具有治疗黄体功能不全性的不孕症、月经失调的中药组合物及其应用.pdf

本发明公开了一种具有治疗黄体功能不全性的不孕症、月经失调的中药组合物，它是由炒白芍1~6份、淮山药1~9份、山茱萸1~6份、醋柴胡0.5~3份、莵丝子1~9份、鹿角片1.5~9份、紫石英1.5~9份和紫丹参1~6份制成。本发明提供的复方组合物，在中医药理论的指导下，辨证论治通过大量实验筛选得到组方，实验结果表明，该中药复方组合物能改善卵巢线粒体内质网的结构和形态、改善子宫内膜腺体和间质的结构；可调节卵巢分泌的活性物质E2、P，降低子宫内膜雌激素受体、孕激素受体、增加整合素αv，β3表达、从而可提高子宫内膜的容受性，促进胚胎着床的作用，具有很好的治疗不孕症的功效，并且无毒副作用，用药安全可靠。

权利要求书
1.  一种具有治疗黄体功能不全性的不孕症和月经失调的中药组合物，其特征在于，它是由下列重量份数的原料制成：
炒白芍1~6份   淮山药1~9份    山茱萸1~6份    醋柴胡0.5~3份
莵丝子1~9份    鹿角片1.5~9份    紫石英1.5~9份   紫丹参1~6份。

2.  根据权利要求1所述的具有治疗黄体功能不全性的不孕症、月经失调的中药组合物，其特征在于，它是由下列重量份数的原料制成：
炒白芍1~3份、淮山药1~5份、山茱萸1~3份、醋柴胡0.5~1.5份
莵丝子1~5份、鹿角片1~3份、紫石英1~5份、紫丹参1~3份。

3.  根据权利要求2所述的具有治疗黄体功能不全性的不孕症、月经失调的中药组合物，其特征在于，它是由下列重量份数的原料制成：
炒白芍2份、淮山药3份、山茱萸2份、醋柴胡1份
莵丝子3份、鹿角片2份、紫石英2份、紫丹参2份。

4.  根据权利要求1至3任一项所述的具有治疗黄体功能不全性的不孕症、月经失调的中药组合物，其特征在于，将各原料的提取物和药学上可接受的载体制备成颗粒剂，散剂、片剂，胶囊剂、丸剂或合剂。

5.  权利要求1至3任一项所述的具有治疗黄体功能不全性的不孕症、月经失调的中药组合物在制备治疗不孕症或月经失调药物中的应用。

说明书具有治疗黄体功能不全性的不孕症、月经失调的中药组合物及其应用
技术领域
本发明涉及一种中药组合物，具体涉及一种具有治疗黄体功能不全性的不孕症、月经失 调的中药组合物及其应用。
背景技术
近年来不孕不育仍然是医学界三大难治性疾病之一，临床研究发现黄体功能不全(luteal  phase defect,LPD)是导致育龄妇女妊娠失败的直接重要原因。黄体功能不全(LPD)指排卵后 卵泡形成的黄体(与生殖密切相关的暂时内分泌器官)发育和功能不全，孕激素分泌不足、 子宫内膜分泌不良伴有月经失调的综合征，其临床特点是不孕和反复早期流产。约有3.5％～ 10％的不孕症、35％的早期妊娠流产和4％～60％的习惯性流产是由LPD所引起。LPD对 育龄妇女的生殖健康造成了很大的危害，但与之不相适应的是，临床治疗的研究并不多见， 国内外的治疗手段也很单一，现代医学对于LPD的治疗：一是促进卵泡发育；二是促进月经 中期促黄体生成素(LH)峰的形成；三是黄体功能刺激疗法；四是黄体功能替代疗法。尽管 对LPD治疗策略似乎已有以上较一致的认识，但迄今为止治疗方案也主要凭临床经验,治疗 效果仍很不满意。尽管人工助孕技术(IVF-ET)用于治疗不孕症已获得较大成功，但其临床 妊娠率仍较低，LPD是其主要原因之一。
中医学根据其表现的症候群及其病症，归属于“不孕症”、“月经失调”、“胎漏、胎动不 安”、“滑胎”、等范畴。肾藏精，主生殖。肾气的盛衰与生殖关系密切。肾气旺盛，任通冲盛， 两精相博，才能受孕。肾主冲任，人体脏腑经络气血之间有着不可分割的联系。诸因损及肾， 伤及冲任，均可致肾失封藏，冲任不固，胞胎失养，胎元无以维系，胚胎无以着床而不孕。 中医药在治疗不孕症和月经失调症方面具有其独特的优势，因此，很有必要在现有技术的基 础之上，设计研发一种组方配伍合理，疗效可靠，安全性好，可用于治疗黄体功能不全性的 不孕症、月经失调的中药组合物。
发明内容
发明目的：本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种配比科学合理，具有很 好的治疗由于黄体功能不全导致的不孕症、月经失调，并且安全可靠，不良反应低的中药复 方组合物。
技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
一种具有治疗黄体功能不全性的不孕症和月经失调的中药组合物，它是由下列重量份数 的原料制成：
炒白芍1～6份   淮山药1～9份   山茱萸1～6份   醋柴胡0.5～3份
莵丝子1～9份   鹿角片1.5～9份   紫石英1.5～9份   紫丹参1～6份。
作为优选方案，以上所述的具有治疗黄体功能不全性的不孕症、月经失调的中药组合物， 它是由下列重量份数的原料制成：
炒白芍1～3份、淮山药1～5份、山茱萸1～3份、醋柴胡0.5～1.5份
莵丝子1～5份、鹿角片1～3份、紫石英1～5份、紫丹参1～3份。
作为更加优选方案，以上所述的具有治疗黄体功能不全性的不孕症、月经失调的中药组 合物，其由下列重量份数的原料制成：
炒白芍2份、淮山药3份、山茱萸2份、醋柴胡1份
莵丝子3份、鹿角片2份、紫石英2份、紫丹参2份。
本发明所述的具有治疗黄体功能不全性的不孕症、月经失调的中药组合物，将各原料的 提取物和药学上可接受的载体制备成颗粒剂，散剂、片剂，胶囊剂、丸剂或合剂。
本发明在制成片剂时，把中药复方组合物的提取物添加载体乳糖或玉米淀粉，需要时加 入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，然后压片制成片剂。
本发明在制成胶囊剂时，把中药复方组合物的提取物添加载体乳糖或玉米淀粉混合均匀， 整粒，然后装胶囊制成胶囊剂。
本发明在制成颗粒剂时，把中药复方组合物的提取物和稀释剂乳糖或玉米淀粉混合均匀， 整粒，干燥，制成颗粒剂。
本发明通过大量临床实践及经过多次实验研究，并遵循“君臣佐使”的组方原则，方中以 鹿角片、紫石英补肾助阳、暖宫散寒为君药，莵丝子平补肾阴肾阳，炒白芍、淮山药、山茱 萸补肾中阴精共为臣药，佐以醋柴胡疏肝解郁鼓舞阳气，使以丹参养血和血，诸药相合，在 经前期(确定排卵后)使用，治疗辩证属“肾虚偏阳，夹有肝郁”临床表现为腰膝酸软、肢寒 怕冷、经前乳胀的黄体功能不全性不孕症、月经不调，具有使“阳长至重”，舒畅心肝气机， 安定心肝魂魄，从而矫正心(脑)-肾-子宫生殖轴，有利于调经助孕，疗效确切。本发明所 述的具有治疗黄体功能不全性的不孕症、月经失调的中药组合物在制备治疗不孕症或月经失 调药物中的应用。
本发明所述的具有治疗黄体功能不全性的不孕症、月经失调的中药组合物的制备方法， 包括以下步骤：
(1)首先按重量份数取各药材，加水浸泡1～2小时，置多功能提取罐中，加水煎煮两次， 第一次加总药材5～8倍量的水，煎煮1.5～2小时，取煎液滤过。第二次加总药材3～6倍量的水， 煎煮1～1.2小时，取两次煎液，滤过，取滤液，减压干燥后和药学上可接受的载体制备成颗粒 剂，散剂、片剂，胶囊剂、丸剂或合剂。
有益效果：本发明提供的具有治疗黄体功能不全性的不孕症、月经失调的中药组合物和 现有技术相比具有以下优点：
本发明提供的具有治疗黄体功能不全性的不孕症、月经失调的中药组合物，根据不孕症、 月经失调的发病机制，在中医药理论的指导下，辨证论治通过大量实验筛选得到本发明的中 药复方组合物，实验结果表明，本发明提供的中药复方组合物具有多部位、多靶点的发挥作 用，能同时作用于卵巢和子宫内膜，改善其结构和形态；能改善卵巢线粒体内质网的结构和 形态、改善子宫内膜腺体和间质的结构；并可通过调节卵巢分泌的活性物质E2、P，调节子 宫内膜雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、整合素αv、β3、细胞间粘附分子1(ICAM-1)、 基质金属蛋白酶9(MMP-9)及基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP-1)等表达从而提高子宫内 膜对胚胎的容受性；抑制子宫内膜、卵巢TNF-a、Caspase-3的表达，抑制并改善细胞异常凋 亡。并且临床实验结果表明，本发明提供的中药复方组合物，能显著改善患者胚胎着床期P、 E2、LH水平；降低子宫及卵巢动脉血流阻力，增加子宫及卵巢动脉灌注量与血管壁的通透 性等综合改善子宫内环境，提高胚胎着床率。同时本发明提供的中药复方组合物，用大于人 体用量200倍进行长毒试验，未发现对心、脑、肝、脾、肾等重要脏器有病理性损害，安全 性好，不良反应低，且服用方便，价格低廉。
并且通过拆方实验结果表明，本发明提供的中药复方组合物共8味药是通过大量临床和 药理实验优选得到，缺少任何一味药物均不能达到本发明中药复方的功效，即8味药物具有 很好的协同增效的作用。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例 所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利 要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
一种具有治疗黄体功能不全性的不孕症和月经失调的中药组合物，它是由下列重量份数 的原料制成：
炒白芍6份   淮山药9份   山茱萸6份   醋柴胡3份
莵丝子9份   鹿角片9份   紫石英9份   紫丹参6份。
2、具有治疗黄体功能不全性的不孕症、月经失调的中药组合物的制备方法，包括以下步 骤：
(1)取炒白芍6份、淮山药9份、山茱萸6份、醋柴胡3份、莵丝子9份、鹿角片9份、紫石 英9份、紫丹参6份，加水浸泡1小时，置多功能提取罐中，加水煎煮两次，第一次加总药材5 倍量的水，煎煮2小时，取煎液滤过。第二次加总药材3倍量的水，煎煮1.2小时，取两次煎 液，滤过，取滤液热封袋中，105℃高温灭菌，包装即得。
实施例2
一种具有治疗黄体功能不全性的不孕症和月经失调的中药组合物，它是由下列重量份数 的原料制成：
炒白芍1份   淮山药1份   山茱萸1份   醋柴胡0.5份
莵丝子1份   鹿角片1.5份   紫石英1.5份   紫丹参1份。
2、具有治疗黄体功能不全性的不孕症、月经失调的中药组合物的制备方法，包括以下步 骤：
取炒白芍1份、淮山药1份、山茱萸1份、醋柴胡0.5份、莵丝子1份、鹿角片1.5份、 紫石英1.5份、紫丹参1份，加水浸泡1小时，置多功能提取罐中，加水煎煮两次，第一次 加总药材8倍量的水，煎煮1小时，取煎液滤过。第二次加总药材6倍量的水，煎煮1小时， 取两次煎液，滤过，添加载体乳糖或玉米淀粉，加入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，然后压片 制成片剂。
实施例3
1、一种具有治疗黄体功能不全性的不孕症、月经失调的中药组合物，它是由下列重量份 数的原料制成：
炒白芍3份、淮山药5份、山茱萸3份、醋柴胡1.5份
莵丝子5份、鹿角片3份、紫石英5份、紫丹参3份。
2、具有治疗黄体功能不全性的不孕症、月经失调的中药组合物的制备方法，包括以下步 骤：
首先取炒白芍3份、淮山药5份、山茱萸3份、醋柴胡1.5份、莵丝子5份、鹿角片3 份、紫石英5份、紫丹参3份，第一次加总药材10倍量的水浸泡2小时，然后煎煮1次，每 次2小时，第二次加总药材8倍量的水煎煮1次，1.2小时，合并煎液，滤过，减压浓缩，浓 缩物添加载体乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，然后装胶囊制成胶囊剂。
实施例4
1、一种具有治疗黄体功能不全性的不孕症、月经失调的中药组合物，它是由下列重量份 数的原料制成：
炒白芍2份、淮山药3份、山茱萸2份、醋柴胡1份
莵丝子3份、鹿角片2份、紫石英2份、紫丹参2份。
2、具有治疗黄体功能不全性的不孕症、月经失调的中药组合物的制备方法，包括以下步 骤：
(1)首先取炒白芍2份、淮山药3份、山茱萸2份、醋柴胡1份、莵丝子3份、鹿角片2份、紫 石英2份、紫丹参2份，第一次加总药材8倍量的水浸泡2小时，然后煎煮1次，每次2小时，第 二次加总药材8倍量的水煎煮1次，1小时，合并煎液，滤过，减压浓缩，得浓缩物和稀释剂乳 糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，干燥，制成颗粒剂。
实施例5本发明中药复方组合物(全方组)与拆方组对比实验研究
一、实验材料
(一)实验动物
选用清洁级200-230克(未孕)雌性SD大鼠150只，同种清洁级250-280克雄性SD大 鼠75只，由南京中医药大学动物中心提供。
(二)实验药物及制备
1、根据本发明中药组合物的组方配伍原理，将其重新组合成六种组方进行筛选实验，为 了书写方便，将按顺序编为1号至6号方。具体分别为：
1号方：滋阴方，由淮山药15克、山茱萸10克组成，采用水煎煮后浓缩至每毫升含生 药0.6克，4℃保存备用。
2号方：补阳方，由菟丝子15克，鹿角片10克，紫石英10克组成，采用水煎煮后浓缩 至每毫升含生药0.6克，4℃保存备用。
3号方：养血疏肝方，由炒白芍10克，紫丹参10克，醋炒柴胡5克组成，采用水煎煮 后浓缩至每毫升含生药0.6克，4℃保存备用。
4号方：滋阴补阳方，由淮山药15克，山茱萸10克，菟丝子10克，鹿角片10克，紫 石英10克组成，采用水煎煮浓缩至每毫升含生药0.6克，4℃保存备用。
5号方：滋阴疏肝方，由淮山药15克、山茱萸10克，炒白芍10克，紫丹参10克，醋 炒柴胡5克组成，采用水煎煮浓缩至每毫升含生药0.6克，4℃保存备用。
6号方：补阳疏肝方，由菟丝子15克，鹿角片10克，紫石英10克，炒白芍10克，紫 丹参10克，醋炒柴胡5克组成，采用水煎煮后，浓缩至每毫升含生药0.6克，4℃保存备用。
本发明中药组合物(即全方组实施例4)：炒白芍10克、淮山药15克、山茱萸10克、 醋柴胡5克、莵丝子15克、鹿角片10克、紫石英10克、紫丹参10克，采用水煎煮后，浓 缩至每毫升含生药0.6克，4℃保存备用。
2、米非司酮：上海医药集团有限公司华联制药厂生产，江苏省中医院药房购买，25mg/ 片。制成浓度为每毫升含米非司酮1毫克(1mg/ml)的均一溶液，4℃保存备用，制。按100克 大鼠1毫克的剂量给药。
3、地屈孕酮：苏威制药生产，江苏省中医院药房购买。10mg/片。制成浓度为每毫升含 地屈孕酮0.2毫克(0.2mg/ml)的均一溶液，4℃保存备用。按100克大鼠0.21毫克的剂量给药。 二、实验方法与分组
1、清洁级200-230克雌性SD大鼠，随机分为10组，分别为空白对照组、模型组、西药 对照组、中药1号--6号组，本发明中药复方组合物组(即全方组实施例4)，每组15只，喂 以颗粒饲料(江苏协同医药生物有限公司)，自由饮水。适应性饲养3天后，分别观察每只雌 鼠的性周期，剔除性周期差异大的雌鼠。
造模及给药方法
2、空白对照组：灌服生理盐水，1ml/100g，1次/日，连续8日
模型组：灌服生理盐水，1ml/100g，1次/日，连续8日
西药对照组：动情期后灌服地屈孕酮，0.21mg/100g，(按人与鼠体重比率换算法计算并 经过预试验确定给药剂量)1次/日，连续2日，间隔2日后，再灌服地屈孕酮，0.21mg/100g， 1次/日，连续2日。
1号方组：动情期后灌服制备好的1号方，0.6g(含生药)/100g，1次/日，连续2日， 间隔2日后，再灌服制备好的1号方，0.6g/100g，1次/日，连续2日。
2号方组：动情期后灌服制备好的2号方，0.6g(含生药)/100g，1次/日，连续2日， 间隔2日后，再灌服制备好的2号方，0.6g/100g，1次/日，连续2日。
3号方组：动情期后灌服制备好的3号方，0.6g(含生药)/100g，1次/日，连续2日， 间隔2日后，再灌服制备好的3号方，0.6g/100g，1次/日，连续2日。
4号方组：动情期后灌服制备好的4号方，0.6g(含生药)/100g，1次/日，连续2日， 间隔2日后，再灌服制备好的4号方，0.6g/100g，1次/日，连续2日。
5号方组：动情期后灌服制备好的5号方，0.6g(含生药)/100g，1次/日，连续2日， 间隔2日后，再灌服制备好的5号方，0.6g/100g，1次/日，连续2日。
6号方组：动情期后灌服制备好的6号方，0.6g(含生药)/100g，1次/日，连续2日， 间隔2日后，再灌服制备好的6号方，0.6g/100g，1次/日，连续2日。
本发明提供的中药复方组合物组(即全方组实施例4)：0.6g(含生药)/100g，1次/日， 连续2日，间隔2日后，再灌服制备好的中药复方组合物，0.6g/100g，1次/日，连续2日。
第9日晚起，按雌、雄比例为2：1各组随机予雄鼠每晚6：30合笼，次日晨7：30给雌 鼠做阴道涂片，以发现精子或阴栓为妊娠第一天(D1天)；于妊娠第三天(D3天)，除空白 对照组外，其余各组给米非司酮1mg/100g灌胃，共1次；妊娠第五天(D5天)下午2：00 称重、颈总动脉取血3ml后处死，处死当天禁食、禁药不禁水。
合笼至处死前一天(妊娠第四天)，西药组及各组中药按原剂量给药、所有药物给药时间 均为每天下午2：00-3：00。
三、子宫、卵巢形态学观察:观察各组对子宫内膜的厚度、子宫腺体数目、腺体腔的直径的 影响。
四、Western blot技术分析各组大鼠子宫内膜ER、PR及整合素αv、β3的蛋白水平表达测定情况。 Western blot分析蛋白表达水平操作方法为：
1、从-70℃冰箱取出各组大鼠组织样本，在冰上切除绿豆样大小的组织块于5ml的消毒 离心管中，加入5ml生理盐水洗涤两次，2500转/分钟,离心5分钟，小心吸去上清，沉淀中 加入3ml生理盐水，用高速分散器(上海金达生物仪器厂)超声破碎、混匀组织块。2500 转/分钟,离心5分钟，小心吸去上清，沉淀加入5ml生理盐水洗涤1次。加入1ml生理盐水 混匀后移入1ml离心管中。3000转/分钟，离心5分钟。倒尽上清，沉淀采用细胞角质蛋白 提取液(1％Triton X-100,2×10-5mol/L Tris,6×10-2M KCl,pH＝7.0)，临用前加PMSF至终 浓度为1×10-6M，提取细胞总蛋白质。4℃，12000×g，离心10分钟后取上清。-70℃保存。
2、用BCA法测定蛋白质浓度：①按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1) 配制适量BCA工作液，充分混匀；②完全溶解蛋白标准品，取10μL稀释至100μL，使终 浓度为0.5mg/mL；③将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μL加到96孔板的标准品孔中，加标 准品稀释液补足到20μL；④加适当体积样品到96孔板的样品空中，加标准品稀释液到20 μL；⑤各孔加入200μL BCA工作液，37℃放置30min；⑥测定A562，540-595nm之间的波长 也可接受。根据标准曲线计算出蛋白浓度
3、制备SDS－PAGE：①7.5％分离胶溶液的制备和灌注，在15mL试管中，顺序放入30％ 聚丙烯酰胺溶液2mL，1.5M Tris-HCl(pH8.8)2mL，ddH2O 4mL，10％SDS 9×10-5L， 10％APS 6×10-5L，TEMED 6×10-6L，混匀；立即注入事先装配好的玻璃板的间隙中，灌注 高度约5.5cm，并加入ddH2O进行封闭。于室温下聚合。当水封层与分离胶层之间出现明显 界面时，表示分离胶的聚合已完成；②5％浓缩胶溶液的制备和灌注：在15mL试管中，顺序 加入30％聚丙烯酰胺溶液1mL，1.5M Tris-HCl(pH8.8)1mL，ddH2O 2mL，10％SDS 4×10-5L，10％APS 2×10-5L，TEMED 8×10-6L，混匀；除去水封层并用滤纸吸干。将样品梳固定于 长形玻璃板上端，将配制好的浓缩胶缓缓注入凝胶腔内已聚合的分离胶上面，至样品梳齿槽 内的空隙填满，室温下约30min后，浓缩胶聚合可完成。轻轻拔掉样品梳，将模具安装在电 泳架上，加入以上各拆方组1～6号方和本发明提供的中药复方组合物样品。
4、蛋白质样品的处理：每个蛋白样品取1×10-5L，加入3×10-6L 6×SDS样品缓冲液，2×10-6Lβ-巯基乙醇，总量为1.5×10-5L，混和后100℃煮沸5min。
加样：每泳道加样总体积为1.5×10-5L，且每泳道样品蛋白总量相等。
在电泳槽内加入电泳缓冲液，接通电极，60V稳压电泳；当样品中的溴酚蓝指示剂迁移 到分离胶下游边缘时，停止电泳，关掉电源。
将适当大小的PVDF膜(经甲醇预浸泡)和3mm滤纸浸入转移缓冲液平衡30min，按 照夹心法依次将海绵、滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、滤纸、海绵顺序放好，筛孔板固定，细 心去除夹心内所有气泡，凝胶面向阴极插入电泳槽中，倒入转移缓冲液，100V稳压电转移2 h。
封闭：将硝酸纤维素膜放入5％的封闭液中，置于37℃保温摇床上，均匀低速1h。0.02M  PBST洗涤5min×5次。
第一抗体为1：1000稀释，4℃与PVDF膜共同孵育过夜，0.02M PBST洗涤5min×5次； 第二抗体为羊抗兔IgG-HRP或者羊抗小鼠IgG-HRP，1：1000稀释，37℃孵育1h。0.02M PBST 洗涤，5min×10次。
5、曝光，显影、定影。
五、数据处理
实验所得数据采用SPSS13.5统计分析软件处理，计量资料以表示，采用单因素方 差分析；计数资料采用X2检验分析。实验所得Western blot条带，由Photoshop软件处理后， 采用Bandscan软件对免疫印迹条带扫描后进行半定量分析，并用同一张膜上相应泳道β-肌动 蛋白条的灰度进行校正。以P﹤0.05为显著性差异，P﹤0.01为非常显著性差异。
六、实验结果：
1、本发明提供的中药复方组合物及各拆方组对子宫内膜腺体病理形态学影响具体实验结 果如表1所示：
表1补肾助孕方全方组及各拆方组对子宫内膜腺体病理形态学影响(n＝6)

与正常组相比较*P〈0.01；与模型组相比较#P〈0.01；与模型组相比较**P〈0.01、***P〈0.01；与模型 组相比较##P〈0.01；与本发明全方组比较**P〈0.01、***P〈0.01。
由以上实验结果表明，拆方组:拆方1、2、3、5组：子宫内膜病理改变不明显，内膜厚 度明显变薄，间质和腺体发育明显不同步，腺上皮变薄；卵泡，黄体较少，体积减小，有较 多间质腺。拆方4，6组：子宫内膜病理有一定的改变，内膜上皮排列整齐，间质比较致密， 上皮厚度略变薄，腺体与间质发育较同步，但黄体数目较少，间质少，间质腺少见。而本发 明提供的中药复方组合物(即全方组实施例4)对子宫内膜的厚度、子宫腺体数目、腺体腔 的直径的影响明显优于各拆方组，与模型组相比具有差异，具有统计学意义。
并且从光镜下观察各拆方组子宫内膜的厚度、腺体的数量和腺体腔的直径等结果表明：
模型组与空白对照组比较，均有显著性差异；西药对照组与模型组比较，均有显著性差 异。说明拆方组建立的动物模型是成功的。各拆方组和本发明中药复方组合物组(即全方组 实施例4)相比，卵巢卵泡、黄体较少，体积减小，间质腺较多。进一步表明，本发明优选 得到的中药复方组合物(即全方组实施例4)组，黄体数目较多，间质少，间质腺少见，具 有很好的改善卵巢线粒体内质网的结构和形态、改善子宫内膜腺体和间质的结构，增加腺体 的数量的功效，对黄体功能不全性的不孕症具有很好的治疗效果。
卵巢透射电镜观察结果表明：
空白对照组：见大量的线粒体；内质网排列整齐，数目较多。
模型组：见大量肿胀的线粒体；内质网排列不整齐，数目较少。
各拆方组：小部分线粒体结构完整，大部分粒体肿胀；内质网排列不整齐，数目较少。
本发明优选得到的中药复方组合物：大部分线粒体结构完整，部分粒体肿胀；内质网排 列比较整齐，数目较多。
2、Western blot技术测定大鼠子宫内膜ER、PR及整合素αv、β3的蛋白水平表达的结果与 统计分析
western blot检测本发明中药复方组合物和不同拆方组子宫内膜组织中ER、PR和整合素 α5、β3的表达(每组随机取3个样本做平均)。
实验结果显示：子宫内膜组织样本仅在拆方组2号、4号、6号的intergrinβ3有很低的表 达，而整合素αv不表达，同时子宫内膜组织中ER、PR这两种蛋白均没有表达。
而本发明提供的中药复方组合物(即全方组实施例4)，对子宫内膜ER、PR和整合素αv、 β3均有明显的表达，表明本发明提供的中药复方组合物可有效调节子宫内膜雌激素受体 (ER)、孕激素受体(PR)、整合素αv、β3的表达，具有很好的治疗不孕症的功效。
并且实验结果表明，本发明提供的中药复方组合物(即全方组实施例4)还能增加细胞 间粘附分子1(ICAM-1)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)及基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP-1) 的表达；抑制子宫内膜、卵巢TNF-a、Caspase-3的表达，抑制并改善细胞异常凋亡，增加胚 胎着床期卵巢黄体细胞，另外实验结果表明，本发明提供的中药复方组合物还能有效地下调 胚胎着床期过高的E2水平，发挥很好的治疗不孕症的功效。
以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人了解 本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所做的 等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。