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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410752674.7 (22)申请日 2014.12.10 CCTCC NO: M2013240 2013.06.02 A61K 39/07(2006.01) A61K 39/39(2006.01) A61K 9/14(2006.01) A23K 1/17(2006.01) A23K 1/18(2006.01) A61P 31/04(2006.01) A61P 37/04(2006.01) (71)申请人 苏州埃瑞特生物技术有限公司 地址 215433 江苏省苏州市太仓市太仓港经 济技术开发区银港路 52 号 (72)发明人 宋增。
2、福 许维素 (74)专利代理机构 上海卓阳知识产权代理事务 所 ( 普通合伙 ) 31262 代理人 李阳 (54) 发明名称 短小芽孢杆菌和免疫增强剂混合制剂的应用 (57) 摘要 本发明涉及短小芽孢杆菌和免疫增强剂混合 制剂在制备防治水产细菌性病害的生物制剂中的 应用， 所述的混合制剂的有效成分由短小芽孢杆 菌和免疫增强剂组成， 所述的短小芽孢杆菌为具 有群体感应系统抑制作用的短小芽孢杆菌， 保藏 编号为CCTCC M 2013240， 所述的免疫增强剂为维 生素 C、 黄芪、 杜仲、 党参、 当归、 金银花、 柴胡、 乌 梅、 石榴皮和五味子。本发明优点在于 ： 本发明的 混合制剂用于防。
3、治水产细菌性病害， 能够显著提 高鱼体抵抗嗜水气单胞菌的感染能力， 增强养殖 鱼类的机体免疫力， 显著抑制鱼类肠道致病菌的 生长， 促进鱼体快速生长， 提高养殖鱼类的增重率 和抗病力。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 (10)申请公布号 CN 104399074 A (43)申请公布日 2015.03.11 CN 104399074 A 1/1 页 2 1. 短小芽孢杆菌和免疫增强剂混合制剂在制备防治水产细菌性病害的生物制剂中的 应用， 所述的混合制剂的有效成分由短小芽孢杆菌和免疫增强剂组成，。
4、 所述的短小芽孢杆 菌为具有群体感应系统抑制作用的短小芽孢杆菌， 保藏编号为 CCTCC M 2013240， 所述的免 疫增强剂为维生素 C、 黄芪、 杜仲、 党参、 当归、 金银花、 柴胡、 乌梅、 石榴皮和五味子， 所述的 混合制剂中短小芽孢杆菌和免疫增强剂的重量份分别为 ： 短小芽孢杆菌 14-16 份、 维生素 C 10-12 份、 黄芪 7-8 份、 杜仲 4-5 份、 党参 2-4 份、 当归 3-5 份、 金银花 6-8 份、 柴胡 9-10 份、 乌梅 3-5 份、 石榴皮 4-6 份、 五味子 9-10 份。 2. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于， 所述的混合制。
5、剂中短小芽孢杆菌和免疫 增强剂的重量份分别为 ： 短小芽孢杆菌 16 份、 维生素 C 12 份、 黄芪 8 份、 杜仲 5 份、 党参 4 份、 当归 5 份、 金银花 8 份、 柴胡 10 份、 乌梅 5 份、 石榴皮 6 份、 五味子 10 份。 3. 根据权利要求 1-2 任一所述的应用， 其特征在于， 所述的混合制剂的制备方法为将 所述的短小芽孢杆菌经液体发酵或固态发酵制成微生物菌剂， 所述的微生物菌剂中短小芽 孢杆菌活菌数为 109-1011cfu/g， 将所述的微生物菌剂、 维生素 C、 黄芪、 杜仲、 党参、 当归、 金 银花、 柴胡、 乌梅、 石榴皮和五味子分别粉碎过 100。
6、 目筛后， 按照重量份配比混匀， 即得所述 的混合制剂。 4. 根据权利要求 1-2 任一所述的应用， 其特征在于， 所述的混合制剂作为水产饲料添 加剂或水产养殖水体添加剂使用。 5. 根据权利要求 4 所述的应用， 其特征在于， 所述的水产为淡水鱼类。 6. 根据权利要求 4 所述的应用， 其特征在于， 所述的混合制剂在饲料中的添加量为 1 -3。 权 利 要 求 书 CN 104399074 A 2 1/5 页 3 短小芽孢杆菌和免疫增强剂混合制剂的应用 技术领域 0001 本发明涉及微生物领域， 具体地说， 是一种短小芽孢杆菌和免疫增强剂混合制剂 的应用。 背景技术 0002 细菌性疾病。
7、一直是困扰水产养殖业发展的重要原因之一。近年来， 高密度集约化 的生产模式在促进水产业提高产量的同时， 也使得细菌疾病发生的机会增大、 频率增加、 危 害加大 ； 此外， 抗生素使用导致的耐药性、 药物残留以及对生态环境的破坏也成为社会关注 的焦点。 因此， 寻找抗生素的替代药物、 探索新的防治方式已经成为水产病害防治研究重要 方向之一。 0003 群体感应 (Quorum sensing， 简称 QS) 是指细菌能自发产生并释放一些特定的信 号分子， 感知自身浓度的变化， 进而调控相关基因的表达。目前， 调节细菌群体感应的信号 分子主要有三种， (a)N- 酰基高丝氨酸内酯 (AHLs)， 。
8、是广泛存在于革兰氏阴性细菌中的群 体感应的信号分子 ； (b) 自体诱导肽 (Autoinducing peptides， AIP)， AIP 是一类短肽分 子， 是革兰氏阳性细菌中常见的信号分子 ； (c) 自体诱导物类分子 (Auto inducing ， AI2)， 是以费氏弧菌 (Vibrio fi scheri) 为代表的由 luxS 酶催化的 AI 2 系统的信号分子。 研究表明， 在革兰氏阴性细菌中， 如铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)、 嗜水气单胞 菌(Aeromonas hydrophila)等， 其生物被膜形成、 有害毒素产生、 致病因子释放等。
9、行为均受 到 AHLs 类信号分子的调节。Dong(2000) 等人在蜡样芽孢杆菌 (Bacillus cereus) 中发现 了 aiiA 基因， 能够合成 AHLs 信号分子降解酶， 阻断 QS 信号分子在细菌间的传递 ； 尹守亮 等 (2009) 从胶州湾海域筛选出一株能够降解 AHLs 信号分子的真菌， 表明海洋微生物也可 以作为QS抑制剂的潜在研究对象 ； Bhavanath等(2013)发现紫杉状海门冬(Asparagopsis taxiformis) 的粗提物能够降解 AHLs 信号分子， 并且对铜绿假单胞菌生物膜有一定的抑制 作用。Defoirdt 等 (2011) 首次从南美。
10、白对虾和海水鲈鱼等水产动物的肠道中分离出了能 够抑制哈氏弧菌 (Vibrio harveyi)QS 信号分子传递的芽孢杆菌， Natrah 等 (2011) 分离出 一株能够抑制 AHLs 信号分子的微藻， 该微藻能够阻断哈氏弧菌 QS 系统， 降低其致病力。这 些研究为探讨从群体感应角度防控水产细菌性疾病提供了理论依据和科学数据的支撑。 芽 孢杆菌 (Bcaillus sp) 具有易生产、 便运输、 耐储藏等特点， 在水产养殖上可以起到净化水 质、 防治疾病和促进生长等作用， 是常用的益生微生物菌株。 0004 中国专利文献 CN103525723A 公开了一种具有群体感应系统抑制作用的短小。
11、芽孢 杆菌， 具有抑制细菌群体感应的作用， 可用于制备防治水产细菌性病害的微生物制剂。 但是 关于一种具有显著防治水产细菌性病害、 提高存活率的短小芽孢杆菌和免疫增强剂混合制 剂目前还未见报道。 发明内容 0005 本发明的目的是针对现有技术中的不足， 提供一种短小芽孢杆菌和免疫增强剂混 说 明 书 CN 104399074 A 3 2/5 页 4 合制剂的应用。 0006 为实现上述目的， 本发明采取的技术方案是 ： 短小芽孢杆菌和免疫增强剂混合制 剂在制备防治水产细菌性病害的生物制剂中的应用， 所述的混合制剂的有效成分由短小芽 孢杆菌和免疫增强剂组成， 所述的短小芽孢杆菌为具有群体感应系统。
12、抑制作用的短小芽孢 杆菌， 保藏编号为CCTCC M 2013240， 所述的免疫增强剂为维生素C、 黄芪、 杜仲、 党参、 当归、 金银花、 柴胡、 乌梅、 石榴皮和五味子， 所述的混合制剂中短小芽孢杆菌和免疫增强剂的重 量份分别为 ： 短小芽孢杆菌14-16份、 维生素C 10-12份、 黄芪7-8份、 杜仲4-5份、 党参2-4 份、 当归 3-5 份、 金银花 6-8 份、 柴胡 9-10 份、 乌梅 3-5 份、 石榴皮 4-6 份、 五味子 9-10 份。 0007 优选的， 所述的混合制剂中短小芽孢杆菌和免疫增强剂的重量份分别为 ： 短小芽 孢杆菌 16 份、 维生素 C 12 。
13、份、 黄芪 8 份、 杜仲 5 份、 党参 4 份、 当归 5 份、 金银花 8 份、 柴胡 10 份、 乌梅 5 份、 石榴皮 6 份、 五味子 10 份。 0008 优选的， 所述的混合制剂的制备方法为将所述的短小芽孢杆菌经液体发酵或固态 发酵制成微生物菌剂， 所述的微生物菌剂中短小芽孢杆菌活菌数为 109-1011cfu/g， 将所述 的微生物菌剂、 维生素 C、 黄芪、 杜仲、 党参、 当归、 金银花、 柴胡、 乌梅、 石榴皮和五味子分别 粉碎过 100 目筛后， 按照重量份配比混匀， 即得所述的混合制剂。 0009 优选的， 所述的混合制剂作为水产饲料添加剂或水产养殖水体添加剂使用。。
14、 0010 优选的， 所述的水产为淡水鱼类。 0011 优选的， 所述的混合制剂在饲料中的添加量为 1 -3。 0012 本发明优点在于 ： 0013 本发明的混合制剂用于防治水产细菌性病害， 对鱼类的免疫保护率高达 73-90， 能够显著提高鱼体抵抗嗜水气单胞菌的感染能力， 增强养殖鱼类的机体免疫力， 显著抑制 鱼类肠道致病菌的生长， 促进鱼体快速生长， 提高养殖鱼类的增重率和抗病力。 具体实施方式 0014 下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。 0015 本发明提供一种短小芽孢杆菌和免疫增强剂混合制剂， 所述的混合制剂的有效成 分由短小芽孢杆菌和免疫增强剂组成， 所述的短小。
15、芽孢杆菌为具有群体感应系统抑制作用 的短小芽孢杆菌， 保藏编号为 CCTCC M 2013240， 已证实其具有群体感应系统抑制作用。所 述的免疫增强剂为维生素 C、 黄芪、 杜仲、 党参、 当归、 金银花、 柴胡、 乌梅、 石榴皮和五味子， 所述的混合制剂中短小芽孢杆菌和免疫增强剂的重量份分别为 ： 短小芽孢杆菌 14-16 份、 维生素 C10-12 份、 黄芪 7-8 份、 杜仲 4-5 份、 党参 2-4 份、 当归 3-5 份、 金银花 6-8 份、 柴胡 9-10 份、 乌梅 3-5 份、 石榴皮 4-6 份、 五味子 9-10 份。 0016 所述的短小芽孢杆菌 (Baillus。
16、 pumilus)， 保藏单位 ： 中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)， 地址 ： 武汉大学生命科学院保藏中心， 保藏日期 2013 年 6 月 2 日， 保藏编号为 CCTCC NO ： M 2013240。已证实其具有群体感应系统抑制作用。 0017 所述的混合制剂的制备方法为将所述的短小芽孢杆菌经液体发酵或固态发酵制 成微生物菌剂， 所述的微生物菌剂中短小芽孢杆菌活菌数为 109-1011cfu/g， 将所述的微生 物菌剂、 维生素 C、 黄芪、 杜仲、 党参、 当归、 金银花、 柴胡、 乌梅、 石榴皮和五味子分别粉碎过 100 目筛后， 按照重量份配比混匀， 即得所述的混合制剂。 。
17、说 明 书 CN 104399074 A 4 3/5 页 5 0018 实施例 1 短小芽孢杆菌液体发酵 0019 将短小芽抱杆菌菌株按斜面、 液体种子、 液体发酵的顺序培养， 斜面培养基为常规 营养琼脂培养基， 液体种子培养基为常规营养肉汤液体培养基 ； 液体发酵培养基配方 (W/ V) ： 葡萄糖 2， 豆饼粉 8， 玉米浆 1， MgSO47H2O0.02， NaCl 0.4， KH2PO40.1， MnCl20.04， 发酵温度 30， 通风培养 24-48h。得到高浓度的发酵菌液， 其中活菌数 109-1011cfu/g。 0020 也可以将发酵菌液离心去除发酵液， 得到湿菌泥， 添。
18、加抗热保护剂后， 喷雾干燥， 得到固体菌粉， 活菌数 109-1011cfu/g。 0021 实施例 2 短小芽孢杆菌固态发酵 0022 将短小芽抱杆菌菌株按斜面、 液体种子、 固态发酵的顺序培养， 斜面培养基为常规 营养琼脂培养基， 液体种子培养基为常规营养肉汤液体培养基。将种子培养液以 5-10的 接种量接种到固态发酵培养基中进行固态发酵， 发酵时间为 24-48h， 发酵温度 30， 发酵 产物烘干粉碎后， 即得短小芽孢杆菌微生物菌剂。其中活菌数 109-1011cfu/g。 0023 其中固态发酵培养基由料和水组成， 所述的料按总质量分数 100计， 包括米糠 10， 麸皮 25， 豆。
19、粕 32， 玉米粉 30， 酵母提取物 2， NaCl 1， 料水比为 1:1。 0024 实施例 3 混合制剂的制备 0025 将所述的短小芽孢杆菌经固态发酵制成微生物菌剂， 所述的微生物菌剂中短小芽 孢杆菌活菌数为 109-1011cfu/g， 将所述的短小芽孢杆菌菌剂 16 份、 维生素 C 12 份、 黄芪 8 份、 杜仲 5 份、 党参 4 份、 当归 5 份、 金银花 8 份、 柴胡 10 份、 乌梅 5 份、 石榴皮 6 份、 五味子 10 份。分别粉碎过 100 目筛后， 按照重量份配比混匀， 即得所述的混合制剂。 0026 实施例 4 混合制剂的制备 0027 将所述的短小芽。
20、孢杆菌经液体发酵制成微生物菌剂， 所述的微生物菌剂中短小芽 孢杆菌活菌数为 109-1011cfu/g， 将所述的短小芽孢杆菌菌剂 14 份、 维生素 C 10 份、 黄芪 7 份、 杜仲 4 份、 党参 2 份、 当归 3 份、 金银花 6 份、 柴胡 9 份、 乌梅 3 份、 石榴皮 4 份、 五味子 9 份。分别粉碎过 100 目筛后， 按照重量份配比混匀， 即得所述的混合制剂。 0028 实施例 5 混合制剂的制备 0029 将所述的短小芽孢杆菌经固态发酵制成微生物菌剂， 所述的微生物菌剂中短小芽 孢杆菌活菌数为 109-1011cfu/g， 将所述的短小芽孢杆菌菌剂 15 份、 维生。
21、素 C 11 份、 黄芪 7 份、 杜仲 4 份、 党参 3 份、 当归 4 份、 金银花 7 份、 柴胡 10 份、 乌梅 4 份、 石榴皮 5 份、 五味子 10 份。分别粉碎过 100 目筛后， 按照重量份配比混匀， 即得所述的混合制剂。 0030 实施例 6 混合制剂的水体泼洒效果实验 0031 鲫鱼， 购买自江苏徐州淡水鱼养殖中心， 体重 1000.5g， 提前饲喂 10 天， 无任何 嗜水气单胞菌症状。饲料购买自宁波天邦股份有限公司， 按照体重的 3饲喂。 0032 在试验前先驯养一周确定无任合嗜水气单胞菌症状， 然后取体重 (1002.3)g 的 鲫鱼90条， 随机分为三组每组三。
22、个重复， 每组10条， 养殖在70050050mm， 体积90L水族 箱中， 保持水温 16 20。 0033 实验设计三个组， 共 90 条， 每组 10 条， 三个重复， 对照组 ： 在水体中加入培养的嗜 水气单胞菌菌液 100mL( 经稀释后最终菌液浓度达到 108cfu/mL， 在先实验确定嗜水气单胞 菌的绝对致死浓度为1108cfu/mL)， 试验组加入嗜水气单胞菌菌液100mL和实施例3制备 说 明 书 CN 104399074 A 5 4/5 页 6 得到的本发明的混合制剂 10g， 空白组为空白对照水体中不加入任何东西。每隔两天换水， 加入曝过气的自来水， 和重新培养的菌液， 。
23、记录鲫鱼的生长状况以及死亡数。 0034 在两周的饲养周期内， 空白组没有任何的死亡现象 ； 对照组所有样本在 9 天内全 部死亡， 而水体中加入嗜水气单胞菌和本发明的混合制剂的试验组， 在七天后达到稳定， 最 终的存活率为 90。 0035 实施例 7 混合制剂促生长和攻毒实验 0036 生长实验 ： 试验选择健康、 规格、 重量基本一致的鲫鱼， 个体初均重约 50g。随机分 组， 设有对照组、 试验一组、 试验二组、 试验三组和试验四组， 每组设 3 个平行试验， 每平行 组 50 尾试验鱼， 共 6 个网箱 ( 规格为 250cm150cm100cm)。鲫鱼驯化 30d 后， 对照组投 。
24、喂普通饲料， 试验一组投喂添加3.0重量百分比本发明混合制剂(实施例3)的饲料， 试验 二组投喂添加 1.0重量百分比本发明混合制剂的饲料， 试验三组投喂添加 3.0重量百 分比本发明所述短小芽孢杆菌 ( 不包括免疫增强剂的混合制剂 ) 的饲料， 试验四组投喂添 加 3.0重量百分比免疫增强剂 ( 不包括短小芽孢杆菌的免疫增强剂 ) 的饲料， 饲养 56d， 测定其生长的影响。 0037 攻毒实验 ： 对照组、 试验一组、 试验二组、 试验三组和试验四组每组随机抽取 15 尾 鲫鱼。1108cfu/mL 嗜水气单胞菌， 按每 100g 鱼重腹腔注射菌液 1.0ml， 后放养于同样规 格容积的水。
25、泥池网箱中 ( 规格为 100cm100cm100cm)， 并保证充足的氧气， 每天观察鱼 体死亡情况， 观察 10d， 统计存活率。 0038 具体试验结果见下表 1。 0039 表 1 三组增重率和死亡率的对照 0040 对照组试验一组试验二组试验三组试验四组 增重率5.0215.4810.258.349.15 存活率086736153 0041 试验结果表明， 在饲料中添加 3.0、 1.0的本发明混合制剂的试验一组和试验 二组增重率达到15.48和10.25， 与对照组相比， P0.05。 腹腔注射嗜水气单胞菌10d 后， 对照组鲫鱼全部死亡， 而饲喂本发明混合制剂的试验一组和试验二组。
26、最终的存活率分 别为 86和 73， 与对照组相比， P 0.01。同时， 试验一组和试验二组鲫鱼血清中的超氧 化物歧化酶活力、 溶菌酶含量、 抗菌活力等免疫指标都显著高于对照组 (P 0.05)， 肠道中 的细菌总数、 大肠杆菌、 嗜水气单胞菌等致病菌的数量显著低于对照组(P0.05)。 试验一 组的增重率和存活率也显著高于单独使用短小芽孢杆菌或免疫增强剂的试验三组和试验 四组， 显示本发明的混合制剂同时使用具有群体感应系统抑制作用的短小芽孢杆菌和免疫 增强剂， 能够显著提高鱼体抗感染能力， 增强养殖鱼类的机体免疫力， 同时促进鱼体快速生 长。 0042 以上实验结果显示， 本发明的混合制剂本发明的混合制剂用于防治水产细菌性病 害， 对鱼类的免疫保护率高达 73-90， 能够显著提高鱼体抵抗嗜水气单胞菌的感染能力， 增强养殖鱼类的机体免疫力， 显著抑制鱼类肠道致病菌的生长， 促进鱼体快速生长， 提高养 说 明 书 CN 104399074 A 6 5/5 页 7 殖鱼类的增重率和抗病力。 0043 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员， 在不脱离本发明方法的前提下， 还可以做出若干改进和补充， 这些改进和补充也应视为 本发明的保护范围。 说 明 书 CN 104399074 A 7 。