TGFΒ1受体阻断剂在制备预防包虫病复发的药物中应用.pdf

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410571911.X (22)申请日 2014.10.23 A61K 31/517(2006.01) A61K 31/4439(2006.01) A61K 45/00(2006.01) A61P 33/10(2006.01) (71)申请人 陈雪玲 地址 832002 新疆维吾尔自治区石河子市北 二路 32 小区石河子大学医学院病原生 物学与免疫学教研室 (72)发明人 陈雪玲 吴向未 印双红 (74)专利代理机构 北京方圆嘉禾知识产权代理 有限公司 11385 代理人 董芙蓉 (54) 发明名称 TGF-1 受体阻断剂在制备预防。

2、包虫病复发 的药物中应用 (57) 摘要 本发明公开了 TGF-1 受体阻断剂在制备预 防包虫病复发的药物中应用。 申请人的研究显示， 细粒棘球蚴早期感染小鼠在应用 TGF-1 受体阻 断剂后下游分子 Smad2/3 磷酸化蛋白表达下降， NK 细胞活性受体 NKG2D 表达增加， NK 细胞对靶 细胞的裂解率恢复， NK 细胞的活性与其活性受体 NKG2D 的相关性分析的表达呈正相关， CD4+/CD8+T 细胞比值升高， CD4+CD25+T 细胞数量减少， 因此利 用 TGF-1 受体阻断剂在临床上可有效用于预防 包虫病的复发。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权。

3、局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 附图3页 (10)申请公布号 CN 104490886 A (43)申请公布日 2015.04.08 CN 104490886 A 1/1 页 2 1.TGF-1 受体阻断剂在制备预防包虫病复发的药物中应用。 2.根据权利要求 1 的应用， 其特征在于所述 TGF-1 受体阻断剂为 SB-525334。 权 利 要 求 书 CN 104490886 A 2 1/8 页 3 TGF-1 受体阻断剂在制备预防包虫病复发的药物中应用 技术领域 0001 本发明涉及一种用于用于预防包虫病复发的方法， 具体的是涉及 TGF-1 受体阻 断剂在制备预防。

4、包虫病复发的药物中应用， 属于生物医药领域。 背景技术 0002 包虫病， 学名棘球蚴病 (Ehcniocococsis)， 是细粒棘球蚴绦虫幼虫寄生于人体 及某些动物体内所致的一种严重的人畜共患性寄生虫病， 引起人体包虫病的棘球蚴绦虫 主要有细粒棘球绦虫 (Echinococcus granulosus， E.g) 和多房棘球绦虫 (Echinococcus multilocularis， E.m) 两种。囊性包虫病是由细粒棘球绦虫的幼虫寄生在人体肝、 肺等脏 器引起的一种严重危害人类健康的寄生虫病， 广泛分布于世界各地， 因此包虫病己成为全 球性的影响公共健康的问题。 0003 针对包虫病。

5、的治疗， 本领域已发展出了多种治疗方案， 主要是以外科手术为主， 内 科药物化疗为辅的方法。但此方法有许多弊端， 如手术治疗对人体损伤较大， 且易复发 ； 内 科药物如甲苯咪唑或阿苯哒唑等药物进行化疗， 可产生很多的毒副作用， 有的患者不能耐 受， 或产生耐药性。 然而， 包虫病与其他寄生虫病一样， 是一个慢性感染过程， 其对宿主的作 用也是慢性而持久的过程， 两者之间的相互作用及其致病的免疫机制十分复杂， 加之此病 发病隐匿， 多数患者都是因包虫病的并发症而来医院就诊。 0004 综合目前的诊断和治疗现状来看， 如何解决包虫病的复发问题已经是本领域亟待 解决的课题之一。 发明内容 0005 。

6、申请人深入研究了包虫病发病的生物学机理以及发病过程中人体免疫系统的免 疫机制， 发现人或动物体在感染细粒棘球蚴后， 包虫本身和其代谢产物可引起宿主体内一 系列的细胞免疫和体液免疫的改变， 从而通过改变宿主的细胞因子产生数量和 / 或种类来 逃避宿主的免疫杀伤作用， 因此如果能够有效阻止包虫虫体的免疫逃逸， 将能够有效防止 包虫病的复发。 0006 具体地说， 本发明是通过如下技术方案实现的 ： 0007 TGF-1 受体阻断剂在制备预防包虫病复发的药物中应用。 0008 具体地说， 上述的 TGF-1 受体阻断剂用来阻断 TGF- 的信号传导途径， 包括 SB-431542、 SB-50512。

7、4 和 SB-525334 等， 优选为 SB-525334。 0009 申请人进行的实验显示， 细粒棘球蚴早期感染小鼠在应用 TGF-1 受体阻断剂后 下游分子 Smad2/3 磷酸化蛋白表达下降， NK 细胞活性受体 NKG2D 表达增加， NK 细胞对靶细 胞的裂解率恢复， NK 细胞的活性与其活性受体 NKG2D 的相关性分析的表达呈正相关， CD4+/ CD8+T 细胞比值升高， CD4+CD25+T 细胞数量减少， 因此利用 TGF-1 受体阻断剂在临床上可 有效用于预防包虫病的复发。 说 明 书 CN 104490886 A 3 2/8 页 4 附图说明 0010 图 1 为蛋白。

8、质印迹法检测 SB-525334 对 E.g 早期期感染小鼠 Smad2， p Smad2 和 -actin 蛋白水平的表达的影响， A 为电泳结果， B、 C 为吸光度数据 ； 其中， PSC ： 原头节 ； SB ： TGF-1 受体阻断剂 (SB-525334)。 0011 图 2 为蛋白质印迹法检测 SB-525334 对 E.g 早期期感染小鼠 Smad3， p Smad3 和 -actin 蛋白水平的表达的影响， A 为电泳结果， B、 C 为吸光度数据 ； 其中， PSC ： 原头节 ； SB ： TGF-1 受体阻断剂 (SB-525334) 0012 图 3 为流式细胞术检测。

9、 SB-525334 对 E.g 早期感染 BALB/c 小鼠 NK 细胞的影响， 其中， A 为流式细胞术检测 NK 细胞活性受体 NKG2D 的结果 ； B 为流式检测各组 NKG2D 结果 统计分析， PSC+SB 组的表达显著高于其它组 ； C 为 LDH 法检测各组小鼠 NK 细胞杀伤活性的 统计分析， PSC+SB 组小鼠 NK 细胞杀伤活性明显高于其它组 ； D 为小鼠 NK 细胞杀伤活性与 其活性受体 NKG2D 的相关性分析， R2 0.751 ； 其中， PSC ： 原头节 ； SB ： TGF-1 受体阻断剂 (SB-525334) ； PSC+SB 组分别与 PSC、 。

10、PBS+SB、 PBS 组比较 * ： P 0.05， * ： P 0.001。 0013 图 4 为 FCM 检测 SB-525334 对 E.g 早期感染 BALB/c 小鼠 T 细胞亚群的影响， A ： 流 式细胞仪检测 E.g 早期感染 BALB/c 小鼠 CD4+/CD8+T 细胞的 1 次流式结果 ； B ： 流式检测各 组CD4+T细胞比率结果统计分析图， PSC+SB组均低于于其它组 ； C ： 流式检测各组CD8+T细胞 比率结果统计分析图， PSC+SB 组均高于其它组 ； D ： 各组 CD4+/CD8+T 细胞比值结果统计分析 图， PSC+SB 组显著低于其它组 ； 。

11、其中， PSC ： 原头节 ； SB ： TGF-1 受体阻断剂 (SB-525334) ； PSC+SB 组分别与 PSC、 PBS+SB、 PBS 组比较 * ： P 0.05， * ： P 0.001。 0014 图 5 为 FCM 检测 SB-525334 对 E.g 早期感染 BALB/c 小鼠 CD4+CD25+T 细胞数量 的影响， A ： 流式细胞仪检测 E.g 早期感染 BALB/c 小鼠 CD4+CD25+T 细胞的流式结果 ； B ： CD4+CD25+T 细胞流式结果统计分析， PSC+SB 组 CD4+/CD8+T 细胞数量显著低于 PSC 组 ； PSC ： 原头节。

12、 ； SB ： TGF-1 受体阻断剂 (SB-525334) ； PSC+SB 组分别与 PSC、 PBS+SB、 PBS 组比较 * ： P 0.05， * ： P 0.001。 具体实施方式 0015 为了说明本发明受体阻断抑制剂的效果， 进行了如下实验。 0016 1.1 细粒棘球蚴原头节的制备 0017 从感染细粒棘球蚴病的羊肝上， 无菌抽取无钙化、 无感染、 全整的单囊型细粒棘球 蚴包囊内容物置于无菌离心管内， 原头节 (Protoscole， PSC) 自然沉淀， 再用含有 100IU/ml 青霉素和链霉素双抗的无菌 PBS(pH 7.3) 中漂洗 2-3 次， 除去育囊碎片使其。

13、自然沉淀， 0.5伊红染色 5min， 在显微镜下鉴定具有活性的虫体数 ( 90 )， 用含双抗的无菌 PBS 稀释制成含有原头节 10000 个 /ml 的原头节悬液， 备用。 0018 1.2 建立细粒棘球蚴感染小鼠动物模型， 将 16 只健康 BALB/c 小鼠， 随机分 4 组 ： 0019 SB+PSC ： 腹腔接种浓度为 10000 个 /ml 原头节， 加入 100IU/ml 青霉素和 100IU/ ml 链霉素 0.2ml/ 只 ； 从接种前一天开始， 到接种的第 9 天， 每天灌胃 TGF-1 受体阻断剂 (SB-525334)， 浓度为 200mg/L、 灌胃量 10mg/。

14、Kg。 0020 SB+PBS ： 腹腔接种 PBS 加入 100IU/ml 青霉素和 100IU/ml 链霉素 0.2ml/ 只 ； 从接 种前一天开始， 到接种的第 9 天， 每天灌胃 SB-525334， 浓度为 200mg/L、 灌胃量 10mg/Kg。 说 明 书 CN 104490886 A 4 3/8 页 5 0021 PBS ： 腹腔接种 PBS 加入 100IU/ml 青霉素和 100IU/ml 链霉素 0.2ml/ 只 ； 0022 PSC ： 腹腔接种浓度 10000 个 /ml 原头节， 加入 100IU/ml 青霉素和 100IU/ml 链霉 素 0.2ml/ 只 ；。

15、 0023 上述各实验组均在 9 天的时候颈椎脱臼法处死小鼠， 无菌摘取脾脏， 制备脾细胞 悬液。 0024 1.3 流式细胞染色及检测 0025 首先按照试剂说明书， 将荧光稀释 10 倍， DX-5、 NKG2D 原液浓度为 0.5mg/ml， 吸取 5ul 到 EP 管中， 加入 95ul PBS， 配制成浓度为 25ug/ml 的抗体工作液。然后利用流式细胞 检测 NKG2D、 DX-5( 或 CD4+CD25+T) ： 0026 (1) 将细胞用 PBS 调至 1107个 /ml。 0027 (2) 取 4 个流式管， 分别标上空白管、 NKG2D、 DX-5 和 NKG2D&DX-。

16、5( 或空白， CD4、 CD25 和 CD4&CD25) 等标记。 0028 (3)分别向各管中加入50l浓度为1107/ml的脾细胞， 再向个管中加入相应的 荧光抗体， 其中空白管不加任何荧光抗体。 0029 (4) 室温避光孵育 30min， 加入约 1ml PBS 洗涤， 1000 转 / 分钟离心 5 分钟。以上 各组共培养后的细胞悬液收集起来， 1000rpm 离心 5min。 0030 (5) 弃上清液， 加入 300l PBS， 混匀。 0031 (6) 上机检测。读取结果。 0032 1.4 流式细胞检测细粒棘球蚴早期感染小鼠 T 亚群步骤如下所示 ： 0033 (1) 将细。

17、胞用 PBS 调至 1107个 /ml。 0034 (2) 取 5 个流式管， 分别标上空白管、 CD3、 CD4、 CD8 和 CD3&CD4&CD8 等标记。 0035 (3)分别向各管中加入50l浓度为1107/ml的脾细胞， 再向个管中加入相应的 荧光抗体， 其中空白管不加任何荧光抗体。 0036 (4) 室温避光孵育 30min， 加入约 1 毫升 PBS 洗涤， 1000 转 / 分钟离心 5min。以上 各组共培养后的细胞悬液收集起来， 1000rpm 离心 5min， 然后弃上清液， 加入 300l PBS， 混匀。进行上机检测并读取结果。 0037 1.5ELISA 法检测细。

18、粒棘球蚴早期感染小鼠外周血中 TGF-1 含量外周血中 TGF-1 含量用 ELSIA 试剂盒检测， 按照试剂盒说明书进行操作并设立复孔， 建立标准曲线 法并进行计算。具体操作步骤如下 ： 0038 (1) 标本激活 0039 将 320l 样本稀释液加入到 1 只 1.5ml 的 PE 管中， 再加入 40l 样本血清。加 入 20l 1N HCl， 盖紧， 上下颠倒混匀。4放置 60 分钟。加入 20l 1N NaOH， 盖紧盖子， 上下颠倒混匀。计算结果时乘以稀释的倍数 10。 0040 (2) 稀释标准品 ： 取 7 个干净的 1.5ml EP 管并编号 ： 1-7， 都加入 0.5m。

19、l 试剂缓冲 液， 取 0.5ml 标准品加入 1 号 EP 管中， 盖好盖子， 颠倒几次混匀 ； 从 1 号管中吸取 0.5ml 标 准品， 并加入到2号EP管中， 混匀后再吸取0.5ml标准品至3号管中， 后面依次向下一EP管 中转移 0.5ml 标准液直至 7 号 EP 管， 停止。浓度依次为 2000pg/ml、 1000pg/ml、 500pg/ml、 250pg/ml、 125pg/ml、 62.5pg/ml、 31.25pg/ml ； 0041 (3) 留空白对照孔 ； 说 明 书 CN 104490886 A 5 4/8 页 6 0042 (4)取100l待测样和100l各浓度。

20、的标准品加入到待测样孔中(各待 测样均 设有复孔 ) ； 贴上封板朔纸， 室温孵育 90min ； 0043 (5) 提前 30min 制备生物素化抗体工作液 ； 0044 (7) 洗板 5 次， 每次 5min ； 0045 (8) 除空白孔外， 每孔均加入生物素抗体工作液 100l ； 贴好封板朔纸， 并室温孵 育 60min ； 0046 (9) 提前半小时准备酶标结合物工作液 ； 避光室温保存 ； 0047 (10) 洗板 5 次， 每次 5min ； 0048 (11) 除空白孔外， 每孔均加入酶标结合物工作液 100l ； 贴好板朔纸封住， 并室 温孵育半小时 ； 洗板 5 次， 。

21、每次 5min ； 0049 (12) 加入底物显色液 ： 向所有反应孔中加入 100l 的 TMB 底物显色溶液， 37， 10 20min ； 0050 (13) 向各反应孔中加入 100ul 终止液， 终止反应。 0051 (14)读取结果 ： 用ELISA检测仪检测(在半小时之内)， 于450nm处， 测各孔OD值 ； 绘制标准曲线并建立方程式。并通过标准曲线方程式计算出出待测样本的浓度。 0052 1.6 实时荧光定量 PCR 检测细粒棘球蚴早期感染小鼠脾细胞 Foxp3 基因和 TGF- 基因的表达 0053 利用 SYBR Green 法检测 Foxp3 基因和 TGF- 基因的。

22、表达， 操作步骤按照说明 书 ： 实时荧光定量反应体系 ： cDNA 4l， SYBR GreenI 10l， 上游引物 0.5l， 下游引物 0.5l， 双蒸水 5l ； 具体反应条件 ： 预变性 95 5min ； 变性 95、 15s ； Foxp3、 TGF- 退 火 60、 30s， -Actin 退火 56、 30s， 延伸 72、 30s ； 共 40 个循环。相对定量计算拟采用 2-Ct， Ct Ct 待测基因 -Ct 内参基因。 0054 1.7 用 LDH 酶法检测细粒棘球蚴早期感染小鼠 NK 细胞活性的影响 0055 (1) 试剂 ： 1 NP-40、 LDH 底物溶液、。

23、 1mol/L 柠檬酸终止液。 0056 (2)靶细胞的预处理(Yac-1细胞) ： Yac-1细胞(小鼠NK细胞的靶细胞， 其细胞表 面无 MHC-I 类分子表达 )， 实验前 24h 将靶细胞进行换液。用前计数并离心 1000rmp、 5min， 用 1640 培养液调整细胞浓度为 1105个 /ml。 0057 (3) 效应细胞的制备 ： 将细粒棘球蚴早期感染小鼠脾细胞用 PBS 洗涤 3 次， 再用完 全 RPMI-1640 培养液重悬， 调整细胞浓度 ： 1107个 /ml。 0058 (4) 效 - 靶细胞作用 ( 共培养 ) ： (E/T 100 1) ： 分别取靶细胞和效应细胞。

24、各 0.1ml(ET1001)加入96孔细胞培养板中， 设3复孔， 并设靶细胞最大释放组(0.1ml 靶细胞+0.1ml1NP40液)， 和自然释放组(0.1ml靶细胞+0.1ml 10FCSRPMI-1640培养 液 )1000r/min， 低速离心 2 分钟。置 37、 5 CO2孵育 2h。1000r/min， 离心 5 分钟。 0059 (5) 酶促反应 ： 取出 96 孔培养板， 分别取 0.1ml 各孔上清夜， 移入空白孔中， 置 37预温 10min， 分别每孔加入底物溶液 0.1ml， 室温避光反应 10-15min。每孔加入柠檬酸 1mol/L 30l 终止液， 终止酶促反应。

25、。 0060 (6) 读取 OD 值 ： 用酶联检测仪在 570nm 波长处读取各 OD 值。 0061 (7) 结果计算 ： 根据下列公式计算 NK 细胞活性 0062 说 明 书 CN 104490886 A 6 5/8 页 7 0063 1.8 用 westernblot 检测 Smad2/3 的表达 0064 首先提取总蛋白 ： 取 1ml 浓度为 1107/ml 的脾细胞置于 Ep 管中， 3000g 离 心 5 分钟， 去上清， 加入 150l 裂解液、 10l PMSF(100mM)、 5l Na3VO4(200mM)、 2l NaF(0.5M)、 150l phosSTOP p。

26、hosphatase inhibitor(Roche)， 细胞悬浮混匀， 冰上放置 20分钟， 使其充分裂解， 4， 12000g离心20分钟， 取上清， 即为蛋白质溶液-80保存备用。 0065 然后利用 BCA 法进行蛋白定量 ： 将 Sofutin A 摇匀， 根据样品数量， 按照 (50 1) 的比率配制适量 BCA 工作液， 即 50 体积 SolutionA 加 1 体积 Solutin B， 每孔需加入 200ul 工作液， 配好后混匀。完全溶解蛋白标准品 (5mg/ml BSA)， 取 10l 加入至 100l 工作液 中使其终浓度为 0.5mg/ml。稀释液同蛋白稀释液相同。。

27、也可用 PBS 或生理盐水稀释标准 品。 0066 将稀释后的标准品按0、 l、 2、 4、 8、 12、 16、 20l分别加到12孔板条中， 用标准品稀 释液将各孔补足到 20ul。加入 2l 样品到 12 孔板条中， 用标准品稀释液补足到加 20ul。 向各孔加入 200l BCA 工作液， 吹打混匀， 37放置 30 分钟。用酶标仪检测 A562nm 波长 的吸光度。根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度， 再将不同的蛋白浓度调至相同浓度。 0067 最后 SDS-PAGE 蛋白检测 Smad2/3 的表达 ： 采用 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法 ( 采用 12的分离胶、 5的浓缩胶 。

28、) 进行电泳， 电泳结束后转膜并封闭。最后加一抗 ( 加 入2ml TBST和2l的兔抗p-Smad2/3或Smad2/3单克隆抗 体作为一抗， 4过夜孵育。 倒 出含一抗的 TBST 液， 用 TBST 5ml 清洗 3 次， 每次 5 分钟 )、 加二抗 ( 加入 2ml TBST 和 1l 山羊抗兔 IgG-HRP 二抗， 1 小时 37作用。弃含二抗的 TBST 液体， 用 TBST 5ml 清洗 3 次， 每次 5 分钟 )， 0068 加入现配的 1ml ECL 显色试剂， 避光显色约 1min， 照相。 0069 实验结果综述如下 ： 0070 2.1SB-515334 对细粒棘。

29、球蚴早期感染小鼠的蛋白水平 Smad2/3 的影响 0071 2.1.1SB-525334 调控细粒棘球蚴早期感染小鼠的 Smad2 蛋白表达 0072 用 Western Bolting 检测各组小鼠脾细胞中 Smad2 蛋白水平的表达 ( 图 1)， 从图 中可见Smad2在棘球蚴感染组和PBS组小鼠脾细胞中表达的量较低， 在棘球蚴加入TGF-1 受体阻断剂组和PBS+TGF-1受体阻断剂组小鼠的Smad2蛋白的表达明显高于棘球蚴组和 正常对照组。 而磷酸化的Smad2(pSmad2)在棘球蚴组表达较最高， PBS组次之， 而PSC+SB和 PBS+SB 的表达很低。 0073 2.1.2。

30、SB-525334 调控细粒棘球蚴早期感染小鼠的 Smad3 蛋白表达 0074 用 Western Bolting 检测各组小鼠脾细胞中 Smad3 蛋白水平的表达 ( 图 2)， 从图中可见 PSC+SB 和 PBS+SB 组中 Smad3 的表达较高， 而 PSC 和 PBS 较低 ； 磷酸化的 Smad3(pSmad3) 的表达与为磷酸化的相反， 在 PSC 和 PBS 组较高， 而在阻断剂组表达明显下 降。即可推测棘球蚴感染可活化 TGF- 的信号通路， 从而发挥着对宿主免疫应答的抑制作 用。 0075 2.2SB-525334 调控细粒棘球蚴早期感染小鼠的 NK 细胞的功能 说 明。

31、 书 CN 104490886 A 7 6/8 页 8 0076 2.2.1SB-525334 调控细粒棘球蚴早期感染小鼠的 NK 细胞活性受体 NKG2D 的表达 0077 流式细胞术 (FCM) 检测药物调控细粒棘球蚴早期感染小鼠 TGF-1 信号活性第 9 天时， 小鼠NK细胞表面激活受体NKG2D的表达(表1， 图3)。 小鼠NK细胞的活性受体NKG2D 的表达量， 在细粒棘球蚴感染小鼠 (P 组 ) 最低 (3.930.62 )， 而在接种细粒棘球蚴并给 予 TGF-1 受体阻断剂处理的小鼠 (PSC+SB 组 ) 的表达最高 (12.151.27)， PBS 加 SB 组 小鼠 (。

32、PBS+SB 组 ) 为 ： 9.050.87， 正常对照组小鼠 (PBS 组 ) 为 ： 5.130.64。经统 计学分析得出 PSC+SB 组小鼠 NK 细胞的活性受体 NKG2D 的表达量显著高于 PSC 组及其它组 (P 0.001)， 即药物调控体内 TGF- 信号活性诱导宿主 NK 细胞 NKG2D 的恢复。 0078 2.2.2SB-525334 调控细粒棘球蚴早期感染小鼠的 NK 细胞对靶细胞的裂解率用乳 酸脱氢酶法 (LDH) 检测 NK 细胞对靶细胞 Yac-1 细胞的裂解率， 即 NK 细胞杀伤活性 ： 0079 从表 1 可见小鼠 NK 细胞对靶细胞的裂解率， 在 PS。

33、C 组最低 (10.221.53 )， 而 在 TGF-1 受体被特异性阻断后 (PSC+SB 组 ) 最高 (18.681.65 )， PBS 加 SB 组小鼠 (PBS+SB 组 ) 和正常对照组小鼠 (PBS 组 ) 鉴于之间为 ： 13.681.45和 10.521.55。 经统计分析 PSC+SB 组小鼠 NK 细胞杀伤活性分别与其它组比较， 差异均有统计学意义 (P 0.05)， 其中与 PSC 组和 PBS 组比较的 P 0.001。结果说明在 TGF-1 受体被特异性阻 断后不但可以消除原头节对小鼠 NK 细胞杀伤活性的抑制作用， 还可以激活 NK 细胞的杀活 性 (NK 杀伤。

34、活性大于 PSC 组和 PBS 组 )。 0080 2.2.3SB-525334 调控细粒棘球蚴早期感染小鼠的 NK 细胞的活性及其活性受体 NKG2D 的相关性分析 0081 对各组小鼠NK细胞的活性及其活性受体NKG2D的表达结果进行相关性分析， 结果 显示， 各组小鼠 NK 细胞的杀伤活性与其活性受体 NKG2D 的表达呈正相关， 相关系数 R2 0.751( 图 3-D)。 0082 表 1 SB-525334 调控 E.g 早期感染 BALB/c 小鼠的 NK 细胞功能 ( ) 0083 0084 注 ： PSC ： 原头节 ； SB ： TGF-1 受体阻断剂 (SB-525334。

35、) ； 0085 2.3SB-525334 对细粒棘球蚴早期感染小鼠的 T 细胞亚群的影响 0086 2.3.1SB-525334 调控细粒棘球蚴早期感染小鼠的 CD4+T 细胞的数量 0087 流式细胞术检测药物调控细粒棘球蚴早期感染小鼠 TGF-1 信号活性后 CD4+T 细胞比率的变化 ( 表 2， 图 2-4) ； 流式结果显示各组 CD4+T 细胞比率， 在棘球蚴组最低为 62.382.34， 在接种棘球蚴并给予TGF-1受体阻断剂处理组为64.351.69， PBS加 SB 组为 64.931.48， 正常对照组小鼠最高为 66.201.47。棘球蚴组的 CD4+T 细胞 比率是最。

36、低， 棘球蚴加 TGF-1 受体阻断剂组 CD4+T 细胞比率有所回升， 但回升幅度不大且 说 明 书 CN 104490886 A 8 7/8 页 9 比正常组小 ； 经统计学分析， 棘球蚴加 TGF-1 受体阻断剂组与其它组之间的差异均无统 计学意义。 0088 2.3.2SB-525334 调控细粒棘球蚴早期感染小鼠的 CD8+T 细胞的数量 0089 流式细胞术检测药物调控细粒棘球蚴早期感染小鼠 TGF-1 信号活性后 CD8+T 细 胞比率的变化 ( 表 2， 图 4)， 结果显示， 在棘球蚴组最高为 26.851.09， 而接种棘球蚴并 给予TGF-1受体阻断剂处理组CD8+T细胞。

37、比率下降至24.350.81， 稍高于正常对照组 小鼠的 23.630.66 ； 经统计学分析， 棘球蚴加药物组的 CD8+T 细胞比率与棘球蚴组的差 异有统计学意义 ( 图 4-C， P 0.05)， 而与 PBS+SB 组和正常对照组之间的差异无统计学意 义。 0090 2.3.3SB-525334 调控细粒棘球蚴早期感染小鼠的 CD4+/CD8+T 细胞的比值 0091 流式细胞术检测各组小鼠 CD4+/CD8+T 细胞比值的影响 ( 表 4， 图 4)， CD4+/ CD8+T 细胞比值均比对照组低在棘球蚴组最低 (2.320.07 )， 在正常对照组最高 (2.800.09 )。棘球。

38、蚴加 TGF-1 受体阻断剂的 CD4+/CD8+T 细胞比值显著高于棘球蚴 组 (P 0.001)， 而与 PBS+SB 和 PBS 组之间的差异无统计学意义 ( 图 4-D)。 0092 表 2 SB-525334 对 E.g 早期感染 BALB/c 小鼠 T 细胞亚群的影响 0093 0094 注 ： PSC ： 原头节 ； SB ： TGF-1 受体阻断剂 (SB-525334) ； 0095 PSC+SB 组分别与 PSC、 PBS+SB、 PBS 组比较 * ： P 0.05， * ： P 0.001。 0096 2.3.4SB-525334 调控细粒棘球蚴早期感染小鼠的 CD4+。

39、CD25+T 细胞的数量 0097 流式细胞术检测各组小鼠 CD4+CD25+T 细胞的变化 ( 表 3， 图 5)， 在粒棘球蚴感 染组小鼠的 CD4+CD25+T 细胞数量最多 (2.930.39 )， 在 TGF-1 受体特异性阻断后， CD4+CD25+T 细胞数量下降至 2.30.26接近正常组 (1.480.25 ) 的水平。经统计学 分析， 棘球蚴+TGF-1受体阻断剂组CD4+CD25+T细胞数量明显低于棘球蚴感染组， 显著高 于 PBS+SB 组 (P 0.05) ； 与正常组无统计学差义。 0098 表 3 SB-525334 对 E.g 早期感染 BALB/c 小鼠 CD。

40、4+CD25+T 细胞数量的影响 ( ) 0099 0100 注 ： PSC ： 原头节 ； SB ： TGF-1 受体阻断剂 (SB-525334) ； 0101 PSC+SB 组分别与 PSC、 PBS+SB、 PBS 组比较 * ： p 0.05， * ： p 0.001 说 明 书 CN 104490886 A 9 8/8 页 10 0102 在上述实验中， 申请人使用 Western Bolting 检测各组磷酸化的 Smad2/3 蛋白水 平的表达， 发现细粒棘球蚴早期感染细胞和小鼠， TGF-1 和 p-Smad2/3 表达量升高， 表明 细粒棘球蚴早期激活了 TGF/Smad 。

41、信号通路， 又发现 NK 细胞活性受体 NKG2D 表达降低， NK 细胞对靶细胞的裂解率降低， 小鼠NK细胞的活性与其活性受体NKG2D的相关性分析的表达 呈正相关， CD4+/CD8+T 细胞比值降低， CD4+CD25+T 细胞数量升高。在上述实验中， 申请人采 用 TGF/Smad 信号通路抑制剂 SB-525334 阻断 TGF- 受体， 其下游分子 Smad2/3 磷酸化 蛋白表达下降， 所研究的指标与TGF/Smad信号通路阻断前相反。 由此证实， 阻断TGF-/ Smad 通路可以提高宿主的细胞免疫， 有助于抵抗细粒棘球蚴的感染。 0103 在实验中， 申请人进行的实验显示 T。

42、GF-1 受体抑制剂 SB-525334 给小鼠灌胃， 2 次 / 天， 在第 9 天时 Western Bolting 检测实验组 p-Smad2/3 蛋白量与对照组相比明显降 低， 说明 SB-525334 可以在活体内有效阻断 TGF-/Smad 信号通路。因此在棘球蚴感染早 期 SB-525334 可以提高小鼠的细胞免疫。 0104 综上所述， TGF-1受体阻断剂SB-525334可降低棘球蚴早期感染小鼠TGF-1下 游分子 Smad2/3 磷酸化蛋白的表达， 使 CD4+CD25+T 细胞数量减少和 CD4+/CD8+T 细胞比值 升高， 使NK细胞活性受体NKG2D的表达增加， 而使NK细胞杀伤活性的恢复， 因此SB-525334 在临床上可预防包虫病的复发。 说 明 书 CN 104490886 A 10 1/3 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104490886 A 11 2/3 页 12 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 104490886 A 12 3/3 页 13 图 5 说 明 书 附 图 CN 104490886 A 13 。