一种短小芽孢杆菌和免疫增强剂混合制剂.pdf

本发明涉及一种短小芽孢杆菌和免疫增强剂混合制剂，所述的混合制剂的有效成分由短小芽孢杆菌和免疫增强剂组成，所述的短小芽孢杆菌为具有群体感应系统抑制作用的短小芽孢杆菌，保藏编号为CCTCC M 2013240，所述的免疫增强剂为维生素C、黄芪、杜仲、党参、当归、金银花、柴胡、乌梅、石榴皮和五味子。本发明优点在于：能够显著提高鱼体抵抗嗜水气单胞菌的感染能力，增强养殖鱼类的机体免疫力，显著抑制鱼类肠道致病菌的生长，促进鱼体快速生长，提高养殖鱼类的增重率和抗病力。

权利要求书
1.  一种短小芽孢杆菌和免疫增强剂混合制剂，其特征在于，所述的混合制 剂的有效成分由短小芽孢杆菌和免疫增强剂组成，所述的短小芽孢杆菌为具有 群体感应系统抑制作用的短小芽孢杆菌，保藏编号为CCTCC M 2013240，所 述的免疫增强剂为维生素C、黄芪、杜仲、党参、当归、金银花、柴胡、乌梅、 石榴皮和五味子，所述的混合制剂中短小芽孢杆菌和免疫增强剂的重量份分别 为：短小芽孢杆菌14-16份、维生素C 10-12份、黄芪7-8份、杜仲4-5份、党 参2-4份、当归3-5份、金银花6-8份、柴胡9-10份、乌梅3-5份、石榴皮4-6 份、五味子9-10份。

2.  根据权利要求1所述的混合制剂，其特征在于，所述的混合制剂中短小 芽孢杆菌和免疫增强剂的重量份分别为：短小芽孢杆菌16份、维生素C 12份、 黄芪8份、杜仲5份、党参4份、当归5份、金银花8份、柴胡10份、乌梅5 份、石榴皮6份、五味子10份。

3.  根据权利要求1-2任一所述的混合制剂，其特征在于，所述的混合制剂 的制备方法为将所述的短小芽孢杆菌经液体发酵或固态发酵制成微生物菌剂， 所述的微生物菌剂中短小芽孢杆菌活菌数为109-1011cfu/g，将所述的微生物菌 剂、维生素C、黄芪、杜仲、党参、当归、金银花、柴胡、乌梅、石榴皮和五 味子分别粉碎过100目筛后，按照重量份配比混匀，即得所述的混合制剂。

4.  根据权利要求1-2任一所述的混合制剂，其特征在于，所述的混合制剂 作为水产饲料添加剂或水产养殖水体添加剂使用。

5.  根据权利要求4所述的混合制剂，其特征在于，所述的水产为淡水鱼类。

6.  根据权利要求4所述的混合制剂，其特征在于，所述的混合制剂在饲料 中的添加量为1％-3％。

说明书一种短小芽孢杆菌和免疫增强剂混合制剂
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体地说，是一种短小芽孢杆菌和免疫增强剂混合制剂。
背景技术
细菌性疾病一直是困扰水产养殖业发展的重要原因之一。近年来，高密度集约化的生产模式在促进水产业提高产量的同时，也使得细菌疾病发生的机会增大、频率增加、危害加大；此外，抗生素使用导致的耐药性、药物残留以及对生态环境的破坏也成为社会关注的焦点。因此，寻找抗生素的替代药物、探索新的防治方式已经成为水产病害防治研究重要方向之一。
群体感应(Quorum sensing，简称QS)是指细菌能自发产生并释放一些特定的信号分子，感知自身浓度的变化，进而调控相关基因的表达。目前，调节细菌群体感应的信号分子主要有三种，(a)N-酰基高丝氨酸内酯(AHLs)，是广泛存在于革兰氏阴性细菌中的群体感应的信号分子；(b)自体诱导肽(Autoinducing peptides，AIP)，AIP是一类短肽分子，是革兰氏阳性细菌中常见的信号分子；(c)自体诱导物Ⅱ类分子(Auto inducingⅡ，AI2)，是以费氏弧菌(Vibrio fischeri)为代表的由luxS酶催化的AI 2系统的信号分子。研究表明，在革兰氏阴性细菌中，如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)等，其生物被膜形成、有害毒素产生、致病因子释放等行为均受到AHLs类信号分子的调节。Dong(2000)等人在蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)中发现了aiiA基因，能够合成AHLs信号分子降解酶，阻断QS信号分子在细菌间的传递；尹守亮等(2009)从胶州湾海域筛选出一株能够降解AHLs信号分子的真菌，表明海洋微生物也可以作为QS抑制剂的潜在研究对象；Bhavanath等(2013)发现紫杉状海门冬(Asparagopsis taxiformis)的粗提物能够降解AHLs信号分子，并且对铜绿假单胞菌生物膜有一定的抑制作用。Defoirdt等(2011)首次从南美白对虾和海水鲈鱼等水产动物的肠道中分离出了能够抑制哈氏弧菌(Vibrio harveyi)QS信号分子传递的芽孢杆菌，Natrah等(2011)分离出一株能够抑制AHLs信号分子的微藻，该微藻能够阻断哈氏弧菌QS系统，降低其致病力。这些研究为探讨从群体感应角度防控水产细菌性疾病提供了理论依据和科学数据的支撑。芽孢杆菌(Bcaillus sp)具有易 生产、便运输、耐储藏等特点，在水产养殖上可以起到净化水质、防治疾病和促进生长等作用，是常用的益生微生物菌株。
中国专利文献CN103525723A公开了一种具有群体感应系统抑制作用的短小芽孢杆菌，具有抑制细菌群体感应的作用，可用于制备防治水产细菌性病害的微生物制剂。但是关于一种具有显著防治水产细菌性病害、提高存活率的短小芽孢杆菌和免疫增强剂混合制剂目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种短小芽孢杆菌和免疫增强剂混合制剂。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种短小芽孢杆菌和免疫增强剂混合制剂，所述的混合制剂的有效成分由短小芽孢杆菌和免疫增强剂组成，所述的短小芽孢杆菌为具有群体感应系统抑制作用的短小芽孢杆菌，保藏编号为CCTCC M 2013240，所述的免疫增强剂为维生素C、黄芪、杜仲、党参、当归、金银花、柴胡、乌梅、石榴皮和五味子，所述的混合制剂中短小芽孢杆菌和免疫增强剂的重量份分别为：短小芽孢杆菌14-16份、维生素C 10-12份、黄芪7-8份、杜仲4-5份、党参2-4份、当归3-5份、金银花6-8份、柴胡9-10份、乌梅3-5份、石榴皮4-6份、五味子9-10份。
优选的，所述的混合制剂中短小芽孢杆菌和免疫增强剂的重量份分别为：短小芽孢杆菌16份、维生素C 12份、黄芪8份、杜仲5份、党参4份、当归5份、金银花8份、柴胡10份、乌梅5份、石榴皮6份、五味子10份。
优选的，所述的混合制剂的制备方法为将所述的短小芽孢杆菌经液体发酵或固态发酵制成微生物菌剂，所述的微生物菌剂中短小芽孢杆菌活菌数为109-1011cfu/g，将所述的微生物菌剂、维生素C、黄芪、杜仲、党参、当归、金银花、柴胡、乌梅、石榴皮和五味子分别粉碎过100目筛后，按照重量份配比混匀，即得所述的混合制剂。
优选的，所述的混合制剂作为水产饲料添加剂或水产养殖水体添加剂使用。
优选的，所述的水产为淡水鱼类。
优选的，所述的混合制剂在饲料中的添加量为1％-3％。
本发明优点在于：
本发明的混合制剂对鱼类的免疫保护率高达73-90％，能够显著提高鱼体 抵抗嗜水气单胞菌的感染能力，增强养殖鱼类的机体免疫力，显著抑制鱼类肠道致病菌的生长，促进鱼体快速生长，提高养殖鱼类的增重率和抗病力。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
本发明提供一种短小芽孢杆菌和免疫增强剂混合制剂，所述的混合制剂的有效成分由短小芽孢杆菌和免疫增强剂组成，所述的短小芽孢杆菌为具有群体感应系统抑制作用的短小芽孢杆菌，保藏编号为CCTCC M 2013240，已证实其具有群体感应系统抑制作用。所述的免疫增强剂为维生素C、黄芪、杜仲、党参、当归、金银花、柴胡、乌梅、石榴皮和五味子，所述的混合制剂中短小芽孢杆菌和免疫增强剂的重量份分别为：短小芽孢杆菌14-16份、维生素C10-12份、黄芪7-8份、杜仲4-5份、党参2-4份、当归3-5份、金银花6-8份、柴胡9-10份、乌梅3-5份、石榴皮4-6份、五味子9-10份。
所述的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：武汉大学生命科学院保藏中心，保藏日期2013年6月2日，保藏编号为CCTCC NO：M 2013240。已证实其具有群体感应系统抑制作用。
所述的混合制剂的制备方法为将所述的短小芽孢杆菌经液体发酵或固态发酵制成微生物菌剂，所述的微生物菌剂中短小芽孢杆菌活菌数为109-1011cfu/g，将所述的微生物菌剂、维生素C、黄芪、杜仲、党参、当归、金银花、柴胡、乌梅、石榴皮和五味子分别粉碎过100目筛后，按照重量份配比混匀，即得所述的混合制剂。
实施例1 短小芽孢杆菌液体发酵
将短小芽抱杆菌菌株按斜面、液体种子、液体发酵的顺序培养，斜面培养基为常规营养琼脂培养基，液体种子培养基为常规营养肉汤液体培养基；液体发酵培养基配方(W/V)：葡萄糖2％，豆饼粉8％，玉米浆1％，MgSO4·7H2O0.02％，NaCl 0.4％，KH2PO4 0.1％，MnCl2 0.04％，发酵温度30℃，通风培养24-48h。得到高浓度的发酵菌液，其中活菌数109-1011cfu/g。
也可以将发酵菌液离心去除发酵液，得到湿菌泥，添加抗热保护剂后，喷雾干燥，得到固体菌粉，活菌数109-1011cfu/g。
实施例2 短小芽孢杆菌固态发酵
将短小芽抱杆菌菌株按斜面、液体种子、固态发酵的顺序培养，斜面培养 基为常规营养琼脂培养基，液体种子培养基为常规营养肉汤液体培养基。将种子培养液以5-10％的接种量接种到固态发酵培养基中进行固态发酵，发酵时间为24-48h，发酵温度30℃，发酵产物烘干粉碎后，即得短小芽孢杆菌微生物菌剂。其中活菌数109-1011cfu/g。
其中固态发酵培养基由料和水组成，所述的料按总质量分数100％计，包括米糠10％，麸皮25％，豆粕32％，玉米粉30％，酵母提取物2％，NaCl 1％，料水比为1:1。
实施例3 混合制剂的制备
将所述的短小芽孢杆菌经固态发酵制成微生物菌剂，所述的微生物菌剂中短小芽孢杆菌活菌数为109-1011cfu/g，将所述的短小芽孢杆菌菌剂16份、维生素C 12份、黄芪8份、杜仲5份、党参4份、当归5份、金银花8份、柴胡10份、乌梅5份、石榴皮6份、五味子10份。分别粉碎过100目筛后，按照重量份配比混匀，即得所述的混合制剂。
实施例4 混合制剂的制备
将所述的短小芽孢杆菌经液体发酵制成微生物菌剂，所述的微生物菌剂中短小芽孢杆菌活菌数为109-1011cfu/g，将所述的短小芽孢杆菌菌剂14份、维生素C 10份、黄芪7份、杜仲4份、党参2份、当归3份、金银花6份、柴胡9份、乌梅3份、石榴皮4份、五味子9份。分别粉碎过100目筛后，按照重量份配比混匀，即得所述的混合制剂。
实施例5 混合制剂的制备
将所述的短小芽孢杆菌经固态发酵制成微生物菌剂，所述的微生物菌剂中短小芽孢杆菌活菌数为109-1011cfu/g，将所述的短小芽孢杆菌菌剂15份、维生素C 11份、黄芪7份、杜仲4份、党参3份、当归4份、金银花7份、柴胡10份、乌梅4份、石榴皮5份、五味子10份。分别粉碎过100目筛后，按照重量份配比混匀，即得所述的混合制剂。
实施例6 混合制剂的水体泼洒效果实验
鲫鱼，购买自江苏徐州淡水鱼养殖中心，体重100±0.5g，提前饲喂10天，无任何嗜水气单胞菌症状。饲料购买自宁波天邦股份有限公司，按照体重的3％饲喂。
在试验前先驯养一周确定无任合嗜水气单胞菌症状，然后取体重(100±2.3)g的鲫鱼90条，随机分为三组每组三个重复，每组10条，养殖在 700×500×50mm，体积90L水族箱中，保持水温16～20℃。
实验设计三个组，共90条，每组10条，三个重复，对照组：在水体中加入培养的嗜水气单胞菌菌液100mL(经稀释后最终菌液浓度达到108cfu/mL，在先实验确定嗜水气单胞菌的绝对致死浓度为1×108cfu/mL)，试验组加入嗜水气单胞菌菌液100mL和实施例3制备得到的本发明的混合制剂10g，空白组为空白对照水体中不加入任何东西。每隔两天换水，加入曝过气的自来水，和重新培养的菌液，记录鲫鱼的生长状况以及死亡数。
在两周的饲养周期内，空白组没有任何的死亡现象；对照组所有样本在9天内全部死亡，而水体中加入嗜水气单胞菌和本发明的混合制剂的试验组，在七天后达到稳定，最终的存活率为90％。
实施例7 混合制剂促生长和攻毒实验
生长实验：试验选择健康、规格、重量基本一致的鲫鱼，个体初均重约50g。随机分组，设有对照组、试验一组、试验二组、试验三组和试验四组，每组设3个平行试验，每平行组50尾试验鱼，共6个网箱(规格为250cm×150cm×100cm)。鲫鱼驯化30d后，对照组投喂普通饲料，试验一组投喂添加3.0％重量百分比本发明混合制剂(实施例3)的饲料，试验二组投喂添加1.0％重量百分比本发明混合制剂的饲料，试验三组投喂添加3.0％重量百分比本发明所述短小芽孢杆菌(不包括免疫增强剂的混合制剂)的饲料，试验四组投喂添加3.0％重量百分比免疫增强剂(不包括短小芽孢杆菌的免疫增强剂)的饲料，饲养56d，测定其生长的影响。
攻毒实验：对照组、试验一组、试验二组、试验三组和试验四组每组随机抽取15尾鲫鱼。1×108cfu/mL嗜水气单胞菌，按每100g鱼重腹腔注射菌液1.0ml，后放养于同样规格容积的水泥池网箱中(规格为100cm×100cm×100cm)，并保证充足的氧气，每天观察鱼体死亡情况，观察10d，统计存活率。
具体试验结果见下表1。
表1 三组增重率和死亡率的对照
  对照组 试验一组 试验二组 试验三组 试验四组 增重率 5.02％ 15.48％ 10.25％ 8.34％ 9.15％ 存活率 0 86％ 73％ 61％ 53％
试验结果表明，在饲料中添加3.0％、1.0％的本发明混合制剂的试验一组和试验二组增重率达到15.48％和10.25％，与对照组相比，P＜0.05。腹腔注射 嗜水气单胞菌10d后，对照组鲫鱼全部死亡，而饲喂本发明混合制剂的试验一组和试验二组最终的存活率分别为86％和73％，与对照组相比，P＜0.01。同时，试验一组和试验二组鲫鱼血清中的超氧化物歧化酶活力、溶菌酶含量、抗菌活力等免疫指标都显著高于对照组(P＜0.05)，肠道中的细菌总数、大肠杆菌、嗜水气单胞菌等致病菌的数量显著低于对照组(P＜0.05)。试验一组的增重率和存活率也显著高于单独使用短小芽孢杆菌或免疫增强剂的试验三组和试验四组，显示本发明的混合制剂同时使用具有群体感应系统抑制作用的短小芽孢杆菌和免疫增强剂，能够显著提高鱼体抗感染能力，增强养殖鱼类的机体免疫力，同时促进鱼体快速生长。
以上实验结果显示，本发明的混合制剂对鱼类的免疫保护率高达73-90％，能够显著提高鱼体抵抗嗜水气单胞菌的感染能力，增强养殖鱼类的机体免疫力，显著抑制鱼类肠道致病菌的生长，促进鱼体快速生长，提高养殖鱼类的增重率和抗病力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。