。5 号管浓度为 0.1ng/l， 反应结束后仍为淡橙色， 为阴性。表 明本试剂盒最低。

24、可检测到 1ng/l 的基因组 RNA。 0059 4. 特异性检测 0060 选择正常人血液 5 例、 CML 患者血液 5 例提取 RNA， 按照 1.6 条件进行 LAMP 扩增。 40-45min 之间， 来自 5 例 CML 患者的 RNA 显示为阳性结果， 来自 5 例正常人血液的 RNA 为阴 性， 正确率 100， 表明本试剂盒具有很高的特异性。如图 3 所示， 1-5 号管均变为绿色， 为 阳性， 6-10 号管为正常人样本， 反应结束后仍为淡橙色， 为阴性。 0061 5. 利用本发明通过检测 BCR-ABL 基因表达来检测慢性粒细胞白血病微小残留病 与现有常规检测方法的优。

25、劣对比， 见表 4。 0062 表 4 本试剂盒检测与现有常规检测方法对比 0063 0064 由表 4 可以看出， 本发明的方法相对于现有常规检测方法， 不需要专用的仪器， 操 说 明 书 CN 104328213 A 7 6/6 页 8 作过程简单， 并且对操作者的要求较低， 操作的时间少于 1h， 检测的灵敏度和特异性较高。 0065 上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述， 但并非对本发明保护范 围的限制， 所属领域技术人员应该明白， 在本发明的技术方案的基础上， 本领域技术人员不 需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。 说 明 书 CN 104328213 A 8 1/2 页 9 0001 0002 序 列 表 CN 104328213 A 9 2/2 页 10 序 列 表 CN 104328213 A 10 1/1 页 11 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 104328213 A 11 。