一种活塞形状的骨修复支架及其应用 【技术领域】
本发明涉及一种支架，具体涉及一种骨修复支架及其应用。
背景技术
目前用于颅面部骨组织修复的材料有很多类型，最常用的有高分子多孔聚乙烯、羟基磷灰石、磷酸三钙和钛金属等，这些材料均具有较好的生物相容性和生物安全性，已在临床上应用多年。基于颅面部骨骼结构复杂、形态不规则的特点，这些人工材料根据相应的修复部位被预制成不同的形状，例如眶缘种植体、鼻种植体、耳种植体、颞部种植体、下睑板种植体等。当医生使用这些预制形状的骨修复材料来修复相对应的部位时，无需对材料进行修剪或者只需要进行简单的修剪，就能够满意的修复效果，既方便于手术医生的操作，简化了手术过程，有提高了颅面外形修复的效果。但是对于颅面部一些特殊的部位，例如眼眶壁及颅骨的骨缺损修复，仍然没有一种合适形状的修复材料。
人类眼眶壁骨质菲薄，其中内侧壁仅0.2-0.4mm，下壁0.5-1.0mm，眼眶上壁与颅前窝、额窦相邻；内壁、下壁分别与筛窦、上颌窦毗邻。暴力损伤极易造成眶壁骨折，表现为眶壁的塌陷及碎裂，骨折片掉入副鼻窦中，从而形成眶壁缺损，软组织进而疝入副鼻窦中，造成患者的面部畸形、眼球凹陷、移位及复视、眼球运动受限等视功能异常。因此，必须及时对眶壁缺损进行精确修复。眼眶壁结构的特殊性决定了其修复不同于其他部位的骨胳。由于眶壁菲薄，发生骨折后，无法将碎裂的眶壁重新拼接再用于修复缺损，所以目前的手术方法是将眶内软组织复位后，采用薄片状的自体骨组织或人工材料(高分子多孔聚乙烯、羟基磷灰石和钛金属等)桥架于缺损的骨壁上来达到修复缺损的目的。再根据眼球凹陷或者下移的程度，填充入一定大小及数量的薄片状材料以矫正眼球的位置。目前的修复方法存在两个主要的不足之处：①一块或者数块材料桥架于眶骨壁之上，固定困难，容易发生材料的移位和排出；②材料无法与自体眶壁的骨断端接触吻合，妨碍了新生骨及鼻窦粘膜的爬行替代修复，增加了发生排异及感染的可能性。
同样，目前对于颅骨缺损，也是采用钛网或片状的骨修复材料桥架于正常颅骨之上，再使用钛钉、钛板固定的方法来修复缺损，同样存在上述两个不足之处，增加了发生并发症的危险性。
中国专利文献CN1846793公开了“一种组织工程骨及其构建与应用”，所述的组织工程骨，包括载体支架和种子细胞，种子细胞附着于载体支架上，形成具有骨组织三维结构和生物活性的复合体，所述的载体支架为改性的具有大孔径和高孔隙率并经过去酸化处理的PLGA，其上负载有细胞因子骨形态发生蛋白，即BMP；种子细胞为骨髓基质干细胞。所述的组织工程骨可用于构建修复大段骨缺损的功能性组织工程化骨移植物。中国专利文献CN1973910公开了“一种组织工程骨及其制造方法”。但是，关于活塞形状的骨修复支架方面未见报道。
【发明内容】
本发明的目的在于：
(1)提供一种活塞形状的骨修复支架；
(2)提供一种活塞形状骨修复支架的应用。
本发明的技术方案如下：
一种活塞形状的骨修复支架，其由支架顶部和支架底部组成，所述的支架顶部厚度为0.5-1.5毫米，支架底部厚度为1-2毫米，支架底部周边比支架顶部宽出1-3毫米。
所述的支架顶部厚度为1毫米，支架底部厚度为2毫米，支架底部周边比支架顶部宽出2毫米。
支架顶部和支架底部的材料选自珊瑚、高分子多孔聚乙烯、羟基磷灰石或磷酸三钙中的一种。磷酸三钙是β-磷酸三钙。
支架顶部和支架底部的形状为圆形、长方形或异形，异形是不规则形状。
所述的支架是根据立体光刻模型进行翻模制作得到的，立体光刻模型所需的数据是通过下列方法得到的：CT扫描、通过Medgraphics软件和Magic.RP软件进行三维建模处理、得到计算机三维模型数据。
所述的计算机三维模型中眼眶壁或颅骨缺损的数据作为支架顶部形状模型数据。
所述的立体光刻模型是根据计算机三维模型数据的1.16倍制作。
骨修复支架作为骨修复材料在眼眶壁、颅骨缺损中的应用。
本发明所公开一种活塞形状的骨修复支架及其应用，其优点表现在：骨修复支架为“活塞”形状，用于修复眶壁及颅骨缺损时：支架材料能嵌入骨缺损处，与骨断端良好接触吻合，利于新骨向材料中的爬行与替代；同时能够良好固定，防止支架材料地移动，解决了眶壁及颅骨部位材料固定难的问题。通过CAD/CAM技术对眼眶容积进行测量、模拟眶壁修复手术，可以精确定制个体化的眶壁“活塞”修复材料，在修复眶壁骨缺损的同时矫正眼眶容积的变化，从而使得凹陷或移位的眼球复位。骨修复支架内部结构为多孔，孔和孔之间均相通，有利于复合种子细胞或生长因子，以促进血管化及新骨生成。
【附图说明】
图1A：一种活塞形状的骨修复支架正面图。
图1B：一种活塞形状的骨修复支架侧面图。
图2：一种活塞形状的骨修复支架结构示意图。
图3：犬眶内侧壁造成一直径为10mm的圆形缺损，破坏骨膜和眶隔。
图4：手术植入骨修复支架，支架顶部与内侧壁缺损吻合，支架底部覆盖于眶壁内侧，无需固定。
图5：骨修复支架良好修复犬眶内侧壁骨缺损(CT检查冠状位)。
图6：骨修复支架良好修复犬眶内侧壁骨缺损(CT三维重建)。
图7：骨修复支架在体外复合BMSCs 5天时，扫描电镜观察：支架表面已经完全被细胞所覆盖，细胞增殖旺盛、并分泌胶原纤维。
图8：骨修复支架在体外复合BMSCs5天时，扫描电镜观察：细胞在支架内部帖壁生长，并相互交联形成网状。
图9：骨修复支架复合BMSCs后修复犬眶内侧壁骨缺损，术后CT影像随访见复合物逐渐降解变薄，至3月时已接近正常眶壁厚度(框内区域)。
图10：骨修复支架复合BMSCs后修复犬眶内侧壁骨缺损，术后3月CT三维重建图像见植入物与周围眶壁融为一体、发生骨性连接。
图11：骨修复支架复合BMSCs后修复犬眶内侧壁骨缺损，术后3月大体观察(正面观)眶内侧壁缺损处得到良好修复，植入物不突出于周围眶内侧壁，与周边骨缺损断面吻合良好，结合线已模糊不清。
图12：骨修复支架复合BMSCs后修复犬眶内侧壁骨缺损，术后3月大体观察(侧面观)植入物与周围眶壁呈骨性连接，菲薄，具备生理弧度。
图13A：骨修复支架复合BMSCs后修复犬眶内侧壁缺损3月后，Micro-CT显示植入物与周围眶壁已形成骨性连接，与生理形态下的眶壁相似。
图13B：骨修复支架复合BMSCs后修复犬眶内侧壁缺损3月后在靠近筛窦的植入物表面可见覆盖有完整的粘膜，且可见新生的蜂窝状筛骨纸板。
图14A：骨修复支架复合BMSCs后修复犬眶内侧壁缺损3月后，硬组织切片VAN GIESON-苦味酸品红染色观察：示骨修复支架与眶壁的骨性结合(50×)。
图14B：骨修复支架复合BMSCs后修复犬眶内侧壁缺损3月后，硬组织切片VAN GIESON-苦味酸品红染色观察：示新生骨内残留少量材料(50×)。
图14C：骨修复支架复合BMSCs后修复犬眶内侧壁缺损3月后，硬组织切片VAN GIESON-苦味酸品红染色观察：示新生骨表面有完整的粘膜覆盖，并向筛窦内生长蜂窝状骨组织(50×)。
【具体实施方式】
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
请参照图1A，图1B。
图1A，图1B为一种活塞形状的骨修复支架，该支架由支架顶部1和支架底部2组成，支架顶部1和支架底部2的形状为圆形，支架顶部1直径为10毫米，支架底部2直径为12毫米，支架顶部1厚度为1毫米，支架底部2厚度为2毫米。所述一种活塞形状骨修复支架的制备方法如下：使用树脂模型进行硅橡胶取阴模，将β-磷酸三钙粉末搅拌成糊状后注入模具，放入干燥箱80℃中12小时，然后进行微波烧结一次成型。Co 60(25kGy)消毒后独立包装备用。
实施例2
采用计算机辅助设计和制造的技术，根据具体缺损的形状制备活塞形状的骨修复支架。内容包括：Plug(活塞)形状的骨修复支架的设计；根据骨缺损的具体形状对活塞形状的骨修复支架进行精确预制；通过眼眶容积的计算及手术模拟，来设计特殊形状的眼眶壁骨修复支架；骨修复支架体外复合细胞或(和)生长因子的方法。
一、骨修复支架的设计
将材料设计为“活塞(Plug)“式样(见图2)，由支架顶部1和支架底部2两个部分构成：支架顶部1塞入骨缺损中，支架底部2覆盖于正常骨壁之上。支架顶部1的主要作用是填充骨缺损，并与周围正常骨断端密切接触，有利于新骨的爬行替代；支架底部2的主要作用是固定材料，另外在眶壁修复中还可以根据需要，增加支架底部2的厚度和体积，来增加眼眶容积，以复位眼球。
二、根据骨缺损的具体形状对骨修复支架进行精确预制
首先进行头颅的螺旋CT扫描，层厚为0.625mm，螺距为1.375mm，KV值为200mA；然后进行容积重建，重建厚度为1.25mm，间隔0.4mm。将CT资料以DICOM(Digital Imaging and Communicat ions in Medicine)格式输出，通过Medgraphics软件和Mag ic.RP(Magic Rapid Prototyping)软件进行三维建模处理，得到头颅三维模型，观察并建立眼眶壁或颅骨缺损区域的计算机三维模型。根据骨修复支架的设计原理，将眼眶壁或颅骨缺损模型作为支架顶部1，并在计算机中构建相应的支架底部2部分，得到修复眶壁或颅骨缺损材料的三维模型。然后通过立体光刻(Stereolithography，SLA)快速原型的制作，得到眶壁骨修复材料的树脂“活塞”模型。考虑到后续加工，需对材料进行抛光处理，会损失一部分体积，故本发明采用的SLA模型是根据真实犬头颅CT数据的1.16倍制作，已预留了体积作为后续加工所需要的损耗。使用该树脂模型进行硅橡胶取阴模，将β-TCP粉末搅拌成糊状后注入模具，放入干燥箱80℃中12小时，然后进行微波烧结一次成型。Co 60(25kGy)消毒后独立包装备用。
三、通过眼眶容积的计算及手术模拟，来设计制造特殊形状的眶壁骨修复支架
眼眶容积的计算方法：首先把CT资料转变为“.stl”格式的三维实体文件，然后用Surfacer软件对“.stl”文件进行编辑和操作，从而得到我们需要的眼眶轮廓曲线，并保存为“.igs”格式的文件。最后在UG(Unigraphics)软件中对眼眶的轮廓曲线进行建模后，得到眶内容的实体，该软件可自动计算该实体的体积。
通过对双侧眼眶容积的计算，两侧之差值即为我们需要填充入眶内的材料的体积，也就是我们需要设计的骨修复支架支架底部2的体积。
模拟眶壁骨缺损的修复过程：在计算机中将我们设计的骨修复支架用于修复眼眶三维实体模型的眶壁缺损处，观察支架顶部1与缺损边缘是否能够良好吻合，支架底部2与正常眶壁是否能够良好吻合，逐步调整骨修复支架的形状至符合要求。并计算植入材料后的眼眶容积，确认双侧眶容积的对称。最后根据计算机中构建得到的骨修复支架的三维模型，制造β-TCP修复材料备用。
四、骨修复支架体外复合细胞或(和)生长因子的方法
细胞和骨修复支架的体外复合方法：制备细胞悬液并调整密度为2×107cells/ml。以单细胞悬液滴渗法接种到无菌培养皿中的预制β-TCP支架上，细胞/支架复合体在37℃培养箱(5％CO2，95％O2，100％饱和湿度)中静置4小时，以利于细胞贴壁。之后缓慢加入成骨诱导培养液，充分浸没材料，于上述条件继续培养，每天更换培养液，并在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。体外复合培养5天，制备得到适用于修复眶壁骨缺损的骨修复支架式样组织工程骨，可直接用于眶壁缺损的修复重建。
生长因子和材料的体外复合方法：生长因子可以多种方式附加到材料上，例如：直接添加生长因子，通过缓释技术添加生长因子，通过基因转染的方式(例如：脂质体、腺病毒或基因释放载体等)添加生长因子。这些方式各有优缺点，可根据实际情况来选择。
实施例3
修复犬眼眶壁缺损的骨修复支架设计和制造
一、建立犬眼眶内侧壁缺损模型
选择下睑及内眦皮肤切口，分离皮下组织及肌肉，充分暴露眼眶内侧壁。切开骨膜并用剥离子进行剥离。使用直径10mm的骨科环钻在眶内侧壁筛骨纸板处造成一直径为10mm的圆形全层缺损，破坏骨膜和眶隔使眶内容物嵌顿疝出到筛窦内。
二、根据犬眶壁缺损设计并制作“活塞”状骨修复支架
犬眶壁的骨缺损形状为直径10mm的圆形，根据骨修复支架的设计原理，在计算机中设计眶壁修复材料：支架底部2为直径12mm、厚2mm的圆盘，支架顶部为直径10mm、厚1mm的圆盘。然后根据计算机中设计的三维模型制造SLA快速原型的制作，得到眶壁骨修复材料的树脂骨修复支架模型。考虑到后续加工，需对材料进行抛光处理，会损失一部分体积，故本发明采用的SLA模型是根据真实犬头颅CT数据的1.16倍制作，已预留了体积作为后续加工所需要的损耗。使用该树脂模型进行硅橡胶取阴模，将β-TCP粉末搅拌成糊状后注入模具，放入干燥箱80℃中12小时，然后进行微波烧结一次成型(图1A，B，图2)，并对材料进行内部结构及力学性能的检测。结果显示：制备的β-TCP支架为多孔、较为致密，5ml注射器针尖不能轻易刺入，材料亲水性良好。内部呈均匀的多孔三维结构，平均孔径406.3μm，孔隙率约为84.63％，力学强度＞2Mpa，达到眼眶壁骨修复材料的要求。
三、应用“活塞”状骨修复支架修复犬眼眶骨缺损
将预制骨修复支架形状的β-TCP材料植入犬眶内侧壁骨缺损处(图3，图4)，支架顶部与眶壁缺损处吻合良好，周边与眶壁骨断端密切吻合；支架底部2覆盖于眶壁内侧，起到了良好的固定作用。术后CT检查可以观察到骨修复支架形状的β-TCP材料良好修复犬眶壁缺损(图5，图6)。
实施例4
“活塞”状骨修复支架体外复合骨髓基质干细胞后修复犬眼眶壁缺损一、BMSCs的获取、体外成骨诱导培养及检测：
抽取犬骨髓后分离获得BMSCs，应用添加了β-磷酸甘油、地塞米松及抗坏血酸的α-MEM培养液进行体外成骨诱导培养，以未诱导BMSCs为对照，进行细胞形态学及成骨活性检测。结果显示：犬BMSCs经成骨诱导培养后细胞生长周期以及细胞增殖不受影响，可传至10代以上，细胞形态和增殖率仍与原代基本相似，足够数量作为种子细胞种植载体；ALP、钙结节染色呈强阳性；表达成骨标志性蛋白(OCN，OPN，BSP，Cbfa1、I型胶原等)及成骨相关基因(OCN，OPN，BSP)。而未诱导BMSCs的ALP染色呈弱阳性、钙结节染色阴性，成骨标志性蛋白及相关基因的表达量低于诱导组。
二、BMSCs与眶壁骨修复支架材料体外复合
眶壁的骨修复支架设计和制作同实施例3。
成骨诱导BMSCs细胞培养至第二代时，胰蛋白酶消化后计数离心，制备细胞悬液并调整密度为2×107cells/ml。以单细胞悬液滴渗法接种到无菌培养皿中的预制骨修复支架上，得到细胞/支架复合体。将该复合体在37℃培养箱(5％CO2，95％O2，100％饱和湿度)中静置4小时，以利于细胞贴壁。之后缓慢加入成骨诱导培养液，充分浸没材料，于上述条件继续培养，每天更换培养液。分别于复合4小时、1天、3天、5天和7天，分别取2个细胞材料复合体进行电镜观察。以锐利刀片将其中一个标本切为两个半圆部分，以了解细胞在支架内部的分布增殖情况。结果显示：β-TCP具有良好的多孔三维结构，与BMSCs在体外复合4小时就完成了黏附，较适宜的体外复合培养时间为5天(图7，图8)。
三、细胞-材料复合体修复犬眶内侧壁骨缺损
犬眶内侧壁骨缺损模型建立的方法同实施例1。于眶壁缺损处植入自体诱导BMSCs和β-TCP构建的骨修复支架式样眶壁组织工程骨，骨修复支架顶部与内侧壁缺损吻合，骨修复支架底部覆盖于眶壁内侧，无需固定。随后逐层关闭创口。以自体无诱导BMSCs/β-TCP复合物、单纯β-TCP材料作为对照。术后第一天起青霉素80万单位肌注(每天2次×3天)，预防感染。在处死动物取材前2天采用四环素静脉滴注，对新生骨进行荧光标记。
术后1周、4周、8周、12周分别进行螺旋CT检查和三维重建观察。术后12周取材，进行大体观察、骨密度检测、Micro-CT检查及组织学观察，对结果进行统计分析，评价修复效果。
结果显示：眶壁骨修复支架材料能够与缺损部位良好吻合，固定良好。复合于材料上的成骨诱导BMSC s能够促进成骨。术后CT影像随访见植入物逐渐降解变薄，至3月时已接近正常眶壁厚度(图9，图10)；大体观察眶内侧壁缺损处得到良好修复，植入物不突出于周围眶内侧壁，与周边骨缺损断面吻合良好，结合线已模糊不清(图11，图12)；Micro-CT和组织学检查显示植入物与周围眶壁已形成骨性连接，在靠近筛窦的材料表面可见覆盖有完整的粘膜，且可见新生的蜂窝状筛骨纸板(图13A图13B，图14A，图14B，图14C)；其骨密度为0.16±0.03g/cm2，与正常骨密度(0.11±0.01g/cm2)无显著差别(P＞0.05)。
无需进一步详细阐述，相信阅读了本发明上述公开的内容后，本领域技术人员可最大限度地应用本发明，可作各种改动或修改，因此，前面的实施方案应理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。