改变植物气孔开度和密度的方法 【技术领域】
本发明涉及农业科学领域。具体而言， 本发明涉及通过改变植物气孔密度和开度 来增强植物适应环境能力的方法。背景技术
在地球上存在着多种多样的气候条件， 包括缺水和富含水资源等复杂的环境， 在 不同环境培育出适宜的农作物、 经济作物品种等具有重要的意义， 这有利于提高环境能源 的利用效率。要培育出适应能力强的作物， 就有必要详细了解调节气孔生长发育及运动的 机理。
高等植物的气孔主要分布在叶表皮， 由两个保卫细胞环绕形成， 它是植物吸收二 氧化碳和水分进出植物体的必须经过的通道。 气孔的生理状态， 例如其密度和开关程度， 直 接影响植物的许多行为或表型， 例如水分蒸腾的速率和光合作用的效率。气孔的生理状态 受很多环境因子的调控， 其中光是最重要的的环境因子。植物中有很多光受体来感受光的 方向、 质量及数量。这些光受体接受光信号并通过信号传导途径来调控植物的生长发育。
植物中普遍存在的光受体基因主要为 ： 隐花色素 CRY、 向光素 PHOT、 光敏色素 PHYA 和 PHYB 基因。目前已经发现， 例如如下植物中包含 CRY、 PHYA 和 PHYB 基因 ( 包括但不限 于)： 双子叶植物中的拟南芥菜 ( 十字花科芸苔属 )、 番茄 ( 茄科番茄属 )、 烟草 ( 茄科烟草 属 )、 豌豆 ( 蝶形花科 ) 等， 单子叶植物中的水稻 ( 禾本科稻属 )、 大麦 ( 禾本科大麦属 ) 等， 以及蕨类、 苔藓类和藻类中的一些物种。
以双子叶模式植物拟南芥菜为例， 本领域中已知该植物具有如下的光受体 ： 四个 蓝光受体 ： 向光素 (PHOT1、 PHOT2) 和隐花色素 (CRY1、 CRY2) ； 五个红光 / 远红光受体 ： 光敏 色素 phyA、 phyB、 phyC、 phyD、 phyE。PHOT1 的 C 端功能区具有经典的苏氨酸 / 丝氨酸激酶 活性。N 端功能区称为 LOV 功能域 (Light Oxygen Voltage domain)。PHOT1 通过 LOV 功能 域感应蓝光， LOV1 和 LOV2 功能域分别都结合一个生色团——核黄素单核苷酸 (FMN)。CRY1 和 CRY2 蛋白 N 端与光裂解酶 (photolyase) 具有高水平的氨基酸序列的同源性， 不过没有 光裂解酶的活性， 同时 CRY 有一个光裂解酶没有的 C 端延伸区， 常称为 C 端功能区。CRY 蛋 白是通过 N 端形成二聚体的， 通过与之以非共价结合的 FAD 吸收光信号， C 端向下传递光信 号。PHY 的生色团结合在光敏色素的 N 端功能区， 但与 CRY 不同的是其是通过共价键结合 而不是非共价结合。此外， 虽然 PHY 也是二聚体， 但是与 CRY 不同的是 PHY 二聚体是通过 C 端实现的。 光敏色素在红光和远红光下具有不同的分子构象 ： 在红光下为 Pfr 形式， 为光敏 色素的活性形式 ； 而在远红光下为 Pr 形式， 为光敏色素的失活形式。光可以逆转 Pfr 和 Pr 两种形式的光敏色素， 红光促使光敏色素由 Pr 型向 Pfr 型转化， 而远红光则逆转该过程。
拟南芥菜 CRY1 基因的登录号为 S66907， cDNA 序列 SEQ ID NO ： 1 所示 ； 其 CRY2 基 因的登录号为 U43397， cDNA 序列 SEQ ID NO ： 3 所示 ； 其 PHYB 基因的登录号为 X17342， cDNA 序列 SEQ ID NO ： 5 所示 ； 其 PHYA 基因的登录号为 NM_001123784， cDNA 序列 SEQ ID NO ： 7 所示。蓝光受体向光素主要参与植物的向光性、 叶绿体的运动和蓝光诱导的气孔开放过 程的调节。已有研究证明蓝光受体 PHOT 和 CRY 均参与了蓝光诱导的气孔开放。
然而， 本领域中仅知晓光敏色素 PHY 在植物光形态建成、 开花时间、 花色素苷合成 和生物节律性等重要生理过程发挥重要调控作用。目前尚无， 红光受体 phyB 对气孔生理状 态 ( 如气孔开放和气孔密度 ) 是否具有调节作用的相关报道。
本领域迫切需要研究出对植物气孔生理状态具有影响作用的因素， 以开发出调节 植物行为或表型 ( 尤其是水分蒸腾和光合作用的效率 ) 的有效方法， 从而改善植物对环境 的适应能力、 提高植物品质。 发明内容 本发明通过揭示植物 PHYB 基因及其编码的蛋白质或多肽与植物气孔生理状态之 间的相关性， 提供了改变植物与气孔生理状态相关的用途和方法， 从而改善植物对环境的 适应能力、 提高植物品质。
在本发明的第一个方面， 提供了植物 PHYB 基因或其编码的蛋白质或多肽在调节 植物气孔生理状态中的用途。
在一个优选例中， 所述气孔生理状态为选自下组中的一种或多种 ： 气孔开度、 气孔 密度、 气孔导度或气孔系数。
在另一优选例中， 所述气孔生理状态的调节包括 ： 通过所述 PHYB 基因或其编码的 蛋白质或多肽的减少或功能的丧失或降低， 使得正常植物气孔生理状态受到抑制 ； 或通过 所述 PHYB 基因或其编码的蛋白质或多肽的增加或功能的增强， 使得正常植物气孔生理状 态受到促进。
在一个优选例中， 所述抑制包括选自下组的一种或多种 ： 气孔开度减小、 气孔导度 降低、 气孔密度降低或气孔系数减少。
在一个优选例中， 所述促进包括选自下组的一种或多种 ： 气孔开度增大、 气孔导度 提高、 气孔密度提高或气孔系数增大。
在本发明的一个实施方式中， 所述植物还同时具有 cry1、 cry2 和 / 或 phyA 基因或 其编码的蛋白质或多肽的表达或功能的改变。
与本发明的第一方面密切相关的是本发明的第二方面， 在该方面中提供了植物 PHYB 基因或其编码的蛋白质或多肽在调节植物与气孔生理状态相关的环境适应性表型或 行为中的用途。
在一个优选例中， 所述 PHYB 基因选自 ： (i)SEQ ID NO ： 5 所示的序列 ； 或 (ii) 在严 格条件下与 (i) 限定的序列杂交且具有调节植物与气孔生理状态相关的环境适应性活性 的序列。
在本发明的一个实施方式中， 所述植物选自下组 ： 十字花科、 茄科、 蝶形花科、 禾本 科植物、 蕨类、 苔藓或藻类。
在一个优选例中， 所述植物选自 ： 十字花科芸苔属、 茄科番茄属、 茄科烟草属、 蝶形 花科、 禾本科稻属或禾本科大麦属， 更优选 ： 拟南芥菜、 番茄、 烟草、 豌豆、 水稻或大麦。
在本发明的另一个实施方式中， 所述气孔生理状态为选自下组中的一种或多种 ： 气孔开度、 气孔密度、 气孔导度或气孔系数。
在本发明的另一个实施方式中， 所述植物与气孔生理状态相关的环境适应性表型 或行为为选自下组中的一种或多种 ： 叶片失水、 水分蒸腾速率、 光合作用效率、 抗旱节水性、 抗涝适水性或新鲜度保持。
在本发明的另一个实施方式中， 所述 PHYB 基因或其编码的蛋白质或多肽的减少 或功能的丧失或降低， 对正常植物气孔生理状态产生抑制作用 ； 所述 phyB 基因或其编码的 蛋白质或多肽的增加或功能的增强， 对正常植物气孔生理状态产生促进作用。
在一个优选例中， 所述抑制作用包括选自下组的一种或多种 ： 气孔开度减小、 气孔 导度降低、 气孔密度降低或气孔系数减少。 所述促进作用包括选自下组的一种或多种 ： 气孔 开度增大、 气孔导度提高、 气孔密度提高或气孔系数增大。
在另一个优选例中， 与植物气孔生理状态受到抑制相关的环境适应性表型或行为 包括选自下组中的一种或多种 ： 叶片失水减少、 水分蒸腾速率下降、 光合作用效率降低、 抗 旱节水性提高或保鲜时间延长。
在另一个优选例中， 与植物气孔生理状态受到促进相关的环境适应性植物表型或 行为包括选自下组中的一种或多种 ： 叶片失水增加、 水分蒸腾速率提高、 光合作用效率提高 或抗涝适水性提高。
在一个优选例中， 所述 phyB 基因或其编码的蛋白质或多肽的数量或功能的改变 通过选自下组的一种或多种方法实现 ： 物理诱变、 化学诱变、 T-DNA 插入法、 转座子插入法、 小分子 RNA 干扰、 基因敲除或多拷贝表达。
在本发明的另一个实施方式中， 所述植物还同时具有 cry1、 cry2 和 / 或 phyA 基因 或其编码的蛋白质或多肽的表达或功能的改变。
在一个优选例中， 所述植物选自下组的 ： cry1phyB 双突变体、 cry2phyB 双突变体、 phyAphyB 双突变体、 cry1cry2phyB 三突变体、 cry1phyAphyB 三突变体、 cry2phyAphyB 三突 变体、 cry1cry2phyAphyB 四突变体， 其中各基因的表达或功能变化趋势一致。在另一优选 例中， 所述突变均为功能缺失突变。
因此， 在本发明的该方面中， 还提供了 phyB 或其编码的蛋白质或多肽与 cry1、 cry2 和 / 或 phyA 基因或其编码的蛋白质或多肽的组合在调节植物气孔生理状态中的用途， 以及在调节与植物气孔生理状态相关的环境适应性表型或行为中的用途。
在本发明的第三方面中， 提供了一种产生与气孔生理状态相关的环境适应性表型 或行为发生改变的植物的方法， 所述方法包括改变所述植物中 phyB 基因或其编码的蛋白 质或多肽的数量或功能。
在一个优选例中， 所述植物与正常植物相比， 气孔生理状态受到抑制。 所述抑制包 括选自下组的一种或多种 ： 气孔开度减小、 气孔导度降低、 气孔系数减小或气孔密度降低。 由此， 所述植物具有如下的行为或表型 ： 叶片失水减少、 水分蒸腾速率下降、 光合作用效率 降低、 具有改善的抗旱节水性或保鲜时间延长。所述方法包括 ： 使得所述植物中 phyB 基因 或其编码的蛋白质或多肽减少或功能丧失或降低。
在另一优选例中， 所述植物与正常植物相比， 气孔生理状态受到促进。 所述促进包 括选自下组的一种或多种 ： 气孔开度增大、 气孔导度提高、 气孔系数增大或气孔密度提高。 由此， 所述植物具有如下的性能 ： 叶片失水增加、 水分蒸腾速率提高、 光合作用效率提高、 具 有改善的抗涝耐水 ( 适水 ) 性。所述方法包括 ： 使得所述植物中 phyB 基因或其编码的蛋白质或多肽增加或功能增强。
在另一优选例中， 通过选自下组的一种或多种步骤实现所述 phyB 基因或其编码 的蛋白质或多肽的数量或功能的改变 ： 物理诱变、 化学诱变、 T-DNA 插入法、 转座子插入法、 小分子 RNA 干扰、 基因敲除或多拷贝表达。
在本发明的另一个实施方式中， 所述植物是转基因植物或突变体。
在一个优选例中， 所述方法还包括使所述植物与其它正常植物、 突变体或转基因 植物杂交， 从而获得与气孔生理状态相关的植物行为或表型发生改变的杂交后代。
在另一个优选例中， 杂交用的植物在分类上属于同一科或不同科植物， 优选为同 一科植物。 所述植物优选为十字花科芸苔属、 茄科番茄属、 茄科烟草属、 蝶形花科、 禾本科稻 属或禾本科大麦属， 更优选 ： 拟南芥菜、 番茄、 烟草、 豌豆、 水稻或大麦。
在另一个优选例中， 所述杂交后代具有稳定的遗传性状。
在本发明的另一个实施方式中， 所述所述方法还包含改变选自 cry1、 cry2 和 / 或 phyA 基因或其编码的蛋白质或多肽的表达或功能。
在一个优选例中， 所述植物选自下组 ： cry1phyB 双突变体、 cry2phyB 双突变体、 phyAphyB 双突变体、 cry1cry2phyB 三突变体、 cry1phyAphyB 三突变体、 cry2phyAphyB 三突 变体、 cry1cry2phyAphyB 四突变体， 其中各基因的表达或功能变化趋势一致。在另一优选 例中， 所述突变均为功能缺失突变。 在本发明的第四方面中， 提供了用本发明方法制备的植物的用途， 其用于在干旱 或湿涝条件下生产农作物、 经济作物或其产品或延长植物或其产品的保鲜时间。
在本发明的其它方面， 还提供了一种与气孔生理状态相关的植物行为或表型发生 改变的突变体植物或转基因植物， 所述植物中 phyB 基因或其编码的蛋白质或多肽的数量 或功能较正常植物发生变化。
在一个优选例中， 所述植物中 phyB 基因或其编码的蛋白质或多肽减少或功能丧 失或降低。与正常植物相比， 所述植物的气孔生理状态受到抑制。所述抑制包括选自下组 的一种或多种 ： 气孔开度减小、 气孔导度降低、 气孔系数减小、 气孔密度降低。由此， 所述植 物具有如下的行为或表型 ： 叶片失水减少、 水分蒸腾速率下降、 光合作用效率降低、 具有改 善的抗旱节水性或保鲜时间延长。
在另一优选例中， 所述植物中 phyB 基因或其编码的蛋白质或多肽增加或功能增 强。与正常植物相比， 所述植物的气孔生理状态受到促进。所述促进包括选自下组的一种 或多种 ： 气孔开度增大、 气孔导度提高、 气孔系数增大或气孔密度提高。 由此， 所述植物具有 如下的性能 ： 叶片失水增加、 水分蒸腾速率提高、 光合作用效率提高或具有改善的抗涝耐水 ( 适水 ) 性。
在本发明的又一方面， 涉及 CRY1 或 CRY2 过表达对正常植物气孔生理状态产生 促进作用， 所述促进作用包括选自下组的一种或多种 ： 气孔开度增大、 气孔导度提高、 气孔 密度提高或气孔系数增大。本发明由此提供了一种产生具有与促进的气孔生理状态相关 的环境适应性表型或行为的植物的方法， 所述方法包括在该植物中提供过表达的 CRY1 或 CRY2。 所述植物叶片失水增加、 水分蒸腾速率提高、 光合作用效率提高或具有改善的抗涝耐 水 ( 适水 ) 性。在一个优选例中， 使所述植物同时具有 CRY1 过表达、 CRY2 过表达、 PHYB 过 表达中的任意两种或三种。
因此， 本发明涉及一种改变植物水需求量的方法， 该方法包括使该植物的 CRY1、 CRY2、 PHYA 和 PHYB 基因功能丧失、 降低或增强。本发明另一方面涉及获得适宜的水量需求 的植物的方法， 该方法包括使该植物的 CRY1、 CRY2、 PHYA 和 PHYB 基因功能丧失、 降低或增 强。 本发明再另一方面涉及一种改变植物开度和密度的方法， 该方法包括使该植物的 CRY1、 CRY2、 PHYA 和 PHYB 基因功能丧失、 降低或增强。本发明还涉及 CRY1、 CRY2、 PHYA 和 PHYB 基 因功能丧失、 降低或增强的植物。本发明还涉及 CRY1、 CRY2、 PHYA 和 PHYB 基因在改变植物 气孔密度和开度中的用途。
本发明的其它方面由于本文的公开内容， 对本领域的技术人员而言是显而易见 的。 附图说明
图 1A ： 利用生长约 21 天的 WT( 野生型 )、 phyB、 cry1cry2、 cry1cry2phyB 植株的离 体莲座叶片进行的失水实验。研究表明最不容易失水的植株为 cry1cry2phyB 三突变植株。 失水率为散失的水分占起始鲜重的百分比。图示的值为三次测量的平均值与标准差。每一 次的样品大小为 5-8 片离体莲座叶片。 图 1B ： WT( 野生型 )、 phyB、 cry1cry2、 cry1cry2phyB 突变体完整叶片的气孔导度。 -2 -1 测量时的光照强度为 250μmol· m · s 。 野生型植株的气孔导度明显高于 phyB、 cry1cry2、 cry1cry2phyB 突变体 (*， P ＜ 0.05， **， P ＜ 0.01， t 检验 )。
图2： WT、 phyB 和 phyB-ovx 黑暗处理后红光诱导的气孔开度。柱状图显示了统计 了至少 50 个气孔开度平均值 ± 标准差 (*， P ＜ 0.05， **， P ＜ 0.01， t 检验 )。白光下的结 果与红光诱导的结果类似。
图 3A ：显 示 WT( 野 生 型 )、 phyB、 cry1cry2、 cry1cry2phyB 突 变 体 在 -2 -1 160μmol·m ·s 白光下的气孔开度的激光共聚焦扫描显微镜的照片， 样品取自见光发芽 生长约四周 ( 其中在 MS 培养基上培养一周后， 种植到土壤中三周 ) 植株的成熟莲座叶片。
图 3B ：显 示 WT( 野 生 型 )、 phyB、 cry1cry2、 cry1cry2phyB 突 变 体 在 -2 -1 160μmol·m ·s 白光下的气孔开度统计数据， 材料同图 3A， 气孔开度单位为 μm。phyB 单突变和 cry1cry2 双突变的气孔开度显著小于野生型 (*， P ＜ 0.05)， 而 cry1cry2phyB 的 气孔开度比 phyB 单突变和 cry1cry2 双突变的气孔开度还要小， 与野生型相比具有极显著 差异 (**， P ＜ 0.01)。
图4： 生长在 160μmol·m-2·s-1 白光下约四周的 WT、 phyA、 phyB、 cry1、 phyAphyB、 cry1phyAphyB 突变体的莲座叶的气孔开度统计结果。单突变体中只有 phyB 的气孔开度明 显小于野生型 (*， P ＜ 0.05)， phyAphyB 的气孔开度比 phyB 单突变的气孔开度要小一些， 但 是 cry1phyAphyB 与野生型相比具有极显著差异 (**， P ＜ 0.01)。 -2
图 5A ： 生长在混合光 ( 蓝光 30μmol·m ·s-1+ 红光 50μmol·m-2·s-1+ 远红光 6μmol·m-2·s-1) 下的 WT、 cry1cry2、 phyAphyB 和 cry1phyAphyB 的莲座叶远轴面气孔发育 状况的干涉相差照片， 标尺统一为 20μm。
图 5B ： 柱形图显示气孔系数的统计结果， 材料同图 5A。气孔系数定义为气孔在整 个表皮细胞中所占的比例。cry1cry2、 phyAphyB 和 cry1phyAphyB 的气孔系数都极显著低 于野生型 (**， P ＜ 0.01)， 其中 cry1phyAphyB 的气孔系数最低， 甚至显著低于 phyAphyB。
具体实施方式
本发明的发明人通过长期而深入的研究发现 ： 普遍存在于双子叶和单子叶植物中 的 phyB 基因表达及功能的改变对植物气孔生理状态具有非常显著的影响作用 ： 当 phyB 基 因表达或功能增强时， 气孔生理状态受到明显促进 ； 反之， 当 phyB 基因表达或功能降低甚 至丧失时， 气孔生理状态受到明显抑制。并且， 当 phyB 基因与其它光受体基因的表达或功 能同时降低甚至丧失时， 气孔生理状态的抑制更为明显。 在此基础上， 本发明人提供了 phyB 基因或其编码的蛋白质或多肽在改变与植物气孔生理状态相关的行为或表型中的用途、 产 生具有该变化的植物的方法及其在生产中的用途， 从而完成了本发明。
具体而言， 本发明人经研究发现， CRY1、 CRY2 和 PHYB 过量表达在一定的光强下都 会表现出气孔密度增加的表型， 白光下 cry1cry2 和 phyAphyB 的气孔系数明显低于野生型， 而 cry1phyAphyB 的气孔系数是最低的。通过对气孔开度的分析， 本研究发现 phyB 单突 变体的气孔开度比野生型的小， phyB 过量表达导致气孔开度显著增加。cry1cry2phyB 和 cry1phyAphyB 两个三突变体的气孔开度比野生型和其父 / 母本都更小。 通过对这四个光受 体的表达水平和功能 ( 尤其是 PHYB) 的控制可以同时改变气孔密度和气孔开度， 而这两个 指标都与植物的光合效率以及水利用率紧密相关， 是改变植物性质的关键环节。本发明可 用于培养抗旱节水或充分利用水资源的供观赏和绿化的园林植物和农作物及经济作物。 气孔生理状态及其相关的植物行为或表型
在本发明中， “气孔” 是指高等植物叶片表皮特有的、 由两个肾形 ( 双子叶植物 ) 或 哑铃形 ( 单子叶植物 ) 的保卫细胞围绕而成的小孔， 是植物吸收二氧化碳和水分进出植物 体的必经通道。
在本发明中， “气孔密度” 是指单位面积上气孔的数目。 “气孔系数” 是气孔个数与 气孔和表皮细胞之和的比值。 “气孔开度” 是指气孔的孔径， 体现了气孔开关的程度， 其单位 通常为微米 (μm)。 “气孔导度” 是指植物气孔传导 CO2 和水汽的能力， 它也是描述气孔开度 的一个指标， 通常仪器测定的单位同于蒸腾速率。
本领域中已知气孔的生理状态对植物的诸多行为或表型起到重要作用， 例如 ： 气 孔的密度大小和开关程度直接决定植物水分蒸腾的速率和光合作用的效率， 决定叶片失水 和抗旱能力， 影响植物或其产品的保鲜时间。
例如， 气孔密度越大 ( 或气孔系数越大 )， 开启程度越高 ( 如气孔开度越大、 气孔导 度越大 )， 则植物的水分蒸腾速率和光合作用效率越高。反之， 气孔密度越小， 开启程度越 低， 则植物的水分蒸腾速率和光合作用效率越低， 抗旱能力越强， 失水较少从而适于延长保 鲜时间。
phyB 基因及其编码的蛋白质或多肽
在本发明中， 术语 “phyB 基因” 是指植物中普遍存在的光敏色素基因， 其编码 PHYB 蛋白或多肽。以拟南芥菜为例， phyB 基因的登录号为 X17342， cDNA 序列如 SEQ ID NO ： 5所 示。通常， 其它天然植物的 phyB 基因与拟南芥 phyB 基因可高度同源， 或在严格条件下能与 拟南芥 phyB 基因序列杂交， 或是与拟南芥 phyB 基因高度同源的家族基因分子。应理解， 本 发明中的术语 “phyB 基因” 还包括 ： 非天然的， 但与天然植物的 phyB 基因 ( 尤其是拟南芥 phyB 基因 ) 高度同源、 或在严格条件下能与所述 phyB 基因序列杂交、 或是与所述 phyB 基因
高度同源的家族基因， 且具有改变植物气孔生理状态的活性的分子。
与拟南芥 phyB 基因高度同源 ( 如具有 50％以上， 优选 55％以上、 60％以上、 65％ 以上、 70％以上、 75％以上、 80％以上， 更优选 85％以上如 85％、 90％、 95％、 甚至 98％序列 相同性 ) 的其它基因也在本发明优选考虑的等同范围之内。比对序列相同性的方法和工具 也是本领域周知的， 如 BLAST。
如本文所用， 术语 “严格条件” 是指 ： (1) 在较低离子强度和较高温度下的杂交和 洗脱， 如 0.2×SSC， 0.1％ SDS， 60℃； 或 (2) 杂交时加有变性剂， 如 50％ (v/v) 甲酰胺， 0.1％ 小牛血清 /0.1 ％ Ficoll， 42 ℃等 ； 或 (3) 仅在两条序列之间的相同性至少在 50 ％， 优选 55％以上、 60％以上、 65％以上、 70％以上、 75％以上、 80％以上、 85％以上或 90％以上， 更优 选是 95％以上时才发生杂交。例如， 所述序列可为 (a) 中所限定序列的互补序列。
本发明的 phyB 基因核苷酸全长序列或其片段通常可以用 PCR 扩增法、 重组法或人 工合成的方法获得。对于 PCR 扩增法， 可根据本发明所公开的有关核苷酸序列， 尤其是开放 阅读框序列来设计引物， 并用市售的 cDNA 库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备 的 cDNA 库作为模板， 扩增而得有关序列。当序列较长时， 常常需要进行两次或多次 PCR 扩 增， 然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
在本发明中， 术语 “PHYB 蛋白或多肽” 或 “phyB 基因编码的蛋白质或多肽” 指由本 发明的 phyB 基因编码的蛋白质或多肽， 该定义中也包括具有改变植物气孔生理状态的活 性的上述蛋白质或多肽的变异形式。所述 phyB 基因编码的蛋白质或多肽的序列包括但不 限于 ： (a)SEQ ID NO ： 6； 或 (b) 在 (a) 限定的氨基酸序列中经过取代、 缺失或添加一个或几 个氨基酸且具有改变植物气孔生理状态的活性的由 (a) 衍生的蛋白质或多肽。
本发明的蛋白质或多肽可以是天然纯化的产物， 或是化学合成的产物， 或使用重 组技术从原核或真核宿主 ( 例如， 细菌、 酵母、 高等植物、 昆虫和哺乳动物细胞 ) 中产生。本 发明中 PHYB 蛋白或多肽优选由拟南芥 phyB 基因或其同源基因或家族基因编码。
本发明蛋白质或多肽的变异形式包括 ( 但并不限于 ) ： 一个或多个 ( 通常为 1-50 个， 较佳地 1-30 个， 更佳地 1-20 个， 最佳地 1-10 个， 例如 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9 或 10 个 ) 氨 基酸的缺失、 插入和 / 或取代， 以及在 C 末端和 / 或 N 末端添加一个或数个 ( 通常为 20 个以 内， 较佳地为 10 个以内， 更佳地为 5 个以内 ) 氨基酸。例如， 在本领域中， 用性能相近或相 似的氨基酸进行取代时， 通常不会改变蛋白质或多肽的功能。又比如， 在 C 末端和 / 或 N 末 端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质或多肽的功能， 例如本发明的 PHYB 蛋白 质或多肽可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基而仍然具有改变植物气孔生理状态的活性。
可采用辐射或暴露于诱变剂下来产生随机诱变， 也可通过定点诱变法或其它已知 的分子生物学技术来获得上述 (b) 中的蛋白质或多肽。可利用编码所述蛋白质或多肽的编 码序列来构建转基因植物， 并观察该转基因植物的性状是否有所改良来筛选和鉴别所得蛋 白质或多肽。
根据重组生产方案所用的宿主， 本发明的蛋白质或多肽可以是糖基化的， 或可以 是非糖基化的。该术语还包括 PHYB 蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括 ： 同源序列、 保守性变异体、 等位变异体、 天然突变体、 诱导 突变体、 在高或低的严紧度条件下能与 PHYB 蛋白编码序列杂交的序列所编码的蛋白。本发 明还可使用其它多肽， 如包含 PHYB 蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外， 本发明还包括了 PHYB 蛋白的可溶性片段。通常， 该片段具有 PHYB 蛋白序列的至少约 10 个连 续氨基酸， 通常至少约 30 个连续氨基酸， 较佳地至少约 50 个连续氨基酸， 更佳地至少约 80 个连续氨基酸， 最佳地至少约 100 个连续氨基酸。
基因或其编码的蛋白质或多肽的数量或功能的改变
本发明中涉及 phyB 基因或其编码的蛋白质或多肽的数量或功能的改变， 所述改 变包括数量的减少或增加， 功能的丧失、 降低或增强。本发明中还涉及 phyB 基因或其编码 的蛋白质或多肽的上述变化与其它光受体编码基因或它们所编码的蛋白质或多肽的数量 或功能的改变的组合， 优选所述改变的趋势是相同的， 例如同时发生功能降低。
在本发明中， “基因或其编码的蛋白质或多肽功能丧失或者降低” 是指所述基因或 蛋白质或多肽的功能全部或者部分的丧失， 包括基因表达水平降低或不表达、 蛋白质部分 片段缺失导致丧失功能等。 “基因或其编码的蛋白质或多肽的减少” 是指所述基因或蛋白质 或多肽在植物细胞中的数量的降低。
根据发明人的研究， phyB 基因或其编码的蛋白质或多肽的减少或功能丧失或者降 低， 可导致正常气孔生理状态受到抑制 ( 例如气孔密度减小、 气孔开度降低、 气孔导度降低 等 )， 从而使得与气孔生理状态密切相关的植物行为或表型发生相应的变化 ( 例如水分蒸 腾的速率降低和光合作用的效率降低等 )。 该性质可用于改善植物对环境的适应性， 例如改 善植物抗旱节水性， 也可用于延长植物或其产品的保鲜时间。 在本发明中， “基因或其编码的蛋白质或多肽功能增强” 是指所述基因或蛋白质或 多肽的功能的提高， 包括基因过表达、 点突变导致的功能增强等。 “基因或其编码的蛋白质 或多肽的增加” 是指所述基因或蛋白质或多肽在植物细胞中的数量的增加， 例如构建多拷 贝的。
根据发明人的研究， phyB 基因或其编码的蛋白质或多肽的增加或功能增强， 可导 致正常气孔生理状态受到促进 ( 例如气孔密度变大、 气孔开度提高、 气孔导度提高等 )， 从 而使得与气孔生理状态密切相关的植物行为或表型发生相应的变化 ( 例如水分蒸腾的速 率提高和光合作用的效率提高等 )。 该性质可用于改善植物对环境的适应性， 例如改善植物 抗涝耐 ( 适 ) 水性， 也可用于通过提高植物的光合作用效率提高产量或缩短生长周期。
本发明使 CRY 或 PHYB 基因功能增强的方法并不限于上述方法， 任何能使 CRY 或 PHYB 基因功能增强的方法都可以用于实施本发明的技术方案。
本发明人通过研究还发现， 在使得植物中 phyB 基因或其编码的蛋白或多肽功能 丧失或降低的同时， 使其它光受体编码基因 ( 例如 cry1、 cry2、 phyA 等 ) 或其编码的蛋白 质或多肽的功能丧失或者降低， 可更显著地抑制的正常气孔生理状态。 由此， 通过构建含有 phyB 功能丧失或降低突变的双突变体或多突变体， 可进一步抑制气孔生理状态， 从而进一 步改变植物对环境的适应性， 例如更显著改善植物抗旱节水性。
可利用其它的表型变化来筛选突变体植株或转基因植物， 例如 ： phyB 基因功能丧 失或降低导致的红光下下胚轴明显伸长、 真叶叶绿素含量变少、 成熟植株开花时间提前等 变化 ； cry1 基因功能丧失或降低导致中等或者是强蓝光条件下下胚轴明显伸长、 花色素苷 积累水平下降 ； cry2 基因功能丧失或降低导致弱蓝光下下胚轴明显伸长、 成熟植株开花时 间延迟 ； phyA 基因功能丧失或降低导致红光下下胚轴明显伸长、 真叶叶绿素含量变少、 成 熟植株开花时间提前。
本发明可采用各种方法来使 CRY1、 CRY2、 PHYA 和 PHYB 基因功能丧失、 降低或提高。 这些方法包括采用物理诱变法 ( 如使用快中子、 γ 射线 )、 化学诱变法 ( 如使用 EMS、 甲基 磺酸乙酯 )、 T-DNA 或转座子插入的方法。例如， 在本发明的一个优选实施方式中， 通过敲除 phyB、 或其它光受体基因 ( 例如 cry1、 cry2、 phyA 等 ) 而实现所述功能的丧失。
在本发明方法中， 可采用如下方法获得二突变体或多突变体 ： 首先， 获得 phyB 基 因突变、 cry1 基因突变、 cry2 基因突变或 phyA 基因突变的突变植株 ； 然后， 使所述突变植 株杂交， 通过选择获得二突变体、 三突变体或多突变体， 例如 cry1phyB、 cry1cry2phyB 或 cry1phyAphyB 突变体植株。
也可以利用 CRY1、 CRY2、 PHYA 和 PHYB 基因的 cDNA 序列， 构建 RNAi 的表达载体， 导 入植物获得转基因植株。分别筛选在蓝光条件下、 远红光条件下和红光条件下下胚轴伸长 的转基因植株， 即可获得 CRY1、 CRY2、 PHYA 和 PHYB 功能丧失或降低的植株。
使突变种子在红光下发芽， 筛选下胚轴明显变长的植株。 移栽到土壤中， 筛选在长 日照条件下 (16 小时光照 /8 小时黑暗 ) 开花时间明显提前以及叶子发黄的植株， 通过 PCR 来分析 PHYB 基因序列， 即可获得 phyB 功能丧失或者降低的突变体。 使突变种子在蓝光下发 芽， 筛选下胚轴明显变长的植株。然后， 将该下胚轴较长的植株移栽到土壤中， 通过 PCR 来 筛选 CRY1 基因序列， 即可获得 CRY1 功能丧失或者降低的突变体。使突变种子在弱蓝光下 发芽， 筛选下胚轴明显变长的植株。 然后将该下胚轴较长的植株移栽到土壤中， 筛选在长日 照条件下 (16 小时光照 /8 小时黑暗 ) 开花时间明显延迟的植株， 通过 PCR 来分析 CRY2 基 因序列， 即可获得 CRY2 功能丧失或者降低的突变体。使突变种子在远红光下发芽， 筛选下 胚轴明显变长的植株。通过 PCR 来分析 PHYA 基因序列， 即可获得 phyA 功能丧失或者降低 的突变体。
也可以利用 CRY1、 CRY2、 PHYA、 PHYB 基因的 cDNA 序列， 构建 RNA 干扰或过表达的 植物表达载体， 导入植物获得转基因植株。
phyB 最容易识别的功能包括在红光下抑制下胚轴的伸长、 叶绿素含量减少和抑制 开花 [Reed， J.W. 等 (1994).Plant Physiol 104， 1139-1149.]。CRY1 最容易识别的功能 -2 -1 包括在中等或强蓝光下 (10-30μmol·m ·s ) 抑制下胚轴的伸长、 促进花色素苷的积累 [Ahmad， M 等， (1993)Nature 366 ： 162-166 ； Ahmad， M. 等， (1995).Plant J.8 ： 653-658] ； -2 -1 CRY2 最容易识别的功能包括在弱蓝光下 (1-5μmol·m ·s ) 抑制下胚轴的伸长 [Lin， C. 等， (1998).Proc Natl Acad Sci U S A 95， 2686-2690.] 和促进开花 [Guo， H. 等 (1998). Science 279， 1360-1363.] ； phyA 最 容 易 识 别 的 功 能 是 在 远 红 光 下 抑 制 下 胚 轴 的 伸 长 [Whitelam GC 等， (1993)Plant Cell 5(7)， 757-768.]。根据上述功能， 对于所获得的表达 CRY 或 phyB 的 RNAi 的转基因植株 ： 在中等或者是强蓝光条件下筛选得到的下胚轴明显伸 长、 花色素苷积累水平下降的植株， 即为 CRY1 功能丧失或降低的转基因植株 ； 在弱蓝光下 筛选得到的下胚轴明显伸长， 且在土壤中长成的成熟植株开花时间明显推迟的的转基因植 株， 即为 CRY2 功能丧失或降低的转基因植株 ； 在红光下筛选得到的下胚轴明显伸长， 且在 土壤中长成的成熟植株开花时间明显提前及叶片的叶绿素的含量减少的转基因植株， 即为 phyB 功能丧失或降低的转基因植株。
本发明使 CRY 或 PHYB 基因功能丧失或者降低的方法并不限于上述方法， 任何能使 CRY 或 PHYB 基因功能丧失或者降低的方法都可以用于实施本发明的技术方案。突变体植物或转基因植物
本发明还涉及与气孔生理状态相关的植物行为或表型发生改变的植物， 所述中 phyB 基因或其编码的蛋白质或多肽的数量或功能发生变化。在本发明的优选实施方式中， 所述植物是转基因植物或突变体。
在一个优选实施方式中， 所述方法还包括使所述植物与其它正常植物、 突变体或 转基因植物杂交， 从而获得与气孔生理状态相关的植物行为或表型发生改变的杂交后代， 优选所述杂交后代具有稳定的遗传性状。杂交用的植物在分类上属于同一科或不同科植 物， 优选为同一科植物。 所述植物优选为十字花科芸苔属、 茄科番茄属、 茄科烟草属、 蝶形花 科、 禾本科稻属或禾本科大麦属， 更优选 ： 拟南芥菜、 番茄、 烟草、 豌豆、 水稻或大麦。
所述植物还优选包含选自 cry1、 cry2 和 / 或 phyA 基因或其编码的蛋白质或多肽 的表达或功能的改变。在一个优选实施方式中， 所述植物为 phyB 功能丧失或降低突变的双 突变体或多突变体， 其可更显著地抑制气孔生理状态， 从而进一步改善植物对环境的适应 性， 例如更显著改善植物抗旱节水性。
本发明的突变体植物或转基因植物具有改善的环境适应性能， 可用于例如在干旱 或湿涝条件下生产农作物、 经济作物或其产品。 本发明的优点
本发明的主要优点在于 ：
(1) 提供了普遍存在于高等植物中的 phyB 基因及其编码的蛋白质或多肽的新用 途， 其可通过改变植物气孔生理状态来有效改善植物的相关行为或表型， 例如抗旱节水性、 生长速度、 产品保鲜等 ；
(2) 提供了具有改善性状、 抗性或适应性的转基因植物， 为粮、 棉、 油等生产和加工 提供了优良原料和产品 ；
(3) 提供了改善植物性状、 抗性或适应性的新途径， 因而具有巨大应用前景。
实施例
下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用 于限制本发明的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件， 如 《分子克隆实验手册》 (Molecular cloning ： A laboratory manual， 3 rd ed.， Sambrook 等， Cold Spring Harbor Laboratory， 2001) 和 《植物分子生物学实验手册》 (Plant Molecular Biology-A Laboratory Manual， Clark 等， Springer-Verlag， 1997) 中所述的条件， 或按照 制造厂商所建议的条件。
除非另外说明， 否则百分比和份数按重量计算。 除非另行定义， 文中所使用的所有 专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外， 任何与所记载内容相似或均 等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例 1 ： cry1cry2phyB 三突变体的构建
用化学或物理诱变双子叶植物种子， 创制突变体库 ( 参考上文所列关于 cry1、 cry2 和 phyB 基因的文献 )。
用 M2 代种子分别在强蓝光、 弱蓝光、 红光和远红光下筛选下胚轴高的小苗。将在 弱蓝光下获得的下胚轴变高的突变体移栽到土壤中， 选择开花时间延迟的突变体。将在红 光下获得的下胚轴变高的突变体移栽到土壤中， 选择开花时间提前的突变体。
用 PCR 方法分别扩增以上突变体的 CRY1、 CRY2、 PHYA、 PHYB 位点， 并通过测序确定 突变位点， 获得单突变体。当获得确定的 cry1、 cry2、 phyA、 phyB 突变体后， 可以先将 cry1、 cry2 突变体杂交， 获得 F1 代种子。在蓝光下对 F2 代进行筛选， 选择下胚轴比 cry1 突变 体明显高的小苗， 移栽到土里后选择开花时间延迟的植株与 phyB 突变体杂交。从 F3 代中 筛选出在蓝光和红光下下胚轴都变高的突变体， 并且通过 PCR 确定三个位点的突变， 获得 cry1cry2phyB 纯合三突变体。其它双突变体、 三突变体构建参考此方法。
实施例 2 ： 过量表达 CRY1、 CRY2 和 phyB 转基因植株的构建
通过 PCR 方法分别获得 CRY1、 CRY2 和 PHYB 的全长 cDNA( 分别为 SEQ IDNOs ： 1、 3 和 5)， 分别插入 pKY71 载体或 PHB 载体的 35S 启动子下游， 获得分别过量表达 CRY1、 CRY2 和 phyB 的植物表达载体。再用这些载体分别转化植物， 获得转基因植株。分别在中等强度蓝 -2 -1 -2 -1 光 (20μmol·m ·s )、 弱蓝光 (1-5μmol·m ·s ) 和红光的条件下筛选下胚轴明显变短 的小苗， 获得的转基因植株分别为过量表达 CRY1、 CRY2 和 phyB 的转基因植株。
实施例 3 ： 气孔密度和开度的研究
光源及仪器
测量气孔系数时所用的光源是 LED 屏， 蓝光的波长为 469 纳米， 红光的波长是 680 纳米， 远红光的波长为 730 纳米。在连续光照条件下的温度是 22℃。光强测定用的仪器是 美国 Li-Cor 公司的 Li250 光量子测定仪和 ILT1400-A 光度计 (ILT， MA， USA)。
失水实验
取培养了 21 天的 WT( 野生型 )、 phyB、 cry1cry2、 cry1cry2phyB 拟南芥植株的离 -2 -1 体莲座叶片， 放在 22℃、 连续 140μmol·m ·s 的白炽荧光灯照射的条件下， 测量其水分 损失， 以最初新鲜叶子的重量百分比表示 ( 按 Leung， J.， Merlot， S.& Giraudat， J.(1997) Plant cell 9， 759-771 所述 )。相对湿度维持为 45％。
气孔导度的测量
将生长了约 21 天左右的 WT( 野生型 )、 phyB、 cry1cry2、 cry1cry2phyB 植株转移 -2 -1 到 250μmol·m ·s 的白炽荧光灯照射条件下， 光照一小时后每种植物材料选取 10-12 片 完全伸展的叶子， 利用气体交换测量系统 LI-6400(LI-COR Inc.Lincoln， NE， USA) 测定气孔 -1 导度。在测定的过程中， 将 CO2 的浓度保持在 390μmol·mol ， 将温度维持在 22℃。
气孔开度测量
在测量气孔开度以前， 先将生长至 3-4 周的植株置于黑暗下处理 72 小时， 使所有 气孔关闭。在微弱的红光下撕取叶片表皮， 置于 2ml 反应液 (5mM MES， 上海生工， 货号为 ME169)， pH6.5， 50mM KCl， 0.1mM CaCl2) 中， 然后在相应光照条件 ( 在每个具体的实验中具 体指明 ) 下处理 3 小时。接着用显微镜 (NikonECLIPSE TS100) 观察， 并用软件 (Image J) 测量气孔的开度。气孔的照片是用激光共聚焦显微镜 (Carl Zeiss LSM-510 META) 所拍摄 的。所有的测量工作在 9:00 到 15:00 之间完成。
气孔密度和气孔系数的测量
气孔密度定义为单位面积上的气孔数目。气孔系数 (SI) 用公式表示为 ： SI ＝气 孔个数 /( 气孔个数 + 表皮细胞的个数 )×100。
取 生 长 在 混 合 光 ( 蓝 光 30μmol·m-2·s-1+ 红 光 50μmol·m-2·s-1+ 远 红 光 6μmol·m-2·s-1) 下的 WT、 cry1cry2、 phyAphyB 和 cry1phyAphyB 的植株的真叶， 放在酒精中浸泡约 4 小时， 用一系列酒精梯度 (90％→ 75％→ 50％→ 25％ ) 复水， 然后放在透明液 ( 甘油∶水合氯醛∶水＝ 1 ∶ 8 ∶ 1， (V ∶ W ∶ V)) 中过夜。样品置于 LeicaDM2500 显微 镜下， 每片真叶随机选取 5 个区域拍照。统计约 5 片真叶， 得到平均值和标准差。
试验结果及讨论
(1) 拟南芥三突变体 cry1cry2phyB 失水速率最慢， 气孔导度最小
通过用 WT、 phyB、 cry1cry2、 cry1cry2phyB 植株的离体莲座叶片进行的失水实验 的结果如图 1A 所示。研究表明 ： 最不容易失水的植株为 cry1cry2phyB 三突变植株 ； phyB 单突变植株的失水率低于野生型植株 ； 而 cry1cry2 双突变体植株的失水率则低于 phyB 单突变植株。即， 失水率从高至低为 ： WT → phyB 单突变植株→ cry1cry2 双突变体植株 → cry1cry2phyB 三突变植株。
气孔导度实验的结果如图 1B 所示， 其结果与失水实验的结果相一致。气孔导度的 测定试验表明 ： cry1cry2phyB 三突变植株的气孔导度最小， 与气孔导度最大的 WT 野生型植 株相比， 具有极显著的差异 (**P ＜ 0.01) ； phyB 单突变和 cry1cry2 双突变体的植株的气 孔导度居于其间， 与 WT 植株相比， 具有显著差异 (*P ＜ 0.05)。即， 气孔导度从大到小为 ： WT → phyB 单突变植株→ cry1cry2 双突变体植株→ cry1cry2phyB 三突变植株。
(2) 拟南芥 phyB 单突变体的气孔开度比野生型的小， phyB 过量表达导致气孔开度 显著增加
WT、 phyB 和 phyB-ovx( 将由 35S 强启动子启动的 PHYB cDNA 序列构建到一个植物 表达载体中， 将这个载体转入植物中， 挑选具有过表达表型的单株 ) 黑暗处理后红光诱导 的气孔开度实验结果如图 2 所示。 柱状图所示为至少 50 个气孔开度的统计值， 以平均值 ± 标准差表示。结果显示 ： phyB 单突变体的气孔开度明显变小， phyB-ovx 气孔开度显著增加 (*P ＜ 0.05， **P ＜ 0.01， t 检验 )。
白光下的结果与红光诱导的结果类似。
(3) 拟南芥三突变体 cry1cry2phyB 的气孔开度最小
对见光发芽生长约四周 ( 其中在 MS 培养基上培养一周后， 种植到土壤中三周 ) 的 植株在白光下进行气孔开度的观察结果和统计结果分别如图 3A 和图 3B 所示。
结果显示 ： phyB 单突变和 cry1cry2 双突变的气孔开度均显著小于野生型 (*， P ＜ 0.05)， 而 cry1cry2phyB 三突变体的气孔开度比 phyB 单突变和 cry1cry2 双突变的气孔 开度还要小， 与野生型具有极显著差异 (**， P ＜ 0.01)。
上述结果表明 ： CRY 和 phyB 共同参与了白光诱导的气孔开放。
(4) 拟南芥三突变体 cry1phyAphyB 的气孔开度小于单突变体和双突变体对生长 约四周的植株在白光下进行气孔开度的统计结果如图 4 所示。
结果显示 ： 单突变体的气孔开度均有所减小， 其中 phyB 的气孔开度显著小于 野生型 (*P ＜ 0.05) ； phyAphyB 双突变体的气孔开度比 phyB 单突变的气孔开度更小 ； cry1phyAphyB 三突变体的气孔开度与野生型相比， 具有极显著差异 (**， P ＜ 0.01)。
上述结果表明 ： CRY、 phyA 和 phyB 共同参与了白光诱导的气孔开放。
(5)CRY1、 CRY2、 PHYA 和 PHYB 都参与调节气孔系数
气孔密度的观察和气孔系数的统计结果分别如图 5A 和图 5B 所示。
生 长 在 混 合 光 ( 蓝 光 30μmol·m-2·s-1+ 红 光 50μmol·m-2·s-1+ 远 红 光6μmol·m-2·s-1) 下的拟南芥 cry1cry2、 phyAphyB 和 cry1phyAphyB 突变株的莲座叶的气 孔系数均极显著低于野生型 (**， P ＜ 0.01)， cry1phyAphyB 的气孔系数最低， 甚至极显著低 于 phyAphyB( 图中以 WT 为基准 )。
研究显示 ： 突变体的气孔系数低于野生型， 而野生型中这些基因是正常起作用的， 说明这些基因的功能是提高气孔系数。
(6)CRY1、 CRY2、 PHYA 和 PHYB 都可以提高气孔密度
如表 1 中所列的气孔密度的数据， 其中 CRY1-OX、 CRY2-OX 和 PHYB-OX 分别表示过 表达 CRY1、 CRY2 和 PHYB 的植株。
结果显示 ： 增加 CRY1、 CRY2 和 PHYB 的表达量都可以导致气孔密度的极显著增加 ； 而 phyB 缺失， 则导致气孔密度极显著降低， 而这几个基因的其它多突变体也表现出气孔密 度降低的表型。
表1
双线下划线 代表气孔密度与 WT 相比极显著增加， **， P ＜ 0.01
波纹下划线 代表气孔密度与 WT 相比极显著降低， **， P ＜ 0.01
实施例 4 ： 用 RNAi 的方法来构建 CRY1、 CRY2、 phyB 功能缺失的三突变
将反向 CRY1 全长 cDNA 插入 pKY71 载体 [Shardl， C.L. 等， (1987)Gene 61， 1-11] 中的 35S 启动子下游， 获得反义表达的植物载体。也可以用双链 RNA 干扰手段， 将两段长度 约 500bp 的 CRY1cDNA 片段 ( 可在 cDNA 上任何位置选取， 本实施例中选用 1427 ～ 1927bp) 反向串联后插入 pKY71 载体中的 35S 启动子下游， 以获得干扰 CRY1 的 RNAi 载体。
通过农杆菌介导的遗传转化将该载体导入植物， 在 F1 代抗卡那霉素的转基因种 子在强蓝光下发芽后， 筛选下胚轴明显伸长的小苗， 经过自交获得 CRY1 基因被敲除、 纯合 的转基因植株。将两段长度约 500bp 的 CRY2 cDNA 片段 ( 可在 cDNA 上任何位置选取， 本实 J. 等 (2005)， PNAS， 102， 施例中选取的是 1418 ～ 1839bp) 反向串联后插入 pHB 载体 [Mao， 12270-12275] 中的 35S 启动子下游， 获得干扰 CRY2 的 RNAi 载体。
用携带该载体的农杆菌转化 CRY1 基因被敲除的纯合的转基因植株， 利用潮霉素 筛选得到在弱蓝光下下胚轴更高的小苗， 移栽到土壤后用除草剂喷洒， 选择开花时间延迟 的抗性植株， 即为 CRY1 和 CRY2 功能缺失的双突变体。
将两段长度约 500bp 的 PHYB cDNA 片段 ( 可在 cDNA 上任何位置选取， 本实施例中 选取的是 2760 ～ 3260bp) 反向串联后插入 pKY71 载体中的 35S 启动子下游， 获得干扰 phyB 的 RNAi 载体。用携带该载体的农杆菌转化 CRY1 和 CRY2 功能缺失的转基因植株， 抗卡那霉 素的转基因种子在红光下发芽后， 筛选下胚轴明显伸长的小苗， 经过自交获得 CRY1、 CRY2、 phyB 功能缺失的三突变。上述方法敲掉基因的顺序可以更改。
采用和实施例 3 相同实验方法研究所获得的 CRY1、 CRY2、 phyB 功能缺失的三突变。 实验结果表明 ： 本实施例获得的三突变体同样具有高抗旱性， 失水最慢， 气孔导度最小， 且 观察到的抗旱性与蓝光和红光诱导的气孔发育和气孔开放相关， 其气孔显示出减少的蓝光 和红光应答。
实施例 5 ： CRY1、 CRY2 和 phyB 功能缺失三突变体的构建
由于 CRY1 是通过 N 端功能区 (CNT1) 介导的二聚体形式发挥作用的， 当将 CNT1 导 入野生型植株中， 由于 CNT1 和内源的 CRY1 形成 CNT1-CRY1 二聚体， 该二聚体没有天然的 CRY1-CRY1 二聚体的功能， 所以由于这种 CNT1 的负显性效应导致表达 CNT1 植株呈现 cry1 突变体的表型 [Sang， Y. 等， (2005).The plantcell 17， 1569-1584]。 通过 PCR 获得 CNT1 片段， 将该片段插入 pKY71 载体中的 35S 启动子下游， 获得能 导致负显性效应的植物表达载体， 然后转入植物， 筛选获得具有 cry1 突变体表型的转基因 植株。 利用该转基因植株， 通过 RNAi 敲除 CRY2， 在蓝光下筛选下胚轴明显伸长， 同时移植到 土壤后开花明显延迟的植株。利用 CRY1 和 CRY2 功能缺失的双突变体植株， 通过 RNAi 敲除 PHYB， 在红光下筛选下胚轴明显伸长， 同时移植到土壤后开花明显提前的植株。 这样的植株 即为功能上的 cry1cry2phyB 三突变体。
采用和实施例 3 相同方法研究所获得的 CRY1、 CRY2、 phyB 功能缺失的三突变， 结 果显示 ： 此实施例获得的三突变体同样具有抗旱性， 失水最慢， 气孔导度最小， 且观察到的 抗旱性与蓝光和红光诱导的气孔发育和气孔开放相关， 其气孔显示出减少的蓝光和红光应 答。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考， 就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。 此外应理解， 在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
序列表
<110> 中国科学院上海生命科学研究院
<120> 改变植物气孔开度和密度的方法
<130>094581
<160>8
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>2046
<212>DNA <213> 拟南芥 (Arabidopsis thaliana) <220> <221>CDS <222>(1)..(2046) <400>1 atg tct ggt tct gta tct ggt tgt ggt tct ggt ggt tgt agt att gta Met Ser Gly Ser Val Ser Gly Cys Gly Ser Gly Gly Cys Ser Ile Val 1 5 10 15 tgg ttt aga aga gat ctt agg gtt gaa gat aat cca gct tta gca gca Trp Phe Arg Arg Asp Leu Arg Val Glu Asp Asn Pro Ala Leu Ala Ala 20 25 30 gca gta aga gct ggt cca gtg att gct ctg ttt gtt tgg gca cca gaa Ala Val Arg Ala Gly Pro Val Ile Ala Leu Phe Val Trp Ala Pro Glu 35 40 45 gaa gaa gga cac tat cat cca ggt agg gtt tct agg tgg tgg ctc aag Glu Glu Gly His Tyr His Pro Gly Arg Val Ser Arg Trp Trp Leu Lys 50 55 60 aac agt ttg gct cag ctt gat tct tct ctt aga agt ctt ggt act tgt Asn Ser Leu Ala Gln Leu Asp Ser Ser Leu Arg Ser Leu Gly Thr Cys 65 70 75 80 ctt atc acc aag aga tct act gat agt gtt gct tct ctt ctt gat gtt Leu Ile Thr Lys Arg Ser Thr Asp Ser Val Ala Ser Leu Leu Asp Val 85 90 95 gtt aaa tcc act ggt gct tct cag atc ttc ttc aac cat ttg tat gat Val Lys Ser Thr Gly Ala Ser 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说明书20/45 页435 His His Pro Trp Asn Ala 450 Glu Leu Gly Ser Asn Tyr 465 470 Lys Ala Arg Leu His Glu 485 Ala Ser Arg Ala Ala Ile 500 Ser Ala Glu Val Glu Glu 515 Met Glu Glu Thr Glu Pro 530 Asp Gln Met Val Pro Ser 545 550440 Pro Glu Ser Val Leu 455 Pro Leu Pro Ile Val 475 Ala Leu Ser Gln Met 490 Glu Asn Gly Ser Glu 505 Ala Pro Ile Glu Phe 520 Thr Arg Leu Asn Pro 535 Ile Thr Ser Ser Leu 555445 Gln Ala Ala Gly Ile 460 Gly Leu Asp Glu Ala 480 Trp Gln Leu Glu Ala 495 Glu Gly Leu Gly Asp 510 Pro Arg Asp Ile Thr 525 Asn Arg Arg Tyr Glu 540 Ile Arg Pro Glu Glu 560 Ser Arg 575 Gln Arg Glu Phe Glu Ser Glu Trp 640 Ile Gly 655 Ile LeuAsp Glu Glu Ser Ser Leu Asn Leu Arg 565 Ala Glu Val Pro Arg Asn Met Val Asn 580 585 Arg Ala Glu Pro Ala Ser Asn Gln Val 595 600 Asn Ile Arg Ile Val Ala Glu Ser Thr 610 615 Ser Ser Ser Gly Arg Arg Glu Arg Ser 625 630 Ser Pro Gly Tyr Ser Glu Gln Phe Pro 645 Gly Gly Ser Thr Thr Ser Ser Tyr Leu 660 665 Asn Trp Arg Arg Leu Ser Gln Thr Gly 675 680 <210>3 <211>1839 <212>DNA 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说明书Glu Glu Ser Ala Asp 285 Ser Arg Tyr Ile Cys 300 Leu Ser His Leu Arg 315 Lys Ala Trp Arg Gln 330 Met Arg Glu Leu Trp 345 Ile Val Ser Ser Phe 365 Gly Met Lys Tyr Phe 380 Asp Ile Leu Gly Trp25/45 页Ala Arg Asp 275 Arg Gly Ile 290 Pro Phe Thr 305 Trp Asp Ala Gly Tyr Pro Trp Met His 355 Phe Leu Leu 370 Leu Leu AspLys Asn Ser Glu Gly 280 Gly Leu Arg Glu Tyr 295 His Glu Gln Ser Leu 310 Asp Val Asp Lys Phe 325 Leu Val Asp Ala Gly 340 Asn Arg Ile Arg Val 360 Leu Pro Trp Lys Trp 375 Ala Asp Leu Glu CysLeu Phe Leu Phe Asn Phe Phe Phe Pro 320 Gly Arg Thr 335 Ala Thr Gly 350 Ala Val Lys Trp Asp Thr Gln Tyr Ile 400 Pro Gln Pro Gly Leu 480 Gly Ala Asp Lys Asp 560 Val Leu385 Ser Gly Ser Ile Pro 405 Ala Leu Gln Gly Ala 420 Trp Leu Pro Glu Leu 435 Trp Asp Ala Pro Leu 450 Thr Asn Tyr Ala Lys 465 Leu Ala Lys Ala Ile 485 Ala Ala Pro Asp Glu 500 Asn Thr Ile Lys Glu 515 Gln Gln Val Pro Ser 530 Pro Glu Glu Glu Glu 545 Glu Arg Glu Leu Phe 565 Phe Phe Val Ser Gln390 Asp Gly His Glu Leu 410 Lys Tyr Asp Pro Glu 425 Ala Arg Leu Pro Thr 440 Thr Val Leu Lys Ala 455 Pro Ile Val Asp Ile 470 Ser Arg Thr Arg Glu 490 Ile Val Ala Asp Ser 505 Pro Gly Leu Cys Pro 520 Ala Val Arg Tyr Asn 535 Glu Arg Asp Met Lys 550 Ser Thr Ala Glu Ser 570 Ser Cys Ser Leu Ala27395 Asp Arg Leu Asp Asn 415 Gly Glu Tyr Ile Arg 430 Glu Trp Ile His His 445 Ser Gly Val Glu Leu 460 Asp Thr Ala Arg Glu 475 Ala Gln Ile Met Ile 495 Phe Glu Ala Leu Gly 510 Ser Val Ser Ser Asn 525 Gly Ser Lys Arg Val 540 Lys Ser Arg Gly Phe 555 Ser Ser Ser Ser Ser 575 Ser Glu Gly Lys Asn101993889 A CN 101993893
说明书26/45 页580 585 590 Glu Gly Ile Gln Asp Ser Ser Asp Gln Ile Thr Thr Ser Leu Gly Lys 595 600 605 Asn Gly Cys Lys 610 <210>5 <211>3519 <212>DNA <213> 拟南芥 (Arabidopsis thaliana) <220> <221>CDS <222>(1)..(3519) <400>5 atg gtt tcc gga gtc ggg ggt agt ggc ggt ggc cgt ggc ggt ggc cgt Met Val Ser Gly Val Gly Gly Ser Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Arg 1 5 10 15 ggc gga gaa gaa gaa ccg tcg tca agt cac act cct aat aac cga aga Gly Gly Glu Glu Glu Pro Ser Ser Ser His Thr Pro Asn Asn Arg Arg 20 25 30 gga gga gaa caa gct caa tcg tcg gga acg aaa tct ctc aga cca aga Gly Gly Glu Gln Ala Gln Ser Ser Gly Thr Lys Ser Leu Arg Pro Arg 35 40 45 agc aac act gaa tca atg agc aaa gca att caa cag tac acc gtc gac Ser Asn Thr Glu Ser Met Ser Lys Ala Ile Gln Gln Tyr Thr Val Asp 50 55 60 gca aga ctc cac gcc gtt ttc gaa caa tcc ggc gaa tca ggg aaa tca Ala Arg Leu His Ala Val Phe Glu Gln Ser Gly Glu Ser Gly Lys Ser 65 70 75 80 ttc gac tac tca caa tca ctc aaa acg acg acg tac ggt tcc tct gta Phe Asp Tyr Ser Gln Ser Leu Lys 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Gly Asp Ala Val Cys Gly Met Ala Val Ala Tyr Ile 535 540 aga gac ttt ctt ttt tgg ttt cga tct cac act gcg aaa gaa Arg Asp Phe Leu Phe Trp Phe Arg Ser His Thr Ala Lys Glu30110411521200124812961344139214401488153615841632545 550 555 560 atc aaa tgg gga ggc gct aag cat cat ccg gag gat aaa gat gat ggg Ile Lys Trp Gly Gly Ala Lys His His Pro Glu Asp Lys Asp Asp Gly 565 570 575 caa cga atg cat cct cgt tcg tcc ttt cag gct ttt ctt gaa gtt gtt Gln Arg Met His Pro Arg Ser Ser Phe Gln Ala Phe Leu Glu Val Val 580 585 590 aag agc cgg agt cag cca tgg gaa act gcg gaa atg gat gcg att cac Lys Ser Arg Ser Gln Pro Trp Glu Thr Ala Glu Met Asp Ala Ile His 595 600 605 tcg ctc cag ctt att ctg aga gac tct ttt aaa gaa tct gag gcg gct Ser Leu Gln Leu Ile Leu Arg Asp Ser Phe Lys Glu Ser Glu Ala Ala 610 615 620 atg aac tct aaa gtt gtg gat ggt gtg gtt cag cca tgt agg gat atg Met Asn Ser Lys Val Val Asp Gly Val Val Gln Pro Cys Ara Asp Met 625 630 635 640 gcg ggg gaa cag ggg att gat gag tta ggt gca gtt gca aga gag atg Ala Gly Glu Gln Gly Ile Asp Glu Leu Gly Ala Val Ala Arg Glu Met 645 650 655 gtt agg ctc att gag act gca act gtt cct ata ttc gct gtg gat gcc Val Arg Leu Ile Glu Thr Ala Thr Val Pro Ile Phe Ala Val Asp Ala 660 665 670 gga ggc tgc atc aat gga tgg aac gct aag att gca gag ttg aca ggt Gly Gly Cys Ile Asn Gly Trp Asn Ala Lys Ile Ala Glu Leu Thr Gly 675 680 685 ctc tca gtt gaa gaa gct atg ggg aag tct ctg gtt tct gat tta ata Leu Ser Val Glu Glu Ala Met Gly Lys Ser Leu Val Ser Asp Leu Ile 690 695 700 tac aaa gag aat gaa gca act gtc aat aag ctt ctt tct cgt gct ttg Tyr Lys Glu Asn Glu Ala Thr Val Asn Lys Leu Leu Ser Arg Ala Leu 705 710 715 720 aga ggg gac gag gaa aag aat gtg gag gtt aag ctg aaa act ttc agc Arg Gly Asp Glu Glu Lys Asn Val Glu Val Lys Leu Lys Thr Phe Ser 725 730 735 ccc gaa cta caa ggg aaa gca gtt ttt gtg gtt gtg aat gct tgt tcc Pro Glu Leu Gln Gly Lys Ala Val Phe Val Val Val Asn Ala Cys Ser 740 745 750 agc aag gac tac ttg aac aac att gtc ggc gtt tgt ttt gtt gga caa Ser Lys Asp Tyr Leu Asn Asn Ile Val Gly Val Cys Phe Val Gly Gln31172817761824187219201968201620642112216022082256gac gtt Asp Val 770 gga gat Gly Asp 785 att ttt Ile Phe atg gaa Met Glu att gtc Ile Val gct tta Ala Leu 850 gat acg Asp Thr 865 gtt cag Val Gln gtt att Val Ile caa gct Gln Ala gca aaa Ala Lys 930 ggt atg Gly Met 945 gac cag Asp Gln755 760 765 act agt cag aaa atc gta atg gat aag ttc atc aac ata caa Thr Ser Gln Lys Ile Val Met Asp Lys Phe Ile Asn Ile Gln 775 780 tac aag gct att gta cat agc cca aac cct cta atc ccg cca Tyr Lys Ala Ile Val His Ser Pro Asn Pro Leu Ile Pro Pro 790 795 800 gct gct gac gag aac acg tgc tgc ctg gaa tgg aac atg gcg Ala Ala Asp Glu Asn Thr Cys Cys Leu Glu Trp Asn Met Ala 805 810 815 aag ctt acg ggt tgg tct cgc agt gaa gtg att ggg aaa atg Lys Leu Thr Gly Trp Ser Arg Ser Glu Val Ile Gly Lys Met 820 825 830 ggg gaa gtg ttt ggg agc tgt tgc atg cta aag ggt cct gat Gly Glu Val Phe Gly Ser Cys Cys Met Leu Lys Gly Pro Asp 835 840 845 acc aag ttc atg att gta ttg cat aat gcg att 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说明书117032/45 页1160 1165 <210>6 <211>1172 <212>PRT <213> 拟南芥 (Arabidopsis thaliana) <400>6 Met Val Ser Gly Val Gly Gly Ser Gly 1 5 Gly Gly Glu Glu Glu Pro Ser Ser Ser 20 25 Gly Gly Glu Gln Ala Gln Ser Ser Gly 35 40 Ser Asn Thr Glu Ser Met Ser Lys Ala 50 55 Ala Arg Leu His Ala Val Phe Glu Gln 65 70 Phe Asp Tyr Ser Gln Ser Leu Lys Thr 85 Pro Glu Gln Gln Ile Thr Ala Tyr Leu 100 105 Tyr Ile Gln Pro Phe Gly Cys Met Ile 115 120 Arg Ile Ile Gly Tyr Ser Glu Asn Ala 130 135 Pro Gln Ser Val Pro Thr Leu Glu Lys 145 150 Thr Asp Val Arg Ser Leu Phe Thr Ser 165 Arg Ala Phe Val Ala Arg Glu Ile Thr 180 185 His Ser Lys Asn Thr Gly Lys Pro Phe 195 200 Asp Val Gly Val Val Ile Asp Leu Glu 210 215 Ala Leu Ser Ile Ala Gly Ala Val Gln 225 230 Ala Ile Ser Gln Leu Gln Ala Leu Pro 245 Cys Asp Thr Val Val Glu Ser Val Arg34Gly Gly Arg Gly Gly 10 His Thr Pro Asn Asn 30 Thr Lys Ser Leu Arg 45 Ile Gln Gln Tyr Thr 60 Ser Gly Glu Ser Gly 75 Thr Thr Tyr Gly Ser 90 Ser Arg Ile Gln Arg 110 Ala Val Asp Glu Ser 125 Arg Glu Met Leu Gly 140 Pro Glu Ile Leu Ala 155 Ser Ser Ser Ile Leu 170 Leu Leu Asn Pro Val 190 Tyr Ala Ile Leu His 205 Pro Ala Arg Thr Glu 220 Ser Gln Lys Leu Ala 235 Gly Gly Asp Ile Lys 250 Asp Leu Thr Gly TyrGly Arg 15 Arg Arg Pro Arg Val Asp Lys Ser 80 Ser Val 95 Gly Gly Ser Phe Ile Met Met Gly 160 Leu Glu 175 Trp Ile Arg Ile Asp Pro Val Arg 240 Leu Leu 255 Asp Arg101993889 A CN 101993893
说明书33/45 页260 Val Met Val Tyr Lys Phe His 275 Glu Ser Lys Arg Asp Asp Leu 290 295 Ala Thr Asp Ile Pro Gln Ala 305 310 Val Arg Met Ile Val Asp Cys 325 Asp Asp Arg Leu Thr Gln Ser 340 Ala Pro His Gly Cys His Ser 355 Ala Ser Leu Ala Met Ala Val 370 375 Ser Asn Val Ala Ser Gly Arg 385 390 Val Cys His His Thr Ser Ser 405 Ala Cys Glu Phe Leu Met Gln 420 Leu Gln Leu Ala Leu Gln Met 435 Thr Leu Leu Cys Asp Met Leu 450 455 Thr Gln Ser Pro Ser Ile Met 465 470 Phe Leu Tyr His Gly Lys Tyr 485 Val Gln Ile Lys Asp Val Val 500 Ser Thr Gly Leu Ser Thr Asp 515 Ala Ala Ala Leu Gly Asp Ala 530 535 Thr Lys Arg Asp Phe Leu Phe 545 550 Ile Lys Trp Gly Gly Ala Lys 565265 Glu Asp Glu His Gly 280 Glu Pro Tyr Ile Gly 300 Ser Arg Phe Leu Phe 315 Asn Ala Thr Pro Val 330 Met Cys Leu Val Gly 345 Gln Tyr Met Ala Asn 360 Ile Ile Asn Gly Asn 380 Ser Ser Met Arg Leu 395 Arg Cys Ile Pro Phe 410 Ala Phe Gly Leu Gln 425 Ser Glu Lys Arg Val 440 Leu Arg Asp Ser Pro 460 Asp Leu Val Lys Cys 475 Tyr Pro Leu Gly Val 490 Glu Trp Leu Leu Ala 505 Ser Leu Gly Asp Ala 520 Val Cys Gly Met Ala 540 Trp Phe Arg Ser His 555 His His Pro Glu Asp 57035270 Glu Val Val Ala 285 Leu His Tyr Pro Lys Gln Asn Arg 320 Leu Val Val Gln 335 Ser Thr Leu Arg 350 Met Gly Ser Ile 365 Glu Asp Asp Gly Trp Gly Leu Val 400 Pro Leu Arg Tyr 415 Leu Asn Met Glu 430 Leu Arg Thr Gln 445 Ala Gly Ile Val Asp Gly Ala Ala 480 Ala Pro Ser Glu 495 Asn His Ala Asp 510 Gly Tyr Pro Gly 525 Val Ala Tyr Ile Thr Ala Lys Glu 560 Lys Asp Asp Gly 575101993889 A CN 101993893
说明书Gln Ala Phe Leu Glu 590 Ala Glu Met Asp Ala 605 Phe Lys Glu Ser Glu 620 Val Gln Pro Cys Arg 635 Gly Ala Val Ala Arg 650 Pro Ile Phe Ala Val 670 Lys Ile Ala Glu Leu 685 Ser Leu Val Ser Asp 700 Lys Leu Leu Ser Arg 715 Val Lys Leu Lys Thr 730 Val Val Val Asn Ala 750 Gly Val Cys Phe Val 765 Asp Lys Phe Ile Asn 780 Pro Asn Pro Leu Ile 795 Cys Leu Glu Trp Asn 810 Ser Glu Val Ile Gly 830 Cys Met Leu Lys Gly 845 His Asn Ala Ile Gly 860 Phe Asp Arg Asn Gly 875 Arg Val Ser Leu Glu34/45 页Gln Arg Met His 580 Lys Ser Arg Ser 595 Ser Leu Gln Leu 610 Met Asn Ser Lys 625 Ala Gly Glu Gln Val Arg Leu Ile 660 Gly Gly Cys Ile 675 Leu Ser Val Glu 690 Tyr Lys Glu Asn 705 Arg Gly Asp Glu Pro Glu Leu Gln 740 Ser Lys Asp Tyr 755 Asp Val Thr Ser 770 Gly Asp Tyr Lys 785 Ile Phe Ala Ala Met Glu Lys Leu 820 Ile Val Gly Glu 835 Ala Leu Thr Lys 850 Asp Thr Asp Lys 865 Val Gln Ala LeuPro Arg Ser Ser Phe 585 Gln Pro Trp Glu Thr 600 Ile Leu Arg Asp Ser 615 Val Val Asp Gly Val 630 Gly Ile Asp Glu Leu 645 Glu Thr Ala Thr Val 665 Asn Gly Trp Asn Ala 680 Glu Ala Met Gly Lys 695 Glu Ala Thr Val Asn 710 Glu Lys Asn Val Glu 725 Gly Lys Ala Val Phe 745 Leu Asn Asn Ile Val 760 Gln Lys Ile Val Met 775 Ala Ile Val His Ser 790 Asp Glu Asn Thr Cys 805 Thr Gly Trp Ser Arg 825 Val Phe Gly Ser Cys 840 Phe Met Ile Val Leu 855 Phe Pro Phe Pro Phe 870 Leu Thr Ala Asn Lys36Val Val Ile His Ala Ala Asp Met 640 Glu Met 655 Asp Ala Thr Gly Leu Ile Ala Leu 720 Phe Ser 735 Cys Ser Gly Gln Ile Gln Pro Pro 800 Met Ala 815 Lys Met Pro Asp Gly Gln Lys Phe 880 Gly Lys101993889 A CN 101993893
说明书890 Ile Pro Ser Pro Glu 910 Asp Thr Glu Cys Phe 925 Val Ile Lys Asn Pro 940 Glu Ala Thr Asp Leu 955 Val Ser Cys Glu Lys 970 Glu Ser Ile Glu Asp 990 Leu Gly Ser Val Ile 1005 Arg Asp Arg Gly Leu 1020 Lys Ser Ile Glu Val 1035 Leu Ala Glu Phe Leu 1050 Glu Trp Val Glu Ile 1065 Asp Gly Phe Ala Ala 1080 Gly Glu Gly Leu Pro 1095 Ser Arg Trp Thr Ser 1110 Lys Ile Leu Lys Leu 1125 Ser Glu Arg Ser Tyr 1140 Arg Lys Arg Pro Leu 1155 Leu Met Met Pro Tyr 117035/45 页885 Val Ile Gly Ala Phe Cys Phe Leu Gln 900 905 Gln Ala Leu Ala Val Gln Arg Arg Gln 915 920 Ala Lys Glu Leu Ala Tyr Ile Cys Gln 930 935 Gly Met Arg Phe Ala Asn Ser Leu Leu 945 950 Asp Gln Lys Gln Leu Leu Glu Thr Ser 965 Ser Arg Ile Val Gly Asp Met Asp Leu 980 985 Phe Val Leu Lys Arg Glu Glu Phe Phe 995 1000 Ile Val Ser Gln Ala Met Phe Leu Leu 1010 1015 Leu Ile Arg Asp Ile Pro Glu Glu Ile 1025 1030 Gly Asp Gln Ile Arg Ile Gln Gln Leu 1040 1045 Ser Ile Ile Arg Tyr Ala Pro Ser Gln 1055 1060 Leu Ser Gln Leu Ser Lys Gln Met Ala 1070 1075 Arg Thr Glu Phe Arg Met Ala Cys Pro 1085 1090 Glu Leu Val Arg Asp Met Phe His Ser 1100 1105 Glu Gly Leu Gly Leu Ser Val Cys Arg 1115 1120 Asn Gly Glu Val Gln Tyr Ile Arg Glu 1130 1135 Leu Ile Ile Leu Glu Leu Pro Val Pro 1145 1150 Thr Ala Ser Gly Ser Gly Asp Met Met 1160 1165 <210>7 <211>336937895 Leu Gln Thr Lys Leu Ser Asn Glu 960 Gln Ile 975 Gly Ser Asn Ala Gln Phe Leu His Ile Pro Pro Met Phe Ser101993889 A CN 101993893
说明书36/45 页<212>DNA <213> 拟南芥 (Arabidopsis thaliana) <220> <221>CDS <222>(1)..(3369) <400>7 atg tca ggc tct agg ccg act cag tcc tct gag ggc tca agg cga tca Met Ser Gly Ser Arg Pro Thr Gln Ser Ser Glu Gly Ser Arg Arg Ser 1 5 10 15 agg cac agc gct agg atc att gcg cag acc act gta gat gcg aaa ctc Arg His Ser Ala Arg Ile Ile Ala Gln Thr Thr Val Asp Ala Lys Leu 20 25 30 cat gct gat ttt gag gag tca ggc agc tcc ttt gat tac tca acc tca His Ala Asp Phe Glu Glu Ser Gly Ser Ser Phe Asp Tyr Ser Thr Ser 35 40 45 gtg cgt gtc act ggc ccg gtt gtg gag aat cag cca cca agg tct gac Val Arg Val Thr Gly Pro Val Val Glu Asn Gln Pro Pro Arg Ser Asp 50 55 60 aaa gtt acc acg act tat ctt cat cat ata cag aag gga aag ctg att Lys Val Thr Thr Thr Tyr Leu His His Ile Gln Lys Gly Lys Leu Ile 65 70 75 80 cag ccc ttc ggt tgt tta ctt gcc ttg gat gag aag acc ttc aaa gtt Gln Pro Phe Gly Cys Leu Leu Ala Leu Asp Glu Lys Thr Phe Lys Val 85 90 95 att gca tac agc gag aat gca tct gag ctg ttg aca atg gcc agt cat Ile Ala Tyr Ser Glu 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Leu Gln Ser Leu Pro Ser Gly Ser Met Glu Arg Leu Cys Asp 210 215 220 aca atg gtt caa gag gtt ttt gaa ctc acg ggg tat gac agg gtg atg Thr Met Val Gln Glu Val Phe Glu Leu Thr Gly Tyr Asp Arg Val Met 225 230 235 240 gct tat aag ttt cat gaa gat gat cac ggt gag gtt gtc tcc gag gtt Ala Tyr Lys Phe His Glu Asp Asp His Gly Glu Val Val Ser Glu Val 245 250 255 aca aaa cct ggg ctg gag cct tat ctt ggg ctg cat tat cct gcc acc Thr Lys Pro Gly Leu Glu Pro Tyr Leu Gly Leu His Tyr Pro Ala Thr 260 265 270 gac atc cct caa gca gcc cgt ttt ctg ttt atg aag aac aag gtc cgg Asp Ile Pro Gln Ala Ala Arg Phe Leu Phe Met Lys Asn Lys Val Arg 275 280 285 atg ata gtt gat tgc aat gca aaa cat gct agg gtg ctt caa gat gaa Met Ile Val Asp Cys Asn Ala Lys His Ala Arg Val Leu Gln Asp Glu 290 295 300 aag ctt tcc ttt gac ctt acc ttg tgt ggc tcc acc ctt aga gca ccg Lys Leu Ser Phe Asp Leu Thr Leu Cys Gly Ser Thr Leu Arg Ala Pro 305 310 315 320 cac agc tgc cat ttg cag tac atg gcc aac atg gat tca att gca tct His Ser Cys His Leu 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[1219] 说明书Glu Lys Thr Phe Lys 95 Leu Thr Met Ala Ser 110 Leu Gly Ile Gly Thr 125 Ser Ala Leu Gln Lys 140 Pro Ile Leu Val His 155 Ile His Arg Val Thr 175 Pro Tyr Glu Val Pro 190 Leu Ala Ala Lys Ala 205 Met Glu Arg Leu Cys 220 Gly Tyr Asp Arg Val 235 Glu Val Val Ser Glu 255 Leu His Tyr Pro Ala 270 Met Lys Asn Lys Val 285 Arg Val Leu Gln Asp 300 Ser Thr Leu Arg Ala 315 Met Asp Ser Ile Ala 335 Asp Gly Glu Gly Asp 350 Lys Arg Leu Trp Gly 365 Val Pro Phe Pro Leu 380 Ala Ile His Val Asn42/45 页Gln Pro Phe Gly Cys 85 Ile Ala Tyr Ser Glu 100 Ala Val Pro Ser Val 115 Ile Arg Ser Leu Phe 130 Leu Gly Phe Gly Asp 145 Arg Thr Ser Ala Lys 165 Ser Ile Ile Ile Asp 180 Thr Ala Ala Gly Ala 195 Thr Arg Leu Gln Ser 210 Thr Met Val Gln Glu 225 Ala Tyr Lys Phe His 245 Thr Lys Pro Gly Leu 260 Asp Ile Pro Gln Ala 275 Met Ile Val Asp Cys 290 Lys Leu Ser Phe Asp 305 His Ser Cys His Leu 325 Leu Val Met Ala Val 340 Pro Asp Ala Thr Thr 355 Val Val Cys His Asn 370 Tyr Ala Cys Glu PheLeu Leu Ala Leu Asp 90 Asn Ala Ser Glu Leu 105 Gly Glu His Pro Val 120 Thr Ala Pro Ser Ala 135 Val Ser Leu Leu Asn 150 Pro Phe Tyr Ala Ile 170 Phe Glu Pro Val Lys 185 Leu Gln Ser Tyr Lys 200 Leu Pro Ser Gly Ser 215 Val Phe Glu Leu Thr 230 Glu Asp Asp His Gly 250 Glu Pro Tyr Leu Gly 265 Ala Arg Phe Leu Phe 280 Asn Ala Lys His Ala 295 Leu Thr Leu Cys Gly 310 Gln Tyr Met Ala Asn 330 Val Val Asn Glu Glu 345 Gln Pro Gln Lys Arg 360 Thr Thr Pro Arg Phe 375 Leu Ala Gln Val Phe44Val His Asp Ala Cys 160 Gly Met Ile Asp Met 240 Val Thr Arg Glu Pro 320 Ser Ala Leu Arg Lys101993889 A CN 101993893
[1258] 说明书43/45 页385 Glu Val Glu Leu Asp 405 Gln Thr Leu Leu Cys 420 Val Ser Gln Ser Pro 435 Ala Leu Leu Tyr Lys 450 Glu Phe His Leu Gln 465 Asp Ser Thr Gly Leu 485 Arg Ala Leu Ser Leu 500 Ile Ser Ser Lys Asp 515 Glu Val Arg Trp Gly 530 Ala Arg Arg Met His 545 Val Lys Thr Arg Ser 565 His Ser Leu Gln Leu 580 Thr Asp Val Asn Thr 595 Ile Asp Gly Ile Gln 610 Leu Ile Glu Thr Ala 625 Leu Val Asn Gly Trp 645 Val Asp Glu Ala Ile 660 Ser Val Glu Ile Val 675 Glu Glu Gln Asn Val 690390 Asn Gln Met Val Glu 410 Asp Met Leu Met Arg 425 Asn Ile Met Asp Leu 440 Asp Lys Ile Trp Lys 455 Glu Ile Ala Ser Trp 470 Ser Thr Asp Ser Leu 490 Gly Asp Ser Val Cys 505 Met Ile Phe Trp Phe 520 Gly Ala Lys His Asp 535 Pro Arg Ser Ser Phe 550 Leu Pro Trp Lys Asp 570 Ile Leu Arg Asn Ala 585 Lys Val Ile Tyr Ser 600 Glu Leu Glu Ala Val 615 Thr Val Pro Ile Leu 630 Asn Thr Lys Ile Ala 650 Gly Lys His Phe Leu 665 Lys Arg Met Leu Glu 680 Gln Phe Glu Ile Lys 69545395 400 Lys Asn Ile Leu Arg Thr 415 Asp Ala Pro Leu Gly Ile 430 ValLys Cys Asp Gly Ala 445 Leu Gly Thr Thr Pro Ser 460 Leu Cys Glu Tyr His Met 475 480 His Asp Ala Gly Phe Pro 495 Gly Met Ala Ala Val Arg 510 Arg Ser His Thr Ala Gly 525 Pro Asp Asp Arg Asp Asp 540 Lys Ala Phe Leu Glu Val 555 560 Tyr Glu Met Asp Ala Ile 575 Phe Lys Asp Ser Glu Thr 590 Lys Leu Asn Asp Leu Lys 605 Thr Ser Glu Met Val Arg 620 Ala Val Asp Ser Asp Gly 635 640 Glu Leu Thr Gly Leu Ser 655 Thr Leu Val Glu Asp Ser 670 Asn Ala Leu Glu Gly Thr 685 Thr His Leu Ser Arg Ala Asp Ala Gly Pro Ile Ser Leu Val Val Asn Ala Cys Ala Ser Arg Asp 705 710 715 720 Leu His Glu Asn Val Val Gly ValCys Phe Val Ala His Asp Leu Thr 725 730 735 Gly Gln Lys Thr Val Met Asp Lys Phe Thr Arg Ile Glu Gly Asp Tyr 740 745 750 Lys Ala Ile Ile Gln Asn Pro Asn Pro Leu Ile Pro Pro Ile Phe Gly 755 760 765 Thr Asp Glu Phe Gly Trp Cys Thr Glu Trp Asn Pro Ala Met Ser Lys 770 775 780 Leu Thr Gly Leu Lys Arg Glu Glu Val Ile Asp Lys Met Leu Leu Gly 785 790 795 800 Glu ValPhe Gly Thr Gln Lys Ser Cys Cys Arg Leu Lys Asn Gln Glu 805 810 815 Ala Phe Val Asn Leu Gly Ile Val Leu Asn Asn Ala Val Thr Ser Gln 820 825 830 Asp Pro Glu Lys Val Ser Phe Ala Phe Phe Thr Arg Gly Gly Lys Tyr 835 840 845 Val Glu Cys Leu Leu Cys Val Ser Lys Lys Leu Asp Arg Glu Gly Val 850 855 860 Val Thr Gly Val Phe Cys Phe Leu Gln Leu Ala Ser His Glu Leu Gln 865 870 875 880 Gln Ala Leu His Val Gln Arg Leu Ala Glu Arg Thr Ala Val Lys Arg 885 890 895 Leu Lys Ala Leu Ala Tyr Ile Lys Arg Gln Ile Arg Asn Pro Leu Ser 900 905 910 Gly Ile Met Phe Thr Arg Lys Met Ile Glu Gly Thr Glu Leu Gly Pro 915 920 925 Glu Gln Arg Arg Ile Leu Gln Thr Ser Ala Leu Cys Gln Lys Gln Leu 930 935 940 Ser Lys Ile Leu Asp Asp Ser Asp Leu Glu Ser Ile Ile Glu Gly Cys 945 950 955 960 Leu Asp Leu Glu Met Lys Glu Phe Thr Leu Asn Glu Val Leu Thr Ala 965 970 975 Ser Thr Ser Gln Val Met Met Lys Ser Asn Gly Lys Ser Val Arg Ile 980 985 990 Thr Asn Glu Thr Gly Glu Glu Val Met Ser Asp Thr Leu Tyr Gly Asp 995 1000 1005 Ser Ile Arg Leu Gln Gln Val Leu Ala Asp Phe Met Leu Met Ala46101993889 A CN 101993893
[1336] 说Thr Pro Ser Asp Gln Leu Leu Thr His Met Phe Gly Met Val Ser Tyr Leu Arg Leu Ala Ala明书Gln Leu Thr Ser Val His Ala Gly Ile Glu Asp Val Leu Val Lys Gly Lys Ser Lys 1020 Val Ser 1035 Leu Ala 1050 Pro Glu 1065 Ser Glu 1080 Leu Met 1095 Ser Phe 1110 Ala Ser Asn Leu Phe Leu Glu Gly Asn Gly Ile Ile45/45 页Val Leu Glu Leu Leu Asp Thr1010 Asn Phe 1025 Arg Lys 1040 Ile Arg 1055 Asn Gln 1070 Ser Leu 1085 Val Gln 1100 Ala Glu 11151015 Gly Gly 1030 Gly Arg 1045 Thr Gly 1060 Thr Glu 1075 Arg Lys 1090 Gln Ala 1105 Ala Asn 1120