一种含LNCRNA的药物组合物及其用途.pdf

本发明涉及一种含LncRNA的药物组合物及其用途，该药物组合物为LncRNA重组病毒载体或重组质粒载体包括水溶性填充剂、pH调节剂、稳定剂、注射用水和渗透压调节剂；其重组病毒的制备以人基因组为模板，PCR扩增得到LncRNA序列，亚克隆连入腺病毒载体系统，构建LncRNA过表达病毒；该药物组合物用于预防和治疗肿瘤，促进肿瘤细胞凋亡或降低肿瘤细胞的成瘤能力。本发明原料易得，安全可靠，其制成的药物组合物成分合理，疗效明显，应用范围广。

权利要求书
1.  一种含LncRNA的药物组合物，其特征在于该药物组合物包括LncRNA核苷酸序列重组质粒载体或重组病毒，其LncRNA核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO:1所示的序列，其重组病毒的制备以人基因组为模板，PCR扩增得到LncRNA序列，亚克隆连入腺病毒载体系统，构建LncRNA过表达病毒；所述PCR的引物序列为：
上游引物：5'-UTACAAGTGAACTTTCTTTCCTGTT-3'，
下游引物：5'-TTCCACGTTCAATATTCAAAATGTA-3'；
所述腺病毒载体系统使用Ambion公司的pSi lencer Adeno 1.0-CMV系统；所述重组病毒为含有LncRNA序列的重组腺病毒载体；所述药物组合物为LncRNA重组病毒载体或重组质粒载体包括水溶性填充剂、pH调节剂、稳定剂、注射用水和渗透压调节剂。

2.  根据权利要求1所述的一种含LncRNA的药物组合物，其特征在于所述水溶性填充剂包括甘露醇、低分子右旋糖苷、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖和半乳糖中的一种或多种。

3.  根据权利要求1所述的一种含LncRNA的药物组合物，其特征在于所述pH调节剂为酸、碱或盐；其中，酸选自枸橼酸、磷酸、乳酸、酒石酸或盐酸中的一种或多种；碱选自氢氧化钾、氢氧化钠或氢氧化铵中的一种或多种；盐选自碳酸钠、碳酸钾、碳酸铵盐、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢铵盐中的一种或多种。

4.  根据权利要求1所述的一种含LncRNA的药物组合物，其特征在于所述稳定剂为EDTA-2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、磷酸氢二钾、碳酸氢钠、碳酸钠、精氨酸、谷氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000和十二烷基硫酸钠或三羟甲基氨基甲烷中的一种或多种；所述渗透压调节剂为氯化钠或氯化钾。

5.  根据权利要求1所述的一种含LncRNA的药物组合物，其特征在于药物组合物为片剂、分散片、肠溶片、咀嚼片、口崩片、胶囊、糖衣剂、颗粒剂、干粉剂、口服溶液剂、注射用小水针剂、注射用冻干粉针、大输液或小输液。

6.  根据权利要求1所述的一种含LncRNA的药物组合物，其特征在于药物组合物构成的试剂盒中包括感染滴度1016PFU的过表达LncRNA的重组腺病毒、生理盐水和磷酸盐缓冲液。

7.  一种含LncRNA的药物组合物的用途，其特征在于用于预防和治疗肿瘤、促进肿瘤细胞凋亡或降低肿瘤细胞的成瘤能力。

说明书一种含LncRNA的药物组合物及其用途
技术领域：
本发明属于医药生物技术领域，涉及一种内源性长链非编码RNA的新药及其用途，特别是一种含LncRNA的药物组合物及其用途。
背景技术：
目前，肿瘤已是危害人类健康和生命的重大杀手，全世界有肿瘤病人约1400万，我国每年发病人数约200万，死亡140-150万，且发病人数和死亡人数呈现不断增长的趋势，肿瘤已超过心脑血管疾病成为威胁人类健康的头号杀手。而常用的肿瘤化疗及放疗是通过诱导肿瘤细胞凋亡而达到治疗肿瘤的目的。细胞凋亡，又称程序性细胞死亡，是细胞在特定的内源和外源信号诱导下，遵循自身的程序，发生的受遗传调控的主动的高度有序的自我结束生命的过程，在生物体的进化、维持内环境的稳定以及系统生长发育中起着重要的作用；异常的细胞凋亡将会引起多种疾病的发生，例如过度的细胞凋亡会引发心血管疾病，神经退行性疾病等，而细胞凋亡不足则会诱发肿瘤。但是细胞的凋亡过程调控异常，可抑制化疗药物诱导的凋亡，导致耐药。治疗后耐药性的形成导致对抗肿瘤药物的敏感性降低，从而导致了治疗的失败，因此，化疗药物在治疗肿瘤过程中的耐药性问题已成为目前临床治疗中的重大难题。
随着科技的发展和肿瘤细胞信号传导途经研究的不断深入，以生物靶分子为基础的肿瘤生物治疗成为研究抗肿瘤药物的热点；肿瘤的生物疗法以分子生物学、细胞生物学和分析免疫学为基础，与手术放疗化疗三大常规疗法作用相互补充，大幅提高肿瘤的治疗疗效；将生物技术与放疗化疗结合起来，引入促凋亡的分子可以逆转肿瘤细胞产生的耐药性，增强肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性，从而避免了传统的放疗化疗方法引起的耐药性和毒副作用的缺点，达到治疗肿瘤的效果。本领域迫切需要了解促肿瘤细胞凋亡相关的因子，将其作为药物治疗的靶分子应用于临床的治疗中，因此寻找与促肿瘤细胞凋亡相关的因子与放疗化疗结合治疗肿瘤疾病，具有广阔的前景。
通常，lncRNA是指大于200个核苷酸的非编码RNA，与其他非编码RNA相比较，lncRNA具有类型多、作用模式多和数量多的特点；lncRNA可以通过改变染色质的结构来调节基因的表达，也可以通过顺式或反式方法来沉默或激活一个基因或一个基因家族，甚至整条染色体。由于lncRNA功能很广泛，所以lncRNA与疾病(特别是肿瘤)的关系已经引起了人们的重视。
发明内容：
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，寻求制备一种能够促进肿瘤细胞凋亡的含LncRNA核苷酸序列的药物组合物及其在治疗肿瘤中的用途。
为了实现上述目的，本发明涉及的药物组合物包括LncRNA核苷酸序列重组质粒载体或重组病毒，其LncRNA核苷酸序列如下列SEQ ID NO:1所示：
SEQ ID NO:1：
UUACAAGUGAACUUUCUUUCCUGUUUUAAAGCCUUUUAAAUAAACUUCCACUCCUGUGCUGAAACUUGCCUUAGUCUUUUUUUCUGCUUUAUGCCCCUCAGUCGAAUUCUUUCAUCUGAGGAGGCAAGAAUUGAAGUUGCUGCAGACGCCUGUGGAUUCACCACAAGUACAUUGGAGUAACCACUGGGAACAACAGGUUGCCUUAGAAGCUUUGCAGGUUGUUUUGUUUUUUUGUUUGUUUGUUUUUUUGAGACGGGGUCUCACUUUGUCGCCCAGGUUUGUUGCCCAGGCUGGAGUGCAGUGGCGCAAUCUCGGCUCUCCGCAACCUCUGCCUCCCGGGCUCAAGUGAUCCUCCCACCUCGGCUUCCCGAGUACCUGGGACUACAGGCAUGCACCACCACACCCGGCUAAUUUUAAUUUUUAUUUUGUAUUUUUAGUAGAGUUGGGGUUUCACCAUGUUCCCAGCUGGUCUUGAACUCUUGAGGUGAAGCAAUCCGCCCACCUCAGCCUCCCAAAGUGCUGAGAUUACAGACGUGAGCCAUCGCGCCUAGCCUUGCAAGUUGUUUUUUGUUGAACAGAAGAAGCUAUUCAAAAAUGUCCAGGACUCUGUUAUUUAUUCAGCAAGCUUACAAAGCCAUCUUUGAUUGACUGAUUCUUUGACAAUGACUAUCUGGAUGACACAGGAAGGAUGCAAUUCUGGCCUUGGAGAGAAAACUUGCAAGGAAAGGAACAUGUUUGAAUUUCAGAUGUGUUCCUCAAUGAAUCACGAUCUUCAGGGAAUGUUUCAGGUGGAGGAAGGGGCUCUUGGUCAAUGAGCCUGAAGACUGCAUGGCAACCUUUGCCAGCUUUUGGCCUGAAAACUCAACUUCUUCAUUUGAGAUAAUUCCUGUUUUAUAUACUUUCAUUUGAGAUAUUCCUGGUGUAUCAACUGAAACAAAAUCUAUGAAAUAUCAGAUUCACAAAAAUACAUUUUGAAUAUUGAACGUGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA；其重组病毒的制备以人基因组为模板，PCR扩增得到LncRNA序列，亚克隆连入腺病毒载体系统，构建LncRNA过表达病毒；所述PCR的引物序列为：
上游引物：5'-UTACAAGTGAACTTTCTTTCCTGTT-3'，
下游引物：5'-TTCCACGTTCAATATTCAAAATGTA-3'。
本发明所述腺病毒载体系统使用Ambion公司的pSilencer Adeno 1.0-CMV系统。
本发明涉及的重组病毒载体或重组质粒载体能在治疗宫颈癌降低肿瘤细胞的成瘤能力的药物中应用；所述重组病毒为含有LncRNA序列的重组腺病毒载体。
本发明涉及的药物组合物为LncRNA重组病毒载体或重组质粒载体包括水溶性填充剂、pH调节剂、稳定剂、注射用水和渗透压调节剂；
本发明所述水溶性填充剂包括甘露醇、低分子右旋糖苷、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖和半乳糖中的一种或多种；
本发明所述pH调节剂为生理可接受的酸、碱和/或盐；所述酸选自枸橼酸、磷酸、乳酸、 酒石酸和/或盐酸中的一种或多种；所述碱选自氢氧化钾、氢氧化钠和/或氢氧化铵中的一种或多种；所述盐选自碳酸钠、碳酸钾、碳酸铵盐、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢铵盐中的一种或多种。
本发明所述稳定剂为EDTA-2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、磷酸氢二钾、碳酸氢钠、碳酸钠、精氨酸、谷氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000和十二烷基硫酸钠或三羟甲基氨基甲烷中的一种或多种；所述渗透压调节剂为氯化钠和/或氯化钾。
本发明所述的药物组合物为片剂、分散片、肠溶片、咀嚼片、口崩片、胶囊、糖衣剂、颗粒剂、干粉剂、口服溶液剂、注射用小水针剂、注射用冻干粉针、大输液或小输液。
本发明涉及的药物组合物构成的试剂盒中包括感染滴度1016PFU的过表达LncRNA的重组腺病毒、生理盐水和磷酸盐缓冲液。
本发明所述的药物组合物用于预防和/或治疗肿瘤、促进肿瘤细胞凋亡或降低肿瘤细胞的成瘤能力。
本发明与现有技术相比，其所用生物原料易得，使用安全可靠，其制成的药物组合物成分合理，疗效明显，应用范围广，使用环境友好。
附图说明：
图1为lncRNA在阿霉素处理的Hela细胞、A549细胞和SGC7901细胞中的表达水平变化。
图2为lncRNA在Hela细胞中的促凋亡功能示意图，台盼蓝染色法检测细胞凋亡，NC表示阴性对照。
图3为lncRNA在裸鼠水平上的促凋亡功能示意图。
具体实施方式：
下面结合具体实施例和附图进一步描述本发明。
本实施例中采用的Hela细胞、A549细胞和SGC7901细胞购自ATCC；采用的裸鼠为spf级babl/c小鼠，购自北京医科大学；所用的试验方法均为本领域中所用的常规方法；所用的试剂均为市售分析纯级试剂。
实施例1、
阿霉素处理的Hela细胞、A549细胞和SGC7901细胞中lncRNA的表达水平检测，分别用阿霉素处理Hela细胞、A549细胞和SGC7901细胞0h，1h，3h，6h，12h，24h后收集细胞，用Trizol提取总RNA，采用实时荧光定量PCR的方法对lncRNA的表达水平进行检测，观察在阿霉素处理Hela细胞、A549细胞和SGC7901细胞的过程中lncRNA的表达变化。结果显示随着阿霉素处理Hela细胞时间的增加，lncRNA的表达水平呈现明显上升的趋势； 但是阿霉素处理A549细胞和SGC7901细胞后，lncRNA的表达水平没有显著变化，如附图1。
实施例2、
lncRNA及阴性对照腺病毒构建，本实施例以人基因组为模板，PCR扩增得到lncRNA序列，亚克隆连入Ambion公司的pSilencer Adeno 1.0-CMV系统，构建lncRNA过表达腺病毒。
其LncRNA核苷酸序列如下列SEQ ID NO:1所示：
SEQ ID NO:1：
UUACAAGUGAACUUUCUUUCCUGUUUUAAAGCCUUUUAAAUAAACUUCCACUCCUGUGCUGAAACUUGCCUUAGUCUUUUUUUCUGCUUUAUGCCCCUCAGUCGAAUUCUUUCAUCUGAGGAGGCAAGAAUUGAAGUUGCUGCAGACGCCUGUGGAUUCACCACAAGUACAUUGGAGUAACCACUGGGAACAACAGGUUGCCUUAGAAGCUUUGCAGGUUGUUUUGUUUUUUUGUUUGUUUGUUUUUUUGAGACGGGGUCUCACUUUGUCGCCCAGGUUUGUUGCCCAGGCUGGAGUGCAGUGGCGCAAUCUCGGCUCUCCGCAACCUCUGCCUCCCGGGCUCAAGUGAUCCUCCCACCUCGGCUUCCCGAGUACCUGGGACUACAGGCAUGCACCACCACACCCGGCUAAUUUUAAUUUUUAUUUUGUAUUUUUAGUAGAGUUGGGGUUUCACCAUGUUCCCAGCUGGUCUUGAACUCUUGAGGUGAAGCAAUCCGCCCACCUCAGCCUCCCAAAGUGCUGAGAUUACAGACGUGAGCCAUCGCGCCUAGCCUUGCAAGUUGUUUUUUGUUGAACAGAAGAAGCUAUUCAAAAAUGUCCAGGACUCUGUUAUUUAUUCAGCAAGCUUACAAAGCCAUCUUUGAUUGACUGAUUCUUUGACAAUGACUAUCUGGAUGACACAGGAAGGAUGCAAUUCUGGCCUUGGAGAGAAAACUUGCAAGGAAAGGAACAUGUUUGAAUUUCAGAUGUGUUCCUCAAUGAAUCACGAUCUUCAGGGAAUGUUUCAGGUGGAGGAAGGGGCUCUUGGUCAAUGAGCCUGAAGACUGCAUGGCAACCUUUGCCAGCUUUUGGCCUGAAAACUCAACUUCUUCAUUUGAGAUAAUUCCUGUUUUAUAUACUUUCAUUUGAGAUAUUCCUGGUGUAUCAACUGAAACAAAAUCUAUGAAAUAUCAGAUUCACAAAAAUACAUUUUGAAUAUUGAACGUGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA；
所述PCR的引物序列为：
上游引物：5'-UTACAAGTGAACTTTCTTTCCTGTT-3'，
下游引物：5'-TTCCACGTTCAATATTCAAAATGTA-3'。
按照公司说明书步骤，将PacⅠ线性化的该载体与线性化的腺病毒骨架(AdenovirTs LacZ Backbone)共转染HEK-293细胞，包装腺病毒，扩增收集病毒，测定病毒滴度；将空载体和腺病毒骨架按照上述步骤共转染HEK-293细胞，包装阴性对照腺病毒。
将上述所得的过表达lnc基因的重组体腺病毒用磷酸盐缓冲液稀释为感染滴度1x1016PFU/ml，按1ml量无菌分装到安瓿瓶内，即得。
实施例3、
lncRNA在Hela细胞中的促凋亡功能，本实施例将lncRNA腺病毒(50PFU number/cell)感染Hela细胞，阴性对照腺病毒作为对照，24小时后，以低浓度阿霉素处理，处理24小时后胰酶消化收集细胞，台盼蓝染色计数，计算lncRNA对处理了低浓度阿霉素的Hela细胞的细胞凋亡的影响，观察发现过表达lncRNA的Hela细胞明显增强了对低浓度的阿霉素的敏感性，见附图2。
实施例4、
lncRNA在裸鼠水平上的促凋亡功能实验，本实施例将lncRNA腺病毒感染Hela细胞，阴性对照腺病毒作为对照，24小时后，胰酶消化收集细胞，接种1×107细胞于无胸腺的BALB/c裸鼠背部皮下，至裸鼠皮下瘤块长到500mm3时，于尾静脉注射2mg/kg阿霉素，测量瘤块的体积，按公式：长×宽2/2计算。观察lncRNA在裸鼠水平上的促凋亡功能。观察发现过表达lncRNA的裸鼠肿瘤体积明显的要小于对照组裸鼠肿瘤体积，表明lncRNA在裸鼠水平上能够增强肿瘤细胞对药物的敏感性。见附图3。

序列表
 
SEQ ID NO:1：
UUACAAGUGA ACUUUCUUUC CUGUUUUAAA GCCUUUUAAA UAAACUUCCA CUCCUGUGCU  60
GAAACUUGCC UUAGUCUUUU UUUCUGCUUU AUGCCCCUCA GUCGAAUUCU UUCAUCUGAG  120
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UGUUUUUUUG AGACGGGGUC UCACUUUGUC GCCCAGGUUU GUUGCCCAGG CUGGAGUGCA  300
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CGGCUUCCCG AGUACCUGGG ACUACAGGCA UGCACCACCA CACCCGGCUA AUUUUAAUUU  420
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