一种复合交联医用几丁糖制剂及其制备方法.pdf

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410725257.3 (22)申请日 2014.12.04 A61K 38/39(2006.01) A61P 17/02(2006.01) A61P 19/02(2006.01) A61P 29/00(2006.01) A61P 19/04(2006.01) A61P 31/04(2006.01) A61K 31/722(2006.01) (71)申请人 常州药物研究所有限公司 地址 213003 江苏省常州新北区高新科技园 10 号 申请人 杨子中 (72)发明人 杨子中 何浩明 高坚杰 黄金钱 (54) 发明名称 一种复合交联。

2、医用几丁糖制剂及其制备方法 (57) 摘要 一种复合交联医用几丁糖制剂及其制备方 法， 该制剂以羧甲基几丁质为基质通过交联剂 1， 4- 双缩水甘油醚进行交联， 再与鱼鳔胶原溶液共 混， 经超滤、 层析、 真空干燥， 然后按处方量加入磷 酸二氢钠、 磷酸氢二钠、 氯化钠和注射用水， 最后 进行灌装得制剂。其中采用的羧甲基几丁质具有 良好的水溶性， 可有效地抑制纤维细胞生长。 鱼鳔 胶原经提纯得胶原肽， 具有抗氧活性强， 易于消化 吸收和安全无毒作用， 生物相容性好。 通过选用低 毒性双官能团交联羧甲基几丁质， 仍保持原有的 生物学特性， 再与胶原肽进行适度的物理共混得 到了物理性质良好的关节腔。

3、注射用复合交联医用 几丁糖制剂。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 (10)申请公布号 CN 104491846 A (43)申请公布日 2015.04.08 CN 104491846 A 1/1 页 2 1.一种复合交联医用几丁糖制剂， 其特征在于 ： 该制剂以羧甲基几丁质为基质通过交 联剂 1， 4- 双缩水甘油醚进行交联， 再与鱼鳔胶原溶液共混， 经超滤、 层析、 真空干燥， 然后 按处方量加入磷酸二氢钠、 磷酸氢二钠、 氯化钠和注射用水， 最后进行灌装得制剂。 2.根据权利要求 1 所述的复合交联医用几丁糖制。

4、剂， 其特征在于 ： 所述羧甲基几丁质 分子量为 100-200 万 Da， 脱乙酰度为 5-20。 3.根据权利要求 1 所述的复合交联医用几丁糖制剂， 其特征在于 ： 羧甲基几丁质和鱼 鳔胶原的重量比例为 4/1-1/4。 4.一种复合交联医用几丁糖制剂的制备方法， 其特征在于， 包括如下步骤 ： (1) 将羧甲基几丁质溶于注射用水中， 充分搅拌， 用碱性溶液调节 pH 为 8 11， 静置除 去气泡， 使最终羧甲基几丁质浓度为 1.5-2.5 (w/v) ； (2) 洗净大黄鱼鱼鳔， 用捣碎机捣碎并搅拌均匀， 按照料液比 1g 10 15ml 加入 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，。

5、 调节 pH 值 6.5 7.5， 于 40 50 摄氏度保温 10 15min ； 按照鱼 鳔湿重的 1.5 10加入中性蛋白酶酶解 2-4H ； 将酶解液加热到 90-95 摄氏度灭活 10-15 分钟， 4500 5000r/min 离心 15-20 分钟， 取上清液依次经超滤和层析， 得到胶原肽 ； 将所 述胶原肽溶于热的注射用水中， 充分搅拌， 静置除去气泡， 最终制得浓度为 10-20 (m/v) 的鱼鳔胶原溶液 ； (3) 将步骤 (1) 中羧甲基几丁质溶液与交联剂双缩水甘油醚混合除去气泡， 放入烘干 箱中， 进行交联反应 6 24 小时 ； (4) 将步骤 (2) 中制得的鱼鳔。

6、胶原溶液按比例加到步骤 (3) 中交联好的的羧甲基几丁 质溶液中， 充分搅拌， 静置除去气泡 ； (5) 将步骤 (4) 中混合液离心机离心去除气泡， 然后依次超滤和层析， 并进行真空干 燥， 最后按处方量加入磷酸二氢钠、 磷酸氢二钠、 氯化钠和注射用水， 灌装得成品合交联医 用几丁糖制剂。 5.根据权利要求4所述的复合交联医用几丁糖制剂的制备方法， 其特征在于 ： 步骤(1) 中碱性溶液为 NaOH 溶液或 KOH 溶液。 6.根据权利要求4所述的复合交联医用几丁糖制剂的制备方法， 其特征在于 ： 步骤(3) 中羧甲基几丁质溶液与交联剂双缩水甘油醚的混合比例为 100/1-100/4(m/m。

7、)。 7.根据权利要求4所述的复合交联医用几丁糖制剂的制备方法， 其特征在于 ： 步骤(4) 中鱼鳔胶原溶液按照胶原肽 / 羧甲基几丁质 1/1-2/1(m/m) 的比例进行添加。 权 利 要 求 书 CN 104491846 A 2 1/6 页 3 一种复合交联医用几丁糖制剂及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及医用材料技术领域， 具体涉及一种复合交联医用几丁糖制剂及其制备 方法， 该制剂对外伤或退变性骨关节炎具有良好的治疗效果。 背景技术 0002 关节软骨损伤修复一直是临床难题， 采用传统的治疗方法疗效欠佳。利用复合交 联医用几丁糖关节腔内注射能够明显促进关节软骨的修复。软骨组织工。

8、程学的诞生与发 展， 可能为关节软骨损伤修复这一难题的解决提供新的方法。复合交联医用几丁糖除能提 供细胞生长所需要的三维支架外， 还能够创造类似软骨基质环境， 维持种子细胞新代谢和 生长表型， 是一种合适的生物载体材料。 复合交联医用几丁糖是一种具有良好生物相容性、 生物可降解性及生物学活性的医用高分子多糖类物质。 保护关节软骨的机理在于几丁糖理 化性质上与关节内氨基多糖相似， 具有粘弹性、 缓吸收性， 而氨基多糖是软骨及软骨基质构 成和代谢的基础。 0003 复合交联医用几丁糖是用羧甲基几丁质与鱼鳔胶原混合制备而来。 几丁糖是一种 广泛存在于自然界天然高分子聚糖， 一般从甲壳类动物如虾、 蟹。

9、的外壳中提取制得， 故又称 甲壳质。如授权公告号为 CN1132585C 的中国专利公开了一种水溶性医用几丁糖制剂及制 备方法， 其中几丁糖是从甲壳动物如虾、 蟹的外壳中提取得到的， 该制剂中几丁质的水溶性 极差， 因而对应用受到很大限制。 发明内容 0004 本发明针对现有技术中的不足之处， 提供一种复合交联医用几丁糖制剂及其制备 方法， 该制备方法及利用该方法制备的制剂工艺简单， 成本低， 在临床上具有较好的应用前 景。 0005 本发明通过下述技术方案得以解决 ： 0006 一种复合交联医用几丁糖制剂， 该制剂以羧甲基几丁质为基质通过交联剂 1， 4- 双缩水甘油醚进行交联， 再与鱼鳔胶。

10、原溶液共混， 经超滤、 层析、 真空干燥， 然后按处方量 加入磷酸二氢钠、 磷酸氢二钠、 氯化钠和注射用水， 最后进行灌装得制剂。 0007 进一步地， 所述羧甲基几丁质分子量为 100-200 万 Da， 脱乙酰度为 5-20。 0008 进一步地， 羧甲基几丁质和鱼鳔胶原的重量比例为 4/1-1/4。 0009 发明还涉及一种复合交联医用几丁糖制剂的制备方法， 包括如下步骤 ： 0010 (1) 将羧甲基几丁质溶于注射用水中， 充分搅拌， 用碱性溶液调节 pH 为 8 11， 静 置除去气泡， 使最终羧甲基几丁质浓度为 1.5-2.5 (w/v) ； 0011 (2)洗净大黄鱼鱼鳔， 用捣。

11、碎机捣碎并搅拌均匀， 按照料液比1g1015ml加入 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液， 调节 pH 值 6.5 7.5， 于 40 50 摄氏度保温 10 15min ； 按照鱼 鳔湿重的 1.5 10加入中性蛋白酶酶解 2-4H ； 将酶解液加热到 90-95 摄氏度灭活 10-15 分钟， 4500 5000r/min 离心 15-20 分钟， 取上清液依次经超滤和层析， 得到胶原肽 ； 将所 说 明 书 CN 104491846 A 3 2/6 页 4 述胶原肽溶于热的注射用水中， 充分搅拌， 静置除去气泡， 最终制得浓度为 10-20 (m/v) 的鱼鳔胶原溶液 ； 0012 (。

12、3) 将步骤 (1) 中羧甲基几丁质溶液与交联剂双缩水甘油醚混合除去气泡， 放入 烘干箱中， 进行交联反应 6 24 小时 ； 0013 (4) 将步骤 (2) 中制得的鱼鳔胶原溶液按比例加到步骤 (3) 中交联好的的羧甲基 几丁质溶液中， 充分搅拌， 静置除去气泡 ； 0014 (5) 将步骤 (4) 中混合液离心机离心去除气泡， 然后依次超滤和层析， 并进行真空 干燥， 最后按处方量加入磷酸二氢钠、 磷酸氢二钠、 氯化钠和注射用水， 灌装得成品合交联 医用几丁糖制剂。 0015 进一步地， 步骤 (1) 中碱性溶液为 NaOH 溶液或 KOH 溶液。 0016 进一步地， 步骤 (3) 中。

13、羧甲基几丁质溶液与交联剂双缩水甘油醚的混合比例为 100/1-100/4(m/m)。 0017 进一步地， 步骤 (4) 中鱼鳔胶原溶液按照胶原肽 / 羧甲基几丁质 1/1-2/1(m/m) 的比例进行添加。 0018 本发明采用的羧甲基几丁质具有良好的水溶性， 经研究表明可有效地抑制纤维细 胞生长， 具有广谱的抑菌作用和聚糖类网络结构， 抑制疤痕形成和保护关节软骨等生理功 能， 羧甲基几丁质经过近 20 年的临床使用， 证明安全有效。鱼鳔胶原经提纯得胶原肽， 具有 抗氧活性强， 易于消化吸收和安全无毒作用， 生物相容性好。 通过选用低毒性双官能团交联 羧甲基几丁质， 仍保持原有的生物学特性，。

14、 再与胶原肽进行适度的物理共混得到了物理性 质良好的关节腔注射用复合交联医用几丁糖。 具体实施方式 0019 为使本发明实施例的目的、 技术方案和优点更加清楚， 对本发明实施例的技术方 案进行清楚、 完整地描述。显然， 所描述的实施例是本发明的一部分实施例， 而不是全部的 实施例。基于所描述的本发明的实施例， 本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下 所获得的所有其他实施例， 都属于本发明保护的范围。 0020 实施例 1 ： 0021 一、 制备复合医用几丁糖原始溶液 ： 0022 a. 将羧甲基几丁质溶于注射用水中， 充分搅拌， 用 NaOH 溶液调节 pH 为 9， 静置除 去气泡， 。

15、使最终羧甲基几丁质浓度为2.5(w/v) ； 其中羧甲基几丁质， 分子量为100-200万 Da， 脱乙酰度为 5。 0023 b. 鱼鳔胶原溶液配制 ： 洗净大黄鱼鱼鳔， 用捣碎机捣碎并搅拌均匀， 按照料液比 1g 10ml 加入 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液， 调节 pH 值 6.5， 于 40 摄氏度保温 10min ； 按照鱼鳔 湿重的 1.5加入中性蛋白酶解 2H ； 将酶解液加热到 90 摄氏度灭活 10 分钟， 4500r/min 离 心 20 分钟， 取上清液依次经超滤和层析， 得到胶原肽 ； 将胶原肽溶于热的注射用水中， 充分 搅拌， 静置除去气泡， 制得鱼鳔胶原溶液。

16、浓度为 10 (m/v)。 0024 c.将羧甲基几丁质溶液与交联剂1， 4-双缩水甘醚按100/4(m/m)的比例混合均匀 后， 充分搅拌， 静置除去气泡， 放入烘箱里， 进行交联反应 20 小时。 0025 d.将鱼鳔胶原溶液按比例加入交联好的羧甲基几丁质溶液中(胶原肽/羧甲基几 说 明 书 CN 104491846 A 4 3/6 页 5 丁质 2/1， m/m)， 充分搅拌， 静置除去气泡。 0026 二、 复合交联医用几丁糖制备 ： 0027 a. 将复合溶液混合， 离心去除气泡 ； 0028 b. 将溶液依次超滤和层析， 进行真空干燥， 然后按处方量加入磷酸二氢钠、 磷酸氢 二钠、。

17、 氯化钠和注射用水， 最后进行灌装得成品。 0029 实施例 2 ： 0030 一、 制备复合医用几丁糖原始溶液配制 ： 0031 a. 将羧甲基几丁质溶于注射用水中， 充分搅拌， 用 NaOH 溶液调节 pH 为 10， 静置除 去气泡， 使最终羧甲基几丁质浓度为2.0(w/v) ； 其中羧甲基几丁质， 分子量为100-200万 Da， 脱乙酰度为 20。 0032 b. 鱼鳔胶原溶液配制 ： 洗净大黄鱼鱼鳔， 用捣碎机捣碎并搅拌均匀， 按照料液比 1g 15ml 加入 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液， 调节 PH 值 7.5， 于 50 摄氏度保温 15min ； 按照鱼鳔 湿重的 。

18、10加入中性蛋白酶解 4H ； 将酶解液加热到 95 摄氏度灭活 15 分钟， 5000r/min 离 心 15 分钟， 取上清液依次经超滤和层析， 得到胶原肽 ； 将胶原肽溶于热的注射用水中， 充分 搅拌， 静置除去气泡， 最终制备鱼鳔胶原溶液浓度为 10 (m/v)。 0033 c.将羧甲基几丁质溶液与交联剂1， 4-双缩水甘醚按100/4(m/m)的比例混合均匀 后， 充分搅拌， 静置除去气泡， 放入烘箱里， 进行交联反应 18 小时。 0034 d.将鱼鳔胶原溶液按比例加入交联好的羧甲基几丁质溶液中(胶原肽/羧甲基几 丁质 1/1， m/m)， 充分搅拌， 静置除去气泡。 0035 二。

19、、 复合交联医用几丁糖制备 ： 0036 a. 将复合溶液混合， 离心去除气泡 ； 0037 b. 将溶液依次超滤和层析， 进行真空干燥， 然后按处方量加入磷酸二氢钠、 磷酸氢 二钠、 氯化钠和注射用水， 最后进行灌装得成品。 0038 实施例 3 ： 0039 一、 制备复合医用几丁糖原始溶液配制 ： 0040 a. 将羧甲基几丁质溶于注射用水中， 充分搅拌， 用 NaOH 溶液调节 pH 为 10， 静置除 去气泡， 使最终羧甲基几丁质浓度为2.5(w/v) ； 其中羧甲基几丁质， 分子量为100-200万 Da， 脱乙酰度为 5。 0041 b. 鱼鳔胶原溶液配制 ： 洗净大黄鱼鱼鳔， 。

20、用捣碎机捣碎并搅拌均匀， 按照料液比 1g 12ml 加入 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液， 调节 pH 值 7.0， 于 45 摄氏度保温 12min ； 按照鱼鳔 湿重的 6加入中性蛋白酶解 3H ； 将酶解液加热到 92 摄氏度灭活 12 分钟， 4800r/min 离心 18 分钟， 取上清液依次经超滤和层析， 得到胶原肽。将胶原肽溶于热的注射用水中， 充分搅 拌， 静置除去气泡， 最终制备鱼鳔胶原溶液浓度为 15 (m/v)。 0042 c.将羧甲基几丁质溶液与交联剂1， 4-双缩水甘醚按100/2(m/m)的比例混合均匀 后， 充分搅拌， 静置除去气泡， 放入烘箱里， 进行交。

21、联反应 18 小时。 0043 d.将鱼鳔胶原溶液按比例加入交联好的羧甲基几丁质溶液中(胶原肽/羧甲基几 丁质 2/1， m/m)， 充分搅拌， 静置除去气泡。 0044 二、 复合交联医用几丁糖制备 ： 0045 a. 将复合溶液混合， 离心去除气泡 ； 说 明 书 CN 104491846 A 5 4/6 页 6 0046 b. 将溶液依次超滤和层析， 进行真空干燥， 然后按处方量加入磷酸二氢钠、 磷酸氢 二钠、 氯化钠和注射用水， 最后进行灌装得成品。 0047 实施例 4 ： 0048 一、 制备复合医用几丁糖原始溶液配制 ： 0049 a. 将羧甲基几丁质溶于注射用水中， 充分搅拌，。

22、 用 NaOH 溶液调节 pH 为 9， 静置除 去气泡， 使最终羧甲基几丁质浓度为1.5(w/v) ； 其中羧甲基几丁质， 分子量为100-200万 Da， 脱乙酰度为 15。 0050 b. 鱼鳔胶原溶液配制 ： 洗净大黄鱼鱼鳔， 用捣碎机捣碎并搅拌均匀， 按照料液比 1g11ml加入Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液， 调节pH值7.5， 于4050摄氏度保温13min ； 按照 鱼鳔湿重的 10 1.5加入中性蛋白酶解 2-4H ； 将酶解液加热到 90-95 摄氏度灭活 10-15 分钟， 45005000r/min离心15-20分钟， 取上清液依次经超滤和层析， 得到胶原肽。 将。

23、胶原 肽溶于热的注射用水中， 充分搅拌， 静置除去气泡， 最终制备鱼鳔胶原溶液浓度为 10 (m/ v)。 0051 c.将羧甲基几丁质溶液与交联剂1， 4-双缩水甘醚按100/4(m/m)的比例混合均匀 后， 充分搅拌， 静置除去气泡， 放入烘箱里， 进行交联反应 18 小时。 0052 d.将鱼鳔胶原溶液按比例加入交联好的羧甲基几丁质溶液中(胶原肽/羧甲基几 丁质 2/1， m/m)， 充分搅拌， 静置除去气泡。 0053 二、 复合交联医用几丁糖制备 ： 0054 a. 将复合溶液混合， 离心去除气泡 ； 0055 b. 将溶液依次超滤和层析， 进行真空干燥， 然后按处方量加入磷酸二氢钠。

24、、 磷酸氢 二钠、 氯化钠和注射用水， 最后进行灌装得成品。 0056 实施例 5 ： 0057 一、 制备复合医用几丁糖原始溶液配制 ： 0058 a. 将羧甲基几丁质溶于注射用水中， 充分搅拌， 用 NaOH 溶液调节 pH 为 10， 静置除 去气泡， 使最终羧甲基几丁质浓度为1.5(w/v) ； 其中羧甲基几丁质， 分子量为100-200万 Da， 脱乙酰度为 20。 0059 b. 鱼鳔胶原溶液配制 ： 洗净大黄鱼鱼鳔， 用捣碎机捣碎并搅拌均匀， 按照料液比 1g1015ml加入Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液， 调节pH值6.57.5， 于4050摄氏度保温 10 15min 。

25、； 按照鱼鳔湿重的 10 1.5加入中性蛋白酶解 2-4H ； 将酶解液加热到 90-95 摄氏度灭活 10-15 分钟， 4500 5000r/min 离心 15-20 分钟， 取上清液依次经超滤和层析， 得到胶原肽。将胶原肽溶于热的注射用水中， 充分搅拌， 静置除去气泡， 最终制备鱼鳔胶原 溶液浓度为 10 (m/v)。 0060 c.将羧甲基几丁质溶液与交联剂1， 4-双缩水甘醚按100/1(m/m)的比例混合均匀 后， 充分搅拌， 静置除去气泡， 放入烘箱里， 进行交联反应 18 小时。 0061 d.将鱼鳔胶原溶液按比例加入交联好的羧甲基几丁质溶液中(胶原肽/羧甲基几 丁质 2/1，。

26、 m/m)， 充分搅拌， 静置除去气泡。 0062 二、 复合交联医用几丁糖制备 ： 0063 a. 将复合溶液混合， 离心去除气泡 ； 0064 b. 将溶液依次超滤和层析， 进行真空干燥， 然后按处方量加入磷酸二氢钠、 磷酸氢 说 明 书 CN 104491846 A 6 5/6 页 7 二钠、 氯化钠和注射用水， 最后进行灌装得成品。 0065 实施例 6 ： 0066 一、 制备复合医用几丁糖原始溶液配制 ： 0067 a. 将羧甲基几丁质溶于注射用水中， 充分搅拌， 用 KOH 溶液调节 pH 为 9， 静置除去 气泡， 使最终羧甲基几丁质浓度为 1.5 (w/v) ； 其中羧甲基几。

27、丁质， 分子量为 100-200 万 Da， 脱乙酰度为 15。 0068 b. 鱼鳔胶原溶液配制 ： 洗净大黄鱼鱼鳔， 用捣碎机捣碎并搅拌均匀， 按照料液比 1g1015ml加入Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液， 调节pH值6.57.5， 于4050摄氏度保温 10 15min ； 按照鱼鳔湿重的 10 1.5加入中性蛋白酶解 2-4H ； 将酶解液加热到 90-95 摄氏度灭活 10-15 分钟， 4500 5000r/min 离心 15-20 分钟， 取上清液依次经超滤和层析， 得到胶原肽。将胶原肽溶于热的注射用水中， 充分搅拌， 静置除去气泡， 最终制备鱼鳔胶原 溶液浓度为 15 。

28、(m/v)。 0069 c.将羧甲基几丁质溶液与交联剂1， 4-双缩水甘醚按100/3(m/m)的比例混合均匀 后， 充分搅拌， 静置除去气泡， 放入烘箱里， 进行交联反应 18 小时。 0070 d.将鱼鳔胶原溶液按比例加入交联好的羧甲基几丁质溶液中(胶原肽/羧甲基几 丁质 1/1， m/m)， 充分搅拌， 静置除去气泡。 0071 二、 复合交联医用几丁糖制备 ： 0072 a. 将复合溶液混合， 离心去除气泡 ； 0073 b. 将溶液依次超滤和层析， 进行真空干燥， 然后按处方量加入磷酸二氢钠、 磷酸氢 二钠、 氯化钠和注射用水， 最后进行灌装得成品。 0074 实施例 7 ： 007。

29、5 一、 制备复合医用几丁糖原始溶液配制 ： 0076 a. 将羧甲基几丁质溶于注射用水中， 充分搅拌， 用 NaOH 溶液调节 pH 为 10， 静置除 去气泡， 使最终羧甲基几丁质浓度为1.5(w/v) ； 其中羧甲基几丁质， 分子量为100-200万 Da， 脱乙酰度为 10。 0077 b. 鱼鳔胶原溶液配制 ： 洗净大黄鱼鱼鳔， 用捣碎机捣碎并搅拌均匀， 按照料液比 1g 10 15ml 加入 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液， 调节 pH 值 6.5， 于 40 50 摄氏度保温 10 15min ； 按照鱼鳔湿重的101.5加入中性蛋白酶解2-4H ； 将酶解液加热到90-9。

30、5摄氏度 灭活 10-15 分钟， 4500 5000r/min 离心 15-20 分钟， 取上清液依次经超滤和层析， 得到胶 原肽。将胶原肽溶于热的注射用水中， 充分搅拌， 静置除去气泡， 最终制备鱼鳔胶原溶液浓 度为 15 (m/v)。 0078 c.将羧甲基几丁质溶液与交联剂1， 4-双缩水甘醚按100/2(m/m)的比例混合均匀 后， 充分搅拌， 静置除去气泡， 放入烘箱里， 进行交联反应 20 小时。 0079 d.将鱼鳔胶原溶液按比例加入交联好的羧甲基几丁质溶液中(胶原肽/羧甲基几 丁质 3/2， m/m)， 充分搅拌， 静置除去气泡。 0080 二、 复合交联医用几丁糖制备 ： 。

31、0081 a. 将复合溶液混合， 离心去除气泡 ； 0082 b. 将溶液依次超滤和层析， 进行真空干燥， 然后按处方量加入磷酸二氢钠、 磷酸氢 二钠、 氯化钠和注射用水， 最后进行灌装得成品。 说 明 书 CN 104491846 A 7 6/6 页 8 0083 实施例 8 ： 0084 一、 制备复合医用几丁糖原始溶液配制 ： 0085 a. 将羧甲基几丁质溶于注射用水中， 充分搅拌， 用 KOH 溶液调节 pH 为 11， 静置除 去气泡， 使最终羧甲基几丁质浓度为2.0(w/v) ； 其中羧甲基几丁质， 分子量为100-200万 Da， 脱乙酰度为 5。 0086 b. 鱼鳔胶原溶液。

32、配制 ： 洗净大黄鱼鱼鳔， 用捣碎机捣碎并搅拌均匀， 按照料液比 1g1015ml加入Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液， 调节pH值6.57.5， 于4050摄氏度保温 10 15min ； 按照鱼鳔湿重的 10 1.5加入中性蛋白酶解 2-4H ； 将酶解液加热到 90-95 摄氏度灭活 10-15 分钟， 4500 5000r/min 离心 15-20 分钟， 取上清液依次经超滤和层析， 得到胶原肽。将胶原肽溶于热的注射用水中， 充分搅拌， 静置除去气泡， 最终制备鱼鳔胶原 溶液浓度为 10 (m/v)。 0087 c.将羧甲基几丁质溶液与交联剂1， 4-双缩水甘醚按100/4(m/m。

33、)的比例混合均匀 后， 充分搅拌， 静置除去气泡， 放入烘箱里， 进行交联反应 18 小时。 0088 d.将鱼鳔胶原溶液按比例加入交联好的羧甲基几丁质溶液中(胶原肽/羧甲基几 丁质 3/2， m/m)， 充分搅拌， 静置除去气泡。 0089 二、 复合交联医用几丁糖制备 ： 0090 a. 将复合溶液混合， 离心去除气泡 ； 0091 b. 将溶液依次超滤和层析， 进行真空干燥， 然后按处方量加入磷酸二氢钠、 磷酸氢 二钠、 氯化钠和注射用水， 最后进行灌装得成品。 0092 实施例 9 ： 0093 复合交联医用几丁糖制剂关节腔注射对兔关节软骨退变临床研究 0094 方法 ： 18只大白兔。

34、行右膝关节前交韧带切断术建立骨关节炎(OA)动物模型。 术后 将动物随机分为 2 组， 每组 9 只， 实验组进行 2几丁糖 0.3ml 关节腔注射， 每 2 个周 1 次， 对照组同一时间给予生理盐水 0.3ml 关节腔注射。第 8 周处死动物， 比较两组兔股骨关节 软骨的大体改变。用生化方法测定软骨基质蛋白多糖的变化， 并且免疫组化方法对比两组 的基质金属蛋白酶 -1(MMP-1) 的表达情况。 0095 结果 ： 实验组动物软骨退变程度轻于对照组 (P 0.05)， 氨基葡聚糖总量明显高于 对照组 (P 0.01)， 硫酸软骨素 / 硫酸角质素比值低于对照组 (P 0.05)， MMP-1 的表达亦明 显低于对照组 (P 0.01)， 结论 ： 医用几丁糖能预防 OA 软骨退变， 具有软骨保护作用。 0096 最后应说明的是 ： 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案， 而非对其限制 ； 尽 管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明， 本领域的普通技术人员应当理解 ： 其依然 可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改， 或者对其中部分技术特征进行等同替 换 ； 而这些修改或者替换， 并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范 围。 说 明 书 CN 104491846 A 8 。