《靶向硼制剂及其制备方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《靶向硼制剂及其制备方法.pdf（18页完整版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410609140.9 (22)申请日 2014.11.03 A61K 51/10(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61K 101/00(2006.01) (71)申请人 苏州大学附属第一医院 地址 215006 江苏省苏州市姑苏区十梓街 188 号 (72)发明人 孙婷 周幽心 王中 (74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限 公司 11227 代理人 赵青朵 (54) 发明名称 靶向硼制剂及其制备方法 (57) 摘要 本发明属于生物医药领域， 公开了一种靶向 硼制剂及其制备方法与应用。本发明所述靶。
2、向硼 制剂由聚酰胺一胺树枝状大分子、 表皮生长因子 受体抗体和多面体硼烷组成， 所述聚酰胺一胺树 枝状大分子上连接所述表皮生长因子受体抗体， 内部负载所述多面体硼烷。本发明所述靶向硼制 剂含硼量高， 能够满足 BNCT 对硼原子剂量的要 求， 对肿瘤细胞靶向性好， 同时稳定性好、 细胞毒 性低， 能够被表面高表达 EGFR 的人胶质瘤 U87MG 细胞有效摄取。本发明所述靶向硼制剂能够有效 提高原位移植瘤裸鼠肿瘤组织内硼的含量， 经中 子照射后明显延长原位移植瘤裸鼠生存期， 适用 于硼中子俘获疗法治疗脑胶质瘤。本发明所述制 备方法操作简单， 制备得到的靶向硼制剂稳定性 好。 (51)Int.C。
3、l. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书13页 附图3页 (10)申请公布号 CN 104399094 A (43)申请公布日 2015.03.11 CN 104399094 A 1/1 页 2 1. 一种靶向硼制剂， 由聚酰胺一胺树枝状大分子、 表皮生长因子受体的抗体和多面体 硼烷组成， 所述聚酰胺一胺树枝状大分子上连接所述表皮生长因子受体的抗体， 内部负载 所述多面体硼烷。 2.一种靶向硼制剂的制备方法， 通过3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和 十一酸马来酰亚胺-酰肼-三氟乙酸盐将聚酰胺一胺树状大分子和表皮生长因子抗体相连 接后。
4、形成功能化树状大分子， 然后负载多面体硼烷得到所述靶向硼制剂。 3. 根据权利要求 2 所述的制备方法， 具体包括以下步骤 ： (1) 表皮生长因子受体抗体与高碘酸钠反应， 得到氧化的表皮生长因子受体抗体 ； (2) 聚酰胺一胺树枝状大分子与 3-(2- 吡啶二巯基 ) 丙酸 N- 羟基琥珀酰亚胺酯反应， 得到中间体 PAMAM-SPDP ； (3) 步骤 (2) 反应得到的中间体 PAMAM-SPDP 与 DTT 反应得到 PAMAM-SH ； (4)步骤(3)反应得到的PAMAM-SH与十一酸马来酰亚胺-酰肼-三氟乙酸盐反应得到 PAMAM-KMUH ； (5) 步骤 (4) 反应得到的 。
5、PAMAM-KMUH 与步骤 (1) 中得到的氧化的 mAbEGFR 偶联得到 PAMAM-mAbEGFR ； (6) 向步骤 (5) 反应得到的 PAMAM-mAbEGFR 中加入多面体硼烷 BSH， 得到所述靶向硼制 剂。 4. 根据权利要求 3 所述的制备方法， 步骤 (1) 中所述的表皮生长因子受体抗体与高碘 酸钠摩尔比为 1 ： 10。 5. 根据权利要求 3 所述的制备方法， 步骤 (2) 中所述的聚酰胺一胺树枝状大分子与 3-(2- 吡啶二巯基 ) 丙酸 N- 羟基琥珀酰亚胺酯的摩尔比为 1 ： 10。 6.根据权利要求3所述的制备方法， 步骤(3)中所述的PAMAM-SPDP与。
6、DTT的摩尔比为 1 ： 10。 7. 根据权利要求 3 所述的制备方法， 步骤 (4) 中所述的 PAMAM-SH 与十一酸马来酰亚 胺 - 酰肼 - 三氟乙酸盐的摩尔比为 1 ： 10。 8.根据权利要求3所述的制备方法， 步骤(5)中所述的PAMAM-KMUH与氧化的表皮生长 因子受体抗体的摩尔比为 10 ： 1。 9. 根据权利要求 3 所述的制备方法， 步骤 (6) 中所述的 PAMAM-mAbEGFR 与多面体硼烷 的质量比为 2 ： 1。 10. 权利要求 1 所述靶向硼制剂在制备硼中子俘获疗法的药物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 104399094 A 2 1/13 页 。
7、3 靶向硼制剂及其制备方法 技术领域 0001 本发明属于生物医药领域， 具体涉及负载多面体硼烷的表皮生长因子抗体耦联树 枝状大分子靶向给药系统及其制备方法， 适用于硼中子俘获疗法治疗脑胶质瘤。 背景技术 0002 脑胶质瘤约占颅内原发肿瘤的 45， 是最常见的颅内原发恶性肿瘤。其特点表现 为肿瘤呈浸润性生长， 肿瘤边界不清， 手术难以彻底切除且术后易复发。 目前认为手术结合 术后放化疗的综合治疗是治疗胶质瘤的最佳方案。 放疗因此成为脑胶质瘤综合治疗的重要 环节之一。 0003 硼中子俘获疗法 (boron neutron capture therapy,BNCT) 是一种理论上可以选 择性杀。
8、伤已经扩散到正常组织中的肿瘤细胞的治疗方法。 当硼(boron-10,10B)受到低能量 中子照射时， 即发生核反应， 产生具有高线性能量转换的 粒子， 杀伤反应的范围在一个 细胞内 (5-9m)， 其本身衰变为锂元素。BNCT 治疗脑胶质瘤临床试验在美国、 日本、 芬兰、 荷兰、 瑞典等国家相继开展， 多数试验结果认为 BNCT 治疗胶质瘤患者平均生存期和 5 年生 存率优于传统的放射治疗。 0004 BNCT 要取得疗效需要特殊的设备 - 产生中子源的反应堆， 鉴于 BNCT 治疗脑胶质 瘤的安全性及临床效果都得到了肯定， 我国于 2005 年在中国工程院周永茂及王忠诚院士 的积极支持下，。
9、 北京凯佰特科技有限公司建造了我国第一台也是世界首台医院中子照射器 (In-Hospital Neutron Irradiator， IHNI-1)。该设备于 2008 年经鉴定后正式运转， 2010 年获批准试运行， 2012 年获得国家核工业部科技进步一等奖 (2012HNJ01D-01)。该设备具 有经济、 安全、 有效、 体积小和操作方便的特点， 动物试验已基本完成， 即将进行临床试验。 0005 BNCT 要取得疗效， 除了有效的中子发射源之外， 关键问题之一是肿瘤细胞内必须 含有足量的 10B 原子， 且肿瘤中10B 原子的浓度与周围正常组织和血液中浓度的比值大于 3 ： 1。目前。
10、研究显示， 向肿瘤细胞运送足量的 10B 原子而尽量减少正常组织的硼含量仍存在问 题。临床试验中允许使用的有两种含 10B 的化合物， 即二羟苯丙氨酸硼 (BPA) 和多面体硼烷 (BSH)， 但效果均不理想。因此合成可增加肿瘤吸收比例的含硼制剂， 对运用硼中子俘获疗 法治疗脑胶质瘤具有重要意义。 发明内容 0006 本发明针对目前应用于 BNCT 临床试验的硼原子携带剂在肿瘤组织富集量较低、 靶向性差的缺点， 提供一种含硼量高的靶向硼制剂。 0007 为实现本发明的目的， 本发明采用如下技术方案 ： 0008 一种靶向硼制剂， 由聚酰胺一胺树枝状大分子、 表皮生长因子受体的抗体和多面 体硼烷。
11、组成， 所述聚酰胺一胺树枝状大分子上连接所述表皮生长因子受体的抗体， 内部负 载所述多面体硼烷。 0009 本发明的另一个目的是提供所述靶向硼制剂的制备方法。 说 明 书 CN 104399094 A 3 2/13 页 4 0010 一种靶向硼制剂的制备方法， 通过 3-(2- 吡啶二巯基 ) 丙酸 N- 羟基琥珀酰亚胺酯 和十一酸马来酰亚胺-酰肼-三氟乙酸盐将聚酰胺一胺树状大分子和表皮生长因子抗体相 连接后形成功能化树状大分子， 然后负载多面体硼烷得到所述靶向硼制剂。 0011 在一些实施方案中， 所述的制备方法， 具体包括以下步骤 ： 0012 (1) 表皮生长因子受体抗体与高碘酸钠反应，。
12、 得到氧化的表皮生长因子受体抗 体 ； 0013 (2)聚酰胺一胺树枝状大分子与3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯反 应， 得到中间体 PAMAM-SPDP ； 0014 (3) 步骤 (2) 反应得到的中间体 PAMAM-SPDP 与 DTT 反应得到 PAMAM-SH ； 0015 (4)步骤(3)反应得到的PAMAM-SH与十一酸马来酰亚胺-酰肼-三氟乙酸盐反应 得到 PAMAM-KMUH ； 0016 (5)步骤(4)反应得到的PAMAM-KMUH与步骤(1)中得到的氧化的mAbEGFR偶联得 到 PAMAM-mAbEGFR ； 0017 (6) 向步骤 (5) 反应得到的。
13、 PAMAM-mAbEGFR 中加入多面体硼烷 BSH， 得到所述靶向 硼制剂。 0018 在一些实施方案中， 所述的制备方法步骤 (1) 中所述的表皮生长因子受体抗体与 高碘酸钠摩尔比为 1 ： 10。 0019 在一些实施方案中， 所述的制备方法步骤 (2) 中所述的聚酰胺一胺树枝状大分子 与 3-(2- 吡啶二巯基 ) 丙酸 N- 羟基琥珀酰亚胺酯的摩尔比为 1 ： 10。 0020 在一些实施方案中， 所述的制备方法步骤 (3) 中所述的 PAMAM-SPDP 与 DTT 的摩尔 比为 1 ： 10。 0021 在一些实施方案中， 所述的制备方法步骤(4)中所述的PAMAM-SH与十一。
14、酸马来酰 亚胺 - 酰肼 - 三氟乙酸盐的摩尔比为 1 ： 10。 0022 在一些实施方案中， 所述的制备方法步骤(5)中所述的PAMAM-KMUH与氧化的表皮 生长因子受体抗体的摩尔比为 10 ： 1。 0023 在一些实施方案中， 所述的制备方法步骤 (6) 中所述的 PAMAM-mAbEGFR 与多面体 硼烷的质量比为 2 ： 1。 0024 本发明的另一个目的是提供所述靶向硼制剂在制备硼中子俘获疗法的药物中的 应用。 0025 与现有技术相比， 本发明至少具有以下有益效果之一 ： 0026 (1) 本发明所述靶向硼制剂将大剂量的多面体硼烷 (BSH) 负载于树枝状大分子空 腔内， 明。
15、显提高了硼原子的给药量， 具有包封率高和载药量高的优点， 能够满足 BNCT 对硼 原子剂量的要求。 0027 (2) 本发明所述靶向硼制剂连接有肿瘤细胞表面高表达的表皮生长因子受体的抗 体 (mAbEGFR)， 对肿瘤细胞有较好的靶向性， 增加肿瘤组织与正常脑组织摄取硼的差异， 减 小中子照射时各种有意义射线对正常脑组织的损伤， 同时稳定性好、 细胞毒性低。 0028 (3) 本发明所述靶向硼制剂能够被表面高表达表皮生长因子受体的人胶质瘤 U87MG 细胞有效摄取。 0029 (4) 本发明所述靶向硼制剂能够有效提高原位移植瘤裸鼠肿瘤组织内硼的含量， 说 明 书 CN 104399094 A。
16、 4 3/13 页 5 经中子照射后明显延长原位移植瘤裸鼠生存期。 附图说明 0030 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案， 下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。 0031 图 1 为实施例 1 制备的 PAMAM-mAbEGFR 的 SDS-PAGE 鉴定结果 ； 0032 图 2 为实施例 3 不同浓度的 PAMAM-mAbEGFR/BSH 对 U87MG 细胞不同时间增殖率的 影响的结果图 ； 其中， 为为0.01mol/L、 为0.1mol/L、 为1mol/L、 为5mol/ L、 为 10mol/L ； 0033 图 3 为实施例 4 荧光。
17、显微镜观察 U87MG 细胞对 PAMAM-mAbEGFR-FITC/BSH 的内吞 情况图， 其中 (a) 为细胞内吞的荧光照片， (b) 为同一视野下光镜照片 ； 0034 图 4 为实施例 6 原位移植瘤裸鼠经 BNCT 后的 Kaplan-Meier 生存曲线 ； 其中对照 组未经任何照射， X 线 5Gy 为经 5Gy X 线照射组， INHI-14MV 组为仅经 4MV INHI-1 照射组， BSH 4MV 组为注射 BSH 后经 4MV INHI-1 照射组， PAB 4MV 组为注射 PAMAM-mAbEGFR/BSH 后 经 4MV INHI-1 照射组， X 线 10Gy。
18、 为经 10Gy X 线照射组， INHI-18MV 组为仅经 8MV INHI-1 照射组， BSH 8MV组为注射BSH后经8MV INHI-1照射组， PAB 8MV组为注射PAMAM-mAbEGFR/ BSH 后经 8MV INHI-1 照射组 ； 0035 图 5 为本发明制备 PAMAM-mAbEGFR/BSH 的路线图。 具体实施方式 0036 下面将结合本发明实施例， 对本发明实施例中的技术方案进行清楚、 完整地描述， 显然， 所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例， 而不是全部的实施例。 基于本发明中的 实施例， 本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实。
19、施例， 都 属于本发明保护的范围。 0037 本发明针对肿瘤细胞对目前临床试验中允许使用的两种 10B 制剂吸收的特异性均 不强的缺点， 提供了一种肿瘤特异性的靶向硼制剂。所述靶向硼制剂为一种负载 BSH 的耦 连 EGFR 抗体的树枝状大分子 (PAMAM-mAbEGFR/BSH)。 0038 为实现本发明的目的， 本发明采用如下技术方案 ： 0039 一种靶向硼制剂， 由聚酰胺一胺树枝状大分子、 表皮生长因子受体的抗体和多面 体硼烷组成， 所述聚酰胺一胺树枝状大分子上连接所述表皮生长因子受体的抗体， 内部负 载所述多面体硼烷。 0040 其中， 多面体硼烷 (BSH) 分子式为 Na2B1。
20、2H11SH， 含有硼原子数远多于含有 1 个硼原 子的二羟苯丙氨酸硼 (BPA)， 本发明所述靶向硼制剂选用 BSH 作为负载硼制剂， 提高肿瘤细 胞吸收硼原子的剂量。 0041 聚酰胺一胺树状大分子 (PAMAM dendrimer) 是一类具有三维结构的高分子， 与传 统的线性聚合物在结构上有着很大的区别， 它由引发核、 内层重复单元和外层端基组成， 具 有高度的几何对称性、 精确的分子结构、 大量的表面官能团和内部空腔。 聚酰胺一胺树状大 分子内部含有大量空间， 且能有效与进入空腔内的小分子复合成紧密的粒子， 在细胞内化 过程中， 缓冲内涵体一溶酶体的酸性环境， 帮助包裹的小分子与树形。
21、分子迅速解离。 经修饰 说 明 书 CN 104399094 A 5 4/13 页 6 的 PAMAM 毒性降低， 转染效率增高。本发明所述靶向硼制剂采用 PAMAM 作为 BSH 的载药分 子， 提高 BSH 的负载量及细胞内吞后的迅速释放。 0042 BNCT 成功的关键是运送足量的 10B 原子到肿瘤细胞， 而尽量减少正常组织的10B 含 量， 所以应用靶向治疗携带 10B原子到肿瘤细胞是一个理想的治疗方法。 表皮生长因子受体 (epidermal growth factor receptor， EGFR) 是一种广泛分布于人体组织细胞膜上的多功 能糖蛋白， EGFR 存在于大多数细胞中。
22、， 在 40的胶质母细胞瘤中呈高表达， 在不同级别胶 质瘤组织中， EGFR 的表达随肿瘤恶性级别的增高而增高， 而正常人脑组织中未见 EGFR 明显 表达， 本发明在所述聚酰胺一胺树枝状大分子上连接所述表皮生长因子受体的抗体， 使得 本发明所述靶向硼制剂对 EGFR 阳性的细胞具有靶向性， 进而提高胶质瘤细胞对本发明所 述靶向硼制剂的吸收， 从而实现硼中子俘获疗法。 0043 本发明所述靶向硼制剂能够靶向性提高肿瘤细胞对 10B 原子的摄取剂量， 增加肿 瘤细胞与周围正常组织 10B 摄取量的差异， 为 BNCT 提供合适的硼原子携带剂。 0044 在一些优选实施方案中， 本发明所述靶向硼制。
23、剂中所述表皮生长因子受体的抗体 为表皮生长因子受体的单克隆抗体。 0045 本发明还提供了所述靶向硼制剂的制备方法。 0046 一种靶向硼制剂的制备方法， 通过 3-(2- 吡啶二巯基 ) 丙酸 N- 羟基琥珀酰亚胺酯 和十一酸马来酰亚胺-酰肼-三氟乙酸盐将聚酰胺一胺树状大分子和表皮生长因子抗体相 连接后形成功能化树状大分子， 然后负载多面体硼烷得到所述靶向硼制剂。 0047 3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)， 分子式为C12H12N2O4S2， 为一 个短链交联剂， 其通过羟基琥珀酰亚胺酯活性基团连接PAMAM分子上的氨基(-NH2)。 十一酸 马来酰亚胺 - 酰肼。
24、 - 三氟乙酸盐 (KMUH) 分子式为 C15H25N3O3CF3CO2H， 为一个长链交联剂， 其通过马来酰亚胺与 PAMAM-SH 分子上的巯基 (-SH) 反应。本发明所述制备方法通过 SPDP 和 KMUH 将表皮生长因子抗体和聚酰胺 - 胺树状大分子 (PAMAM) 相连接后形成功能化树状 大分子， 对多面体硼烷 (BSH) 具有高负载量和稳定性， 在获得良好生物相容性的同时， 增加 肿瘤细胞对 BSH 的吸收剂量。 0048 另一方面树状大分子必须依靠较大的尺寸才能体现出肿瘤细胞的增强渗透滞留 效应 (EPR 效应 ) 以及避免被过早的代谢。尽管高代数的树状大分子拥有较大的尺寸，。
25、 但随 之而来的却是更高的系统毒性。本发明所述制备方法 SPDP 和 KMUH 连接链段的引入可以帮 助直径小于 9nm 的 PAMAM G6.0 以下较低代数的树状大分子在不提高代数的前提下获得较 大的纳米尺寸， 提高整个体系的生物安全性。 0049 在一些实施方案中， 本发明所述靶向硼制剂的制备方法具体包括以下步骤 ： 0050 (1) 表皮生长因子受体抗体与高碘酸钠反应， 得到氧化的表皮生长因子受体抗 体 ； 0051 (2)聚酰胺一胺树枝状大分子与3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯反 应， 得到中间体 PAMAM-SPDP ； 0052 (3) 步骤 (2) 反应得到的中间。
26、体 PAMAM-SPDP 与 DTT 反应得到 PAMAM-SH ； 0053 (4)步骤(3)反应得到的PAMAM-SH与十一酸马来酰亚胺-酰肼-三氟乙酸盐反应 得到 PAMAM-KMUH ； 0054 (5)步骤(4)反应得到的PAMAM-KMUH与步骤(1)中得到的氧化的mAbEGFR偶联得 说 明 书 CN 104399094 A 6 5/13 页 7 到 PAMAM-mAbEGFR ； 0055 (6) 向步骤 (5) 反应得到的 PAMAM-mAbEGFR 中加入多面体硼烷 BSH， 得到所述靶向 硼制剂。 0056 其中， 本发明所述靶向硼制剂的制备方法步骤 (1) 所述表皮生长。
27、因子受体抗体 mAbEGFR 与高碘酸钠 (NaIO4) 反应， 得到氧化的表皮生长因子受体抗体， 使表皮生长因子受 体抗体形成羰基 (C O) 官能团。 0057 在一些优选实施方案中， 所述 mAbEGFR 与 NaIO4 反应为 mAbEGFR 与 NaIO4 在 pH 为 4.5 的 0.1M 醋酸盐缓冲液中混合， 室温反应 2h， 反应混合物脱盐， 用 pH 7.5 的 50mM 磷酸盐 缓冲液洗脱， 得到氧化的表皮生长因子受体抗体。 0058 进一步的， 步骤 (1) 中所述的 mAbEGFR 与 NaIO4 摩尔比优选为 1 ： 10。 0059 在一些优选实施方案中， 本发明所。
28、述靶向硼制剂中所述表皮生长因子受体的抗体 为表皮生长因子受体的单克隆抗体。 0060 本发明所述靶向硼制剂的制备方法步骤 (2) 中聚酰胺一胺树枝状大分子 (PAMAM) 与 3-(2- 吡啶二巯基 ) 丙酸 N- 羟基琥珀酰亚胺酯 (SPDP) 反应， 0061 SPDP 的羟基琥珀酰亚胺酯活性基团与 PAMAM 分子上的氨基 (-NH2) 连接得到中间 体 PAMAM-SPDP。 0062 在一些优选实施方案中， 所述步骤 (2) 中 PAMAM 与 SPDP 反应为 PAMAM 与 SPDP 在 pH7.5 的 0.1M 磷酸盐缓冲液中混合， 室温反应 2h， 反应混合物脱盐， 用 pH。
29、 7.5 的 50mM 磷酸 盐缓冲液洗脱， 得到中间体 PAMAM-SPDP。 0063 进一步的， 步骤 (2) 中所述 PAMAM 与 SPDP 的摩尔比优选为 1 ： 10。 0064 优选的， 本发明所述聚酰胺一胺树枝状大分子为 5.0 代溶液， 其分子量为 28824， 分子末端为氨基 (-NH2)。 0065 本发明所述靶向硼制剂的制备方法步骤 (3)PAMAM-SPDP 与 DTT 反应， DTT 还原 SPDP 分子上的吡啶二硫基， 形成巯基 (-SH)， 得到 PAMAM-SH。 0066 在一些优选实施方案中， 所述步骤 (3) 中 PAMAM-SPDP 与 DTT 反应。
30、为 DTT 溶液与 PAMAM-SPDP 室温反应 30min， 反应混合物脱盐， 用 pH 7.5 的 50mM 磷酸盐缓冲液洗脱， 得到 PAMAM-SH ； 0067 进一步的， 步骤 (3) 中所述的 PAMAM-SPDP 与 DTT 的摩尔比优选为 1 ： 10。 0068 其中， 所述 DTT 溶液的配置方法为 DTT( 购于 Sigma 公司 ) 溶于为 pH 7.5 的 0.1M 磷酸盐缓冲液中， 加入 10 v/v二甲基亚砜 (DMSO)。 0069 优选的， 步骤 (3) 中所述 pH 7.5 的 50mM 磷酸盐缓冲液中含 10v/v DMSO。 0070 本发明所述靶向。
31、硼制剂的制备方法步骤 (4)PAMAM-SH 与十一酸马来酰亚胺 - 酰 肼 - 三氟乙酸盐 (KMUH) 反应， KMUH 中的马来酰亚胺与 PAMAM-SH 分子上的巯基 (-SH) 连接 得到 PAMAM-KMUH。 0071 在一些优选实施方案中， 所述步骤(4)中PAMAM-SH与KMUH反应为将步骤(3)反应 得到的 PAMAM-SH 与 KMUH 在 DMSO 中混合， 室温反应 2h， 反应混合物脱盐， 用 pH 7.5 的 50mM 磷酸盐缓冲液洗脱， 得到 PAMAM-KMUH。 0072 进一步的， 步骤 (4) 中所述的 PAMAM-SH 与 KMUH 的摩尔比优选为 。
32、1 ： 10。 0073 优选的， 步骤 (4) 中所述 pH 7.5 的 50mM 磷酸盐缓冲液中含 10v/v DMSO。 说 明 书 CN 104399094 A 7 6/13 页 8 0074 本发明所述靶向硼制剂的制备方法步骤 (5)PAMAM-KMUH 与步骤 (1) 中得到的氧 化的 mAbEGFR 偶联， PAMAM-KMUH 上的酰肼与氧化的 mAbEGFR 上的羰基 (C O) 反应得到 PAMAM-mAbEGFR ； 0075 在一些优选实施方案中， 所述步骤 (5) 中所述 PAMAM-KMUH 与氧化的 mAbEGFR 偶联 为 PAMAM-KMUH 与氧化的 mAb。
33、EGFR 混合， 室温反应 24h， 得到的偶联物 PAMAM-mAbEGFR。 0076 其中， 步骤 (5) 中所述的 PAMAM-KMUH 与氧化的 mAbEGFR 的摩尔比优选为 10 ： 1。 0077 进一步的， 所述步骤 (5) 还包括对得到的 PAMAM-mAbEGFR 进行浓缩纯化的步骤。 0078 在一些优选实施方案中， 所述浓缩纯化为通过超滤浓缩到 1 ml-2ml， 再使用层析 色谱法纯化， 用 pH 7.5 的 50mM 磷酸盐缓冲液洗脱， 得到 PAMAM-mAbEGFR。 0079 优选的， 所述层析色谱法纯化为 Sephacryl S-300 层析色谱柱纯化。 。
34、0080 优选的， 所述浓缩纯化中所述 pH 7.5 的 50mM 磷酸盐缓冲液中含 10v/v DMSO。 0081 本发明所述靶向硼制剂的制备方法步骤(6)向PAMAM-mAbEGFR中加入多面体硼烷 (BSH)， 负载 10B 原子得到靶向硼制剂。 0082 在一些优选实施方案中， 所述步骤 (6) 中所述向 PAMAM-mAbEGFR 中加入 BSH 为 PAMAM-mAbEGFR 载体溶液置于烧杯中， 向其中逐步加入 BSH， 直至 BSH 不再溶解为止， 放入 25恒温摇床中震荡 24 小时， 得到负载 BSH 的 PAMAM-mAbEGFR 载体 (PAMAM-mAbEGFR/B。
35、SH) 的饱和溶液， 饱和溶液过膜处理， 收集滤液即得靶向硼制剂。 0083 其中， 步骤 (6) 中所述的 PAMAM-mAbEGFR 与 BSH 的质量比优选为 2 ： 1。 0084 优选的， 所述过膜为过 0.22m 的膜。 0085 进一步的， 作为优选， 本发明所述靶向硼制剂的制备方法中步骤 (1)、 (2)、 (3) 和 (4) 中所述的反应混合物脱盐均使用 Sephadex G25 层析色谱柱， 以去除未反应的小分子物 质。 0086 本发明采用 SDS-PAGE 凝胶电泳、 MTT、 荧光显微镜、 中子照射后的抑瘤效应等方法 测试本发明制备的负载的多面体硼烷的耦联表皮生长因子。
36、受体单克隆抗体的树枝状大分 子， 具体测试结果如下 ： 0087 (1)SDS-PAGE 凝胶电泳鉴定 ： 0088 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定结果显示 mAbEGFR 单体 ( 分子量 85KD 左右 ) 的条 带对应的分子量约在 85KD 左右， 合成后的 PAMAM-mAbEGFR 条带的分子量约在 115KD 左右， 且在 85KD 左右无可见条带， 表明经层析纯化后的 PAMAM-mAbEGFR 溶液中不含有未结合的 mAbEGFR。 0089 (2)BSH 在 PAMAM-mAbEGFR/BSH 中承载剂量的确定 ： 0090 绘制硼标准品曲线， 将 PAMAM-mAbEGF。
37、R/BSH 滤液稀释到一定浓度， 用感应耦合等 离子体原子发射光谱仪 (ICP-AES) 检测样品硼的含量。载体中 BSH 的浓度根据载药前后 BSH 的差值来计算， 得出负载在 PAMAM-mAbEGFR 上的 BSH 为 280mg/g。 0091 (3) 细胞毒性考察 ： 0092 将不同浓度的合成材料 PAMAM-mAbEGFR/BSH 与细胞共同孵育不同时间， 通过 MTT 试验检测增殖细胞活性， 结果显示负载BSH的靶向EGFR树枝状大分子对细胞增殖率没有明 显的影响， 各组间无显著差异 (P0.05)， 说明该合成材料有良好的生物相容性， 没有明显的 毒性。 说 明 书 CN 1。
38、04399094 A 8 7/13 页 9 0093 (4) 生物活性检测 ： 0094 将带有绿色荧光的 EGFR 单克隆抗体 mAbEGFR-FITC 代替制备步骤 (1) 中的 mAbEGFR， 使得制备所得负载 BSH 的靶向 EGFR 的树枝状大分子 PAMAM-mAbEGFR-FITC/ BSH 带有绿色荧光。选用 EGFR 表达阳性的 U87MG 细胞作为靶细胞， 通过荧光显微镜观 察细胞对 PAMAM-mAbEGFR-FITC/BSH 的内吞情况。结果显示 PAMAM-mAbEGFR-FITC/BSH 在 1M 时已有 90以上 U87MG 细胞出现绿色荧光， 且强度较高， 说。
39、明此时已摄取大量 PAMAM-mAbEGFR-FITC/BSH。 0095 (5) 稳定性测试 0096 将制备的 PAMAM-mAbEGFR/BSH 溶液放置 -20环境， 分别于 1， 3， 6 个月取样， 观察 溶液性状， 同时进行 BSH 承载量和生物活性检测。结果显示 PAMAM-mAbEGFR 放置不同时间 BSH 的承载量和合成物的生物活性没有没有明显的改变。 0097 (6) 原位移植瘤模型裸鼠体内硼 (10B) 生物分布检测 ： 0098 建立裸鼠原位移植瘤模型， 采用静脉注射和对流增强传送两种方式向肿瘤细胞输 送 PAMAM-mAbEGFR/BSH， 剂量相当于 BSH 1。
40、00mg/kg 体重， 裸鼠分批于注射后 6h、 12h、 24h、 36h 和 48h 收集血液后处死， 分离肿瘤组织、 正常脑组织、 肝脏和肾脏， 采用 ICP-AES 检测样 本中含 10B 的浓度。结果显示高分子 PAMAM-mAbEGFR/BSH 经静脉注射无法到达脑组织和脑 肿瘤组织， 对流增强传送方式给药能够被肿瘤组织大量吸收。 24h时PAMAM-mAbEGFR/BSH在 肿瘤组织内已经明显扩散， 且硼含量符合 BNCT 要求， 此时适合中子照射。 0099 (7)BNCT 的原位移植瘤裸鼠抑瘤效应检测 ： 0100 测试分为对照组 ( 未照射 )、 X 线照射组、 INHI-。
41、1 组 ( 仅用中子照射 )、 BSH 组和 PAMAM-mAbEGFR/BSH 组。体外培养 EGFR 阳性胶质瘤细胞种植后出现明显的颅内移植瘤症 状时用于 BNCT 实验。BSH 在静脉注射后 3h 进行中子照射是目前 BNCT 研究最常用的方式， 此时肿瘤硼浓度较高， 且肿瘤与正常脑组织及肿瘤与血液硼浓度比值适合 BNCT 治疗。其 中 BSH 组裸鼠于静脉注射后 3h 进行中子照射， PAMAM-mAbEGFR/BSH 组裸鼠于对流增强传送 注射后24h进行中子照射， 照射时间点硼浓度使用ICP-AES检测， 结果显示两组硼浓度有明 显差异 (P0.05)， 10mol/L PAMAM。
42、-mAbEGFR/BSH 在 U87MG 细胞中孵育 72h 最大抑制率细 胞增殖9.55， 在最大给药剂量的10倍浓度时仍未达到半数致死量， 说明PAMAM-mAbEGFR/ BSH 细胞毒性较低， 具有良好的生物相容性。 0131 实施例 4 ： 生物活性检测 0132 将 带 有 绿 色 荧 光 的 EGFR 单 克 隆 抗 体 mAbEGFR-FITC 代 替 制 备 步 骤 (1) 中 的 mAbEGFR， 使得制备所得负载多面体硼烷的靶向表皮生长因子受体的树枝状大分子 PAMAM-mAbEGFR-FITC/BSH 带有绿色荧光。其他制备步骤与本发明产品 PAMAM-mAbEGFR/。
43、 BSH 完全相同。EGFR 表达阳性的人神经胶质瘤 U87MG 细胞， 培养于含 10胎牛血清的 高糖 DMEM 培养基中。以 105个 / 孔接种于 6 孔板， 培养 24h 贴壁， 加入含有 1M 的 PAMAM-mAbEGFR-FITC/BSH的无血清培养液， 于37培养24h， PBS清洗两次， 换常规培养液， 荧光显微镜观察细胞对 PAMAM-mAbEGFR-FITC/BSH 的内吞情况， 结果见图 3。 0133 图2结果显示PAMAM-mAbEGFR-FITC/BSH在1M时已有90以上U87MG细胞出现 绿色荧光， 且强度较高， 说明此时已摄取大量 PAMAM-mAbEGFR。
44、-FITC/BSH。 0134 实施例 5 ： 稳定性测试 0135 将实施例1制备的PAMAM-mAbEGFR/BSH溶液放置-20环境， 分别于1， 3， 6个月取 样， 观察溶液性状， 同时进行 BSH 承载量和生物活性检测。测试结果见表 1。 0136 表 1 PAMAM-mAbEGFR 放置不同时间对 BSH 承载量和生物活性测试 0137 时间 ( 月 )BSH 的承载量 (mg/g)U87MG 细胞出现绿色荧光百分率 ( ) 127690 327290 627190 0138 由表 1 结果可见 PAMAM-mAbEGFR 对 BSH 的承载量和合成物的生物活性没有明显的 改变。。
45、 0139 实施例 1 制备的 PAMAM-mAbEGFR/BSH 溶液与实施例 1 的结果相似 PAMAM-mAbEGFR 对 BSH 的承载量和合成物的生物活性没有明显的改变。 0140 实施例 6 ： 原位移植瘤模型裸鼠体内硼 (10B) 生物分布检测。 0141 (1) 制备对比材料 PAMAM/BSH ： 说 明 书 CN 104399094 A 12 11/13 页 13 0142 PAMAM 溶液 1ml(Sigma 公司， 含 PAMAM 50mg) 用双蒸水稀释成 0.5mg/ml， 取 1ml 向其中逐步加入 BSH， 直至 BSH 不再溶解为止， 此时加入 BSH 质量为。
46、 0.2mg。放入 25恒 温摇床中震荡 24 小时， 得到 PAMAM 载体负载的 BSH(PAMAM/BSH) 饱和溶液。饱和溶液过膜 (0.22m) 处理， 除去未溶解的 BSH， 收集滤液。绘制硼标准品曲线， 将 PAMAM/BSH 滤液稀释 到一定浓度， 用 ICP-AES 检测样品硼的含量。载体中 BSH 的浓度根据载药前后 BSH 的差值 来计算， 得出负载在 PAMAM-mAbEGFR 上的 BSH 为 1100mg/g， 即每摩尔 PAMAM 分子负载有 BSH 为 31.7kg(31.7kg/mol)。 0143 (2) 裸鼠原位移植瘤模型的建立 ： 0144 每组 10 。
47、只雄性 Balb/c 裸鼠 4 6w， 体重 18 20g， 经 1戊巴比妥 0.15m1 腹腔 麻醉后， 固定于立体定向仪上， 切开头皮， 在顶枕部钻孔后用微量注射泵 10 min 注入 U87MG 细胞悬液 15l( 含 l106个细胞 )， 骨蜡封闭， 缝合头皮。种植后第 25 天出现明显的颅内 移植瘤症状时用于实验。 0145 (3) 分别经静脉注射和对流增强传送两种方式将药物注射入裸鼠肿瘤内， 相当于 BSH 100mg/kg 体重， 裸鼠分批于注射后 6h、 12h、 24h、 36h 和 48h 收集血液后处死， 分离肿瘤 组织、 正常脑组织、 肝脏和肾脏， 于硝酸与过氧化氢 (。
48、 体积比 3 ： 1) 的混合物 1ml 中 120消 解 2h 至溶液完全透明， 蒸馏水补足体积至 5ml， 采用 ICP-AES 检测样本中含 10B 的浓度。结 果见表 2。 0146 表2不同方式给于PAMAM-mAbEGFR/BSH不同时间硼在原位移植瘤裸鼠体内的生物 分布 (g/g) 0147 0148 注 ： T ： tumor( 肿瘤组织 ) ； N ： normal brain( 正常脑组织 ) ； B ： blood( 血液 ) ； L ： liver( 肝 ) ； 0149 K ： kidney( 肾 ) ； T/N ： 肿瘤 / 正常脑组织 ； T/B ： 肿瘤 / 血。
49、液。 0150 由表 2 可见， 由于血脑屏障的存在， 高分子 PAMAM-mAbEGFR/BSH 经静脉注射无 法到达脑组织和脑肿瘤组织， 对流增强传送方式给药能够被肿瘤组织大量吸收， 24h 时 PAMAM-mAbEGFR/BSH 在肿瘤组织内已经明显扩散， 且硼含量符合 BNCT 要求， 此时适合中子 照射。 0151 制备的对比材料 PAMAM/BSH 也为高分子树枝状载药体， 无法通过血脑屏障， 经对 流增强传送方式将药物注射入裸鼠肿瘤内， 24h 收集血液后处死， ICP-AES 检测各组织硼含 量， 结果如表 3 所示。 说 明 书 CN 104399094 A 13 12/13 页 14。