一种治疗慢性皮肤溃疡的干细胞制剂及制备方法.pdf

一种治疗慢性皮肤溃疡的干细胞制剂及制备方法，涉及一种干细胞制剂及其制备方法。本发明提供一种治疗慢性皮肤溃疡的干细胞制剂及制备方法。该制剂包括间充质干细胞、富血小板血浆裂解液和法舒地尔溶液。方法：一、对间充质干细胞进行分离纯化，传代培养，取P3代～P5代间充质干细胞；二、对P3代～P5代间充质干细胞进行病毒、无菌、免疫表型、细胞活率、分化功能的检测；三、制备富血小板血浆裂解液；四、间充质干细胞重悬于富血小板血浆裂解液，然后加入法舒地尔溶液，即可得到干细胞制剂；本发明可明显改善伤口愈合并缩短伤口愈合时间。本发明用于治疗慢性皮肤溃疡。

权利要求书
1.  一种治疗慢性皮肤溃疡的干细胞制剂，其特征在于该制剂包括间充质干细胞、富血小板血浆裂解液和法舒地尔溶液，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、羊水间充质干细胞或脂肪间充质干细胞。

2.  根据权利要求1所述的一种治疗慢性皮肤溃疡的干细胞制剂，其特征在于所述法舒地尔溶液的浓度为20mM。

3.  根据权利要求1所述的一种治疗慢性皮肤溃疡的干细胞制剂，其特征在于干细胞制剂中间充质干细胞的终浓度为(0.5～5)×107个细胞/mL。

4.  根据权利要求1所述的一种治疗慢性皮肤溃疡的干细胞制剂，其特征在于干细胞制剂中法舒地尔溶液的终浓度为10～40μmol/L。

5.  如权利要求1所述治疗慢性皮肤溃疡的干细胞制剂的制备方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：
一、对间充质干细胞传代培养，取P3代～P5代间充质干细胞；
二、对P3代～P5代间充质干细胞进行病毒、无菌、免疫表型、细胞活率、分化功能的检测，各项指标合格后用于干细胞制剂的制备；
三、制备富血小板血浆裂解液；
四、间充质干细胞重悬于富血小板血浆裂解液，然后加入浓度为20mM的法舒地尔溶液，得到干细胞制剂，即完成；所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、羊水间充质干细胞或脂肪间充质干细胞；重悬后的富血小板血浆裂解液中含间充质干细胞(0.5～5)×107个/mL。

6.  根据权利要求5所述的治疗慢性皮肤溃疡的干细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤二所述各项指标合格是指：病毒和无菌检测均为阴性，免疫表型的阳性表达率大于95％，阴性表率达小于2％，细胞活率达到95％以上，具有分化功能。

7.  根据权利要求5所述的治疗慢性皮肤溃疡的干细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤三干细胞制剂中法舒地尔溶液的终浓度为10～40μmol/L。

说明书一种治疗慢性皮肤溃疡的干细胞制剂及制备方法
技术领域
本发明涉及一种治疗慢性皮肤溃疡的干细胞制剂及制备方法。
背景技术
皮肤是人体面积最大的器官，是机体与外界的机械屏障，具有复杂的组织结构和多重生理功能。创(烧)伤后皮肤缺损或糖尿病等慢性病所致顽固性皮肤溃疡是临床常见病症之一，及时有效的创面修复是此类患者救治的基础和核心问题。随着组织工程学的拓展，应用干细胞技术有望为创面修复提供新的手段。近年来，间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)在创伤修复方面的作用日益受到各国学者的广泛关注。MSCs是中胚层中具有高度自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，广泛存在于全身多种组织中，可在体外培养扩增，并能在特定条件下分化为神经、汗腺、骨、软骨、脂肪、肝脏、胰腺等多种组织细胞。脂肪、脐血、脐带、羊水、胎盘来源的MSCs具有取材方便，传代能力强，免疫反应低，被污染的概率较小，无伦理学限制等优点，逐渐被人们应用于创面愈合等领域。
创面愈合是一个非常复杂的病理生理过程，大致分为炎症期、增殖期和重塑期。损伤严重时，组织持续缺氧、坏死、重度感染等因素使得创面愈合的3个时期被显著延长，愈合困难。目前的研究表明，MSCs可以不同程度地影响创面愈合的各个阶段，从而加速创面愈合。体内研究表明在炎症期，损伤组织和炎性细胞释放的炎症因子和趋化因子可促进MSCs迁移归巢到创面，MSCs通过分化为创面修复细胞和旁分泌机制发挥抗炎和抗凋亡作用。在增殖期，MSCs也可通过旁分泌机制发挥抗菌和促进创面血管形成等作用而加速创面愈合。在重塑期，MSCs则通过调控创面中I、Ⅲ型胶原比例实现创面的塑形改造。法舒地尔,英文名为Fasudil,别名为HA1077,化学名为六氢-1-(5-磺酰基异喹啉)-1(H)-1,4-氮杂,为细胞内Ca2+拮抗剂，蛋白激酶抑制剂。HA1077为Rho激酶特异性抑制剂，它主要是通过抑制Rho激酶活性而发挥其药理作用。Rho蛋白是细胞的转导通路的信号转换器或分子开关，Rho激活的信号传递与JNK、P38通路有关，而ERK、p38两条信号通路与大鼠骨髓间充质干细胞诱导向表皮细胞分化相关。研究表明，HA1077可以促进骨髓MSCs进入S期，增强MSCs的增殖和分化能力。另外，HAl077也对皮肤缺损创面愈合有促进作用。HAl077联合脂肪、脐血、脐带、羊水、胎盘来源的MSCs治疗难愈性创面将具有良好临床应用前景。
富血小板血浆(PRP)是通过离心全血后得到的血小板的浓缩物，当血小板激活后，α 颗粒释放出多种生长因子，如血小板源性生长因子、转化生长因子、胰岛素样生长因子、血管内皮生长因子等。PRP裂解液中含有较高浓度的生长因子，约为全血中的17倍，其活性可持5-8天。血小板数与生长因子的浓度呈正相关。PRP裂解液中多种生长因子相互作用，诱发了细胞内信号传递系统，可促进细胞生长、分化，从而参与一系列组织修复过程。PRP可促进凝血的作用，也可刺激软组织再生，并促进伤口早期愈合。研究证实这些生长因子还可发挥联合作用和协同作用，影响细胞的趋化、增殖和分化。
目前，较多的干细胞制剂均单纯采用PBS或生理盐水作为细胞制剂的溶剂，在复杂的体内环境中，很大程度上限制了干细胞修复创伤愈合的能力，使治疗效果不尽人意。
发明内容
本发明提供一种治疗慢性皮肤溃疡的干细胞制剂及制备方法。
本发明一种治疗慢性皮肤溃疡的干细胞制剂包括间充质干细胞、富血小板血浆裂解液和法舒地尔溶液，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、羊水间充质干细胞或脂肪间充质干细胞。
上述治疗慢性皮肤溃疡的干细胞制剂的制备方法按以下步骤进行：
一、对间充质干细胞传代培养，取P3代～P5代间充质干细胞；
二、对P3代～P5代间充质干细胞进行病毒、无菌、免疫表型、细胞活率、分化功能的检测，各项指标合格后用于干细胞制剂的制备；
三、制备富血小板血浆裂解液；
四、间充质干细胞重悬于富血小板血浆裂解液，然后加入浓度为20mM的法舒地尔溶液，得到干细胞制剂，即完成；所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、羊水间充质干细胞或脂肪间充质干细胞；重悬后的富血小板血浆裂解液中含间充质干细胞(0.5～5)×107个/mL。
本发明的有益效果：
(1)本发明特点在于汲取了HA1077、PRP裂解液以及脂肪或脐带或者羊水间充质干细胞的长处以及三者的最佳配伍，共同完成制剂对皮肤损伤的再生修复功能。
(2)本发明的间充质干细胞从脐带、脂肪和羊水等组织中获得。间充质干细胞经体外实验证实具有分化为表皮细胞、成纤维细胞以及血管内皮细胞的潜能，具有取材方便，细胞数量多，感染风险小等优点，被广泛研究、应用；脐带和羊水间充质干细胞是从胎儿附属组织中分离出的多能干细胞,具有更强的增殖分化能力、免疫原性低，因此具有更大 的研究价值。
(3)脂肪干细胞具有采集方便、数量多以及对供者伤害小等特点，增加了采集干细胞的人群数量，在获得干细胞的同时还能达到美容瘦身的效果。
(4)本发明的富血小板血浆(Platelet-Rich Plasma，PRP)裂解液中含有高浓度的生长因子，这些生长因子相互协同可扩大生物效应，促进创面愈合及软组织的修复、提高创面愈合质量。本实验获得的PRP裂解液可来自患者自身外周血，采用二次离心的方法制备，可得到更高浓度更高活性的血小板，进而获得高浓度的生长因子，对伤口愈合发挥更大效用。本方法取材操作简单方便，对患者伤害小，同时避免了应用时的免疫排斥反应，在创伤修复领域具有良好的应用前景。
(5)HA1077通过抑制Rho激酶发挥药理作用，而Rho激酶参与了多种细胞功能。HA1077可促进皮肤缺损创面愈合，与间充质干细胞联合使用可增强其向表皮细胞和脂肪细胞增殖分化。干细胞、HA1077与血小板血浆中的各种生长因子发挥联合、协同作用，影响细胞的趋化、增殖和分化，使间充质干细胞发挥更大的作用。
(6)本发明制备的间充质干细胞制剂可通过肌肉点状注射、皮下组织注射或直接喷于患处，操作简单，可明显改善伤口愈合并缩短伤口愈合时间，为皮肤溃疡或伤口愈合开辟新的途径，进而促进皮肤伤口愈合，在临床上具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为试验1中治疗组和对照组的大鼠伤口愈合指数对比情况的柱状图；其中为3d后的各组伤口愈合指数，为7d后的各组伤口愈合指数，为14d后的各组伤口愈合指数；
图2为试验2中治疗组和对照组的大鼠伤口愈合指数对比情况的柱状图；其中为3d后的各组伤口愈合指数，为7d后的各组伤口愈合指数，为14d后的各组伤口愈合指数；
图3为试验3中治疗组和对照组的大鼠伤口愈合指数对比情况的柱状图；其中为3d后的各组伤口愈合指数，为7d后的各组伤口愈合指数，为14d后的各组伤口愈合指数。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式治疗慢性皮肤溃疡的干细胞制剂包括间充质干细胞、富血小板血浆裂解液和法舒地尔溶液，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、羊水间充质干细胞或脂肪间充质干细胞。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述法舒地尔溶液的浓度为20mM。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：干细胞制剂中间充质干细胞的浓度为(0.5～5)×107个细胞/mL。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：干细胞制剂中法舒地尔溶液的浓度为10～40μmol/L。其它与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式治疗慢性皮肤溃疡的干细胞制剂的制备方法按以下步骤进行：
一、对间充质干细胞传代培养，取P3代～P5代间充质干细胞；
二、对P3代～P5代间充质干细胞进行病毒、无菌、免疫表型、细胞活率、分化功能的检测，各项指标合格后用于干细胞制剂的制备；
三、制备富血小板血浆裂解液；
四、间充质干细胞重悬于富血小板血浆裂解液，然后加入浓度为20mM的法舒地尔溶液，得到干细胞制剂，即完成；所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、羊水间充质干细胞或脂肪间充质干细胞；重悬后的富血小板血浆裂解液中含间充质干细胞(0.5～5)×107个/mL。
所述脐带间充质干细胞的制备方法：在无菌工作台内，将脐带通过75％的酒精消毒处理，然后用生理盐水清洗2次，将清洗后的脐带剪成长度为2～3cm的段，然后放在平皿内，剥离华通式胶，再解剖至0.2～2mm的块状，然后在细胞培养瓶中培养，原代培养每3～5d后进行换液，待细胞融合度达到80％以上后，将细胞培养液收集，然后1300rpm离心6min，取上清液；将固相物用生理盐水冲洗两次，然后用体积百浓度为0.25％的胰酶在37℃下消化3min，加入上清液终止胰酶反应，收集细胞，然后在1300rpm离心6min，再收集细胞，然后重新接种到另一培养瓶中进行扩增，最终得到脐带间充质干细胞。
所述脐带间充质干细胞的制备方法：在无菌工作台内，将脐带通过75％的酒精消毒 处理，然后用生理盐水清洗2次，将清洗后的脐带剪成长度为2～3cm的段，然后放在平皿内，剥离华通式胶，再解剖至0.2～2mm3的块状，然后在37℃下经过质量浓度为0.1％～0.2％的胶原酶Ⅰ消化1小时，获得单细胞悬液，计数调节细胞浓度，然后接种于无菌培养瓶中，置于37℃、CO2体积浓度为5％的培养箱中培养，原代培养每3～5d后进行换液，待细胞融合度达到80％以上后，将细胞培养液收集，然后1300rpm离心6min，取上清液；将固相物用生理盐水冲洗两次，然后用体积百分比为0.25％的胰酶在37℃下消化3min，加入上清液终止胰酶反应，收集细胞，然后在1300rpm离心6min，再收集细胞，然后重新接种到另一培养瓶中进行扩增，最终得到脐带间充质干细胞。
所述羊水间充质干细胞的制备方法：在无菌工作台内，取羊水40mL，1300rpm离心6min，弃上清取沉淀，用AmnioMAX II complete羊水专用细胞培养基重悬细胞，按照细胞数为5×104个接种于T25瓶，用AmnioMAX II complete细胞培养基补齐至5ml，置于37℃、CO2浓度为5％的CO2培养箱中培养。细胞培养4～6d后换液，当细胞生长融合度达到80％～90％时，收集细胞重新接种到另一个的培养瓶中进行扩增，最终得到羊水间充质干细胞。
所述脂肪间充质干细胞的制备方法：在无菌工作台内，将抽脂获得的脂肪组织分装在离心管中，1300rpm离心6min，将离心后的上层的大块脂肪组织倒入另一离心管中，加入生理盐水或PBS清洗，于1300rpm离心6min，弃上清取沉淀，以同样的方式反复清洗3-5次。然后加入3倍体积的质量百分含量为0.075％的Ⅰ型胶原酶(取7.5g胶原酶溶于100ml灭菌的去离子水中，0.22微米滤器过滤分装于新的50ml离心管中，使用时100倍稀释)。于37℃水浴锅中，消化15-30min，每5min轻轻晃动摇匀一次。消化结束后，加入与管中液体等量的DMEM终止消化，200目筛网滤过，去除消化后产生的碎片组织，然后1300rpm离心6min，弃上清，加入20ml生理盐水重悬细胞，计数。于1300rpm离心6min，弃上清并加入含10％FBS的DMEM培养基重悬细胞，按2～3×106个细胞/T75培养瓶中，并用含有10％FBS的DMEM将培养瓶中液体补足至11ml，置于37℃、5％的CO2培养箱中培养。原代培养每3～5天换液一次，当细胞生长融合度达到80％时，收集细胞重新接种到另一培养瓶中进行扩增，最终得到脂肪间充质干细胞。
所述富血小板血浆(PRP)裂解液的制备方法：在无菌工作台内，取无传染性、肿瘤性、血液系统疾病病史的外周静脉血200ml，先测全血血小板数>105×109/L，全血以200～7001300r/min离心10min，此时采血管中全血分为三层，即上层上清液，乳白色中间 层和下层红细胞，收集上清液、乳白色中间层以及2mm红细胞层置于新的离心管中，再次700r/min下离心15min，收集1/4黄色上清液即为PRP，全自动血细胞分析仪检测合格后。将PRP分装于EP管中，存于-80℃冰箱内，使用时将PRP从-80℃冰箱取出，迅速投入37℃水浴锅，使其快速解冻。然后离心，取上清液经0.22μm无菌滤器过滤即为富血小板血浆裂解液；其中PRP合格的标准为PRP血小板数要为全血时血小板数的4倍以上。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式五不同的是：步骤二中指标的合格是指：病毒和细菌检测均为阴性，免疫表型阳性表达率在95％以上，阴性表达率低于2％，细胞活率至少为95％。其它与具体实施方式五相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式五或六不同的是：步骤三干细胞制剂中法舒地尔溶液的终浓度为10～40μmol/L。其它与具体实施方式五或六相同。
为验证本发明的有益效果，进行以下实验：
通过以下试验验证本发明的有益效果：
试验1、本试验治疗慢性皮肤溃疡的干细胞制剂的制备方法按以下步骤进行：
一、对脂肪间充质干细胞传代培养，取P3代脂肪间充质干细胞；
二、对P3代脂肪间充质干细胞进行病毒、无菌、免疫表型、细胞活率、分化功能的检测，各项指标合格后用于干细胞制剂的制备；
三、制备富血小板血浆裂解液；
四、脂肪间充质干细胞重悬于富血小板血浆裂解液，然后加入浓度为20mM的法舒地尔溶液得到干细胞制剂，即完成；干细胞制剂中间充质干细胞的浓度为(0.5～5)×107个细胞/mL，干细胞制剂中法舒地尔溶液的浓度为15μmol/L，重悬后的富血小板血浆裂解液中含间充质干细胞(0.5～5)×107个/mL。
步骤一所述脂肪间充质干细胞的制备方法：在无菌工作台内，将抽脂获得的脂肪组织分装在离心管中，1300rpm离心6min，将离心后的上层的大块脂肪组织倒入另一离心管中，加入生理盐水清洗，于1300rpm离心6min，弃上清取沉淀，以同样的方式反复清洗4次。然后加入3倍体积的质量百分含量为0.075％的Ⅰ型胶原酶(取7.5g胶原酶溶于100ml灭菌的去离子水中，0.22微米滤器过滤分装于新的50ml离心管中，使用时100倍稀释)。于37℃水浴锅中，消化25min，每5min轻轻晃动摇匀一次。消化结束后，加入与管中液体等量的DMEM终止消化，200目筛网滤过，去除消化后产生的碎片组织，然后1300rpm离心6min，弃上清，加入20ml生理盐水重悬细胞，计数。于1300rpm离心6min，弃上 清并加入含10％FBS的DMEM培养基重悬细胞，按2～3×106个细胞/T75培养瓶中，并用含有10％FBS的DMEM将培养瓶中液体补足至11ml，置于37℃、5％的CO2培养箱中培养。原代培养每5天换液一次，当细胞生长融合度达到80％时，收集细胞重新接种到另一培养瓶中进行扩增，最终得到脂肪间充质干细胞。
为证明间充质干细胞制剂能够治疗慢性皮肤溃疡的疗效，分别将制备后含有间充质干细胞、PRP裂解液和法舒地尔的干细胞制剂；含有间充质干细胞和富血小板血浆裂解液的干细胞制剂；间充质干细胞和法舒地尔的干细胞制剂；含等量间充质干细胞的制剂分别采用皮内注射进入大鼠皮肤患处。本实验采用SD免疫缺陷鼠，雌雄各半，体重约200～250g，随机分为对照组和治疗组。通过化学方法灼伤建立皮肤损伤模型，随机将治疗组分为A、B、C、D组，分别隔离相同环境下饲养。注射2×106个细胞的间充质干细胞混合液，对照组注入等量生理盐水，隔日追加1次用药，药量同第一次。以上各组治疗开始后3d、7d、14d观察伤口愈合情况，计算伤口愈合指数(WCI)：
WCI(％)＝(1-现创面面积/原创面面积)×100％
具体试验分组如下：
对照组：生理盐水；
治疗A组：本试验制备的脂肪间充质干细胞；
治疗B组：本试验制备的脂肪间充质干细胞+本试验制备的PRP裂解液；
治疗C组：本试验制备的脂肪间充质干细胞+本试验制备的HA1077；
治疗D组：本试验制备的干细胞制剂。
表1各组大鼠创面愈合WCI的比较(平均数±标准差x±s，％)

本试验结果如表1及图1所示，由以上图1和表1可知，本试验制备的干细胞制剂对大鼠创面的治疗效果要优于其他组。
试验2、本试验治疗慢性皮肤溃疡的干细胞制剂的制备方法按以下步骤进行：
一、对羊水间充质干细胞传代培养，取P3代羊水间充质干细胞；
二、对P3代羊水间充质干细胞进行病毒、无菌、免疫表型、细胞活率、分化功能的检测，各项指标合格后用于干细胞制剂的制备；
三、制备富血小板血浆裂解液；
四、羊水间充质干细胞重悬于富血小板血浆裂解液，然后加入浓度为20mM的法舒地尔溶液，再用富血小板血浆裂解液定容至1mL，得到干细胞制剂，即完成；干细胞制剂中间充质干细胞的浓度为(0.5～5)×107个细胞/mL，干细胞制剂中法舒地尔溶液的浓度为20μmol/L，重悬后的富血小板血浆裂解液中含间充质干细胞(0.5～5)×107个/mL。
所述羊水间充质干细胞的制备方法：在无菌工作台内，取羊水40mL，1300rpm离心6min，弃上清取沉淀，用AmnioMAX II complete羊水专用细胞培养基重悬细胞，按照细胞数为5×104个接种于T25瓶，用AmnioMAX II complete细胞培养基补齐至5ml，置于37℃、CO2浓度为5％的CO2培养箱中培养。细胞培养4～6d后换液，当细胞生长融合度达到90％时，收集细胞重新接种到另一个的培养瓶中进行扩增，最终得到羊水间充质干细胞。
具体试验分组如下：
对照组：生理盐水；
治疗A组：本实验制备的羊水间充质干细胞；
治疗B组：本试验制备的羊水间充质干细胞+本试验制备的PRP裂解液；
治疗C组：本试验制备的羊水间充质干细胞+本试验制备的HA1077；
治疗D组：本试验制备的干细胞制剂。
表2各组大鼠创面愈合WCI的比较(平均数±标准差x±s，％)

本试验结果如表2及图2所示，由以上图2和表2可知，本试验制备的干细胞制剂对 大鼠创面的治疗效果要优于其他组。
试验3、本试验治疗慢性皮肤溃疡的干细胞制剂的制备方法按以下步骤进行：
一、对脐带间充质干细胞传代培养，取P5代脐带间充质干细胞；
二、对P5代脐带间充质干细胞进行病毒、无菌、免疫表型、细胞活率、分化功能的检测，各项指标合格后用于干细胞制剂的制备；
三、制备富血小板血浆裂解液；
四、脐带间充质干细胞重悬于富血小板血浆裂解液，然后加入浓度为20mM的法舒地尔溶液，再用富血小板血浆裂解液定容至1mL，得到干细胞制剂，即完成；干细胞制剂中间充质干细胞的浓度为(0.5～5)×107个细胞/mL，干细胞制剂中法舒地尔溶液的浓度为15μmol/L，重悬后的富血小板血浆裂解液中含间充质干细胞(0.5～5)×107个/mL。
所述脐带间充质干细胞的制备方法：在无菌工作台内，将脐带通过75％的酒精消毒处理，然后用生理盐水清洗2次，将清洗后的脐带剪成长度为3cm的段，然后放在平皿内，剥离华通式胶，再解剖至0.2～2mm3的块状，然后在37℃下经过质量浓度为0.1％的胶原酶Ⅰ消化1小时，获得单细胞悬液，计数调节细胞浓度，然后接种于无菌培养瓶中，置于37℃、CO2体积浓度为5％的培养箱中培养，原代培养每3～5d后进行换液，待细胞融合度达到80％以上后，将细胞培养液收集，然后1300rpm离心6min，取上清液；将固相物用生理盐水冲洗两次，然后用体积百分比为0.25％的胰酶在37℃下消化3min，加入上清液终止胰酶反应，收集细胞，然后在1300rpm离心6min，再收集细胞，然后重新接种到另一培养瓶中进行扩增，最终得到脐带间充质干细胞。
具体试验分组如下：
对照组：生理盐水；
治疗A组：本实验制备的脐带间充质干细胞；
治疗B组：本试验制备的脐带间充质干细胞+本试验制备的PRP裂解液；
治疗C组：本试验制备的脐带间充质干细胞+本试验制备的HA1077；
治疗D组：本试验制备的干细胞制剂。
表3各组大鼠创面愈合WCI的比较(平均数±标准差x±s，％)

本试验结果如表3及图3所示，由表3和图3可知，本试验制备的干细胞制剂对大鼠创面的治疗效果要优于其他组。
由试验1、2和3可知，本试验制备的干细胞制剂可明显改善伤口愈合并缩短伤口愈合时间，为皮肤溃疡或伤口愈合开辟新的途径，进而促进皮肤伤口愈合，在临床上具有广阔的应用前景。