抑制肿瘤细胞而不影响正常细胞的药物 【技术领域】
本发明涉及药物组合物和治疗癌症的方法。特别地，涉及包括柔毛水杨梅提取物和药学上可接受的载体的药物组合物及其在治疗癌症中的用途。
背景技术
根据癌症所来源的细胞类型和细胞位置，癌症可以分成数种类型，即：癌(cacinomas)，其发生自覆盖身体外部和内部表面的细胞，例如皮肤、消化道或腺体；白血病，其从血液形成组织例如骨髓开始，并造成大量的异常血细胞产生并进入血流；淋巴癌，其为起源自淋巴结和机体免疫系统的组织的癌症；黑素瘤，其发生在黑素细胞中；肉瘤，其来自骨骼或肌肉的结缔组织；及畸胎瘤，其来自生殖细胞中。
2007年，仅在美国就有超过140万人被诊断患有癌症，而约56万人死于癌症，这仅次于心脏病。当前，常使用细胞毒性药剂抑制或杀伤肿瘤，这种清除针对快速生长细胞包括肿瘤细胞和正常细胞两者。理想地，下一代药剂能够抑制肿瘤细胞而不影响正常细胞。
在治疗癌症方面，植物的应用具有悠久的历史(Cragg GM，NewmanDJ：Medicinals for the millennia：The historical record(千年医药：历史的记录)Ann NY Acad Sci 953：3-25，2001；Newman DJ，Cragg GM，Snader KM：The influence of natural products on drug discovery(天然产物对药物发现的影响)Nat Prod Rep 17：215-234，2000；Cragg GM，Newman DJ，Shader KM：Natural products in drug discovery and development(药物发现和开发中的天然产物)J Nat Prod 60：52-60，1997；Perry，L.M.Medicinal Plants of Eastand Southeast Asia(东亚及东南亚药用植物).Cambridge，Mass：MIT Press，133，(1980))。例如，红豆杉中的紫杉醇适用于卵巢癌和乳腺癌，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效。而长春花中的长春碱可以用于治疗何杰金氏病和绒毛膜上皮癌，疗效较好；对淋巴肉瘤、网状细胞肉瘤、急性白血病、乳腺癌、肾母细胞瘤、卵巢癌、睾丸癌、神经母细胞瘤和恶性黑色素瘤等也有一定疗效。
发明概述
本发明涉及柔毛水杨梅(Geum japonicum)有效成分、尤其是治疗癌症的有效成分的提取方法，包括步骤：a)用选自C1-C4的第一醇溶液对柔毛水杨梅进行提取；任选地b)依次用氯仿和选自C1-C4的第二醇溶液对步骤a)得到的提取物进行提取；和任选地c)对步骤b)得到的提取物进行柱层析，其中使用选自C1-C4的第三醇溶液平衡层析柱，使用选自C1-C4的第四醇溶液洗脱，收集洗脱组分。
另一方面，涉及使用本发明的提取方法产生的柔毛水杨梅提取物。
再一方面，涉及药物组合物，包括本发明的柔毛水杨梅提取物和药学上可接受的载体。
又一方面，涉及本发明的柔毛水杨梅提取物在制备治疗癌症、或者抑制肿瘤细胞生长和/或杀伤肿瘤细胞和/或诱导肿瘤细胞的凋亡或向良性分化的药物上的用途，优选地所述肿瘤细胞为癌症细胞。
【附图说明】
通过参照以下附图，本领域所属技术人员能够很好地理解本发明的特征。
图1表示从柔毛水杨梅分离GJ-B-3的流程图。
图2表示从柔毛水杨梅分离GJ-n-3的流程图。
图3表示50μg/ml浓度下，在处理后不到24小时，GJ-n-3便开始侵袭癌症细胞，并且在48小时内杀死60％-80％的癌症细胞。
图4表示GJ-B-3诱导的HepG2细胞凋亡。图4a.GJ-B-3处理的HepG2细胞(24小时)变得小而圆。图4b.在处理开始时，绿色荧光的强度暗淡。然而，处理24小时下，观察到更多的荧光，从而说明更多的细胞(约90％)在经历凋亡。图4c.用作阴性对照的DMSO处理的HepG2细胞形态不规则。图4d.在用作阴性对照的DMSO处理的HepG2细胞中，没有在核内检测到荧光。
图5表示MIX对肝癌的治疗性作用的评价。在右侧的3只小鼠中，以15μg/ml每日胃内给药3周，MIX明显抑制肿瘤的生长并减小了肿瘤的大小。经比较，胃内仅给H2O的对照具有最大的肿瘤(左侧的3只小鼠)。
图6表示GJ-B-3诱导体内所接种癌症细胞的凋亡。图6a表明与肿瘤细胞共集中的显著更多的荧光。图6b表明来自受治动物的所接种癌症细胞已经开始皱缩、变小并变圆。图6c表明在来自用5％DMSO(GJ-B-3溶剂)处理的动物的肿瘤细胞地核内未显示荧光。图6d表明来自用5％DMSO(GJ-B-3溶剂)处理的动物的肿瘤细胞具有显著更大的尺寸。
图7表示电镜下的肿瘤细胞外观。图7a表明受治肿瘤细胞变得皱缩、更小且更圆，所观察细胞的表面几乎没有微绒毛。图7b表明未治疗HepG2细胞的外形是不规则的，肿瘤细胞的尺寸显著更大。未治疗肿瘤细胞的表面有丰富的微绒毛。
图8表示MIX诱导的体内癌细胞凋亡和免疫反应。图8a显示MIX处理的癌症细胞。图8b是图8a上框部分的放大图，图8a和图8b表明受治肿瘤显著地显示癌症细胞凋亡，存活的只是外面很薄的一层和里面的少数团块。图8c是图8a下框部分的放大图，图8a和图8c表明受治肿瘤周围出现许多淋巴细胞。图8d显示作为对照的肿瘤细胞。图8e是图8d上框部分的放大图。图8d和图8e表明采自对照个体的肿瘤具有大量存活的癌细胞。图8f是图8d下框部分的放大图。图8d和图8f表明对照肿瘤周围几乎没有淋巴细胞。
【具体实施方式】
本发明提供柔毛水杨梅有效成分、尤其是治疗癌症的有效成分的提取方法，包括步骤：a)用选自C1-C4的第一醇溶液对柔毛水杨梅进行提取，任选地包括步骤：b)依次用氯仿和选自C1-C4的第二醇溶液对步骤a)得到的提取物进行提取，以及任选地包括步骤：c)对步骤b)得到的提取物进行柱层析，其中使用选自C1-C4的第三醇溶液平衡层析柱，使用选自C1-C4的第四醇溶液洗脱，收集洗脱组分。
在一个优选的实施方式中，本发明提供柔毛水杨梅有效成分、尤其是治疗癌症的有效成分的提取方法，包括步骤：a)用选自C1-C4的第一醇溶液对柔毛水杨梅进行提取；b)依次用氯仿和选自C1-C4的第二醇溶液对步骤a)得到的提取物进行提取；和c)对步骤b)得到的提取物进行柱层析，其中使用选自C1-C4的第三醇溶液平衡层析柱，使用选自C1-C4的第四醇溶液洗脱，收集洗脱组分。
本发明的提取方法还可以任选地包括对所述提取物浓缩和/或部分纯化的步骤。
在本发明的实施方式中，所述步骤a)的柔毛水杨梅包括但不限于野生或种植的柔毛水杨梅以及遗传改造的柔毛水杨梅，其植株和其离体培养物，及其一个或多个部分。所述柔毛水杨梅离体培养物例如是柔毛水杨梅原生质体，又例如是柔毛水杨梅愈伤组织。
在本发明的实施方式中，第一醇溶液是甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇或叔丁醇，或其与水的混合物。例如，第一醇溶液是70％的乙醇。第一醇溶液相对于待提取柔毛水杨梅的用量，优选为待提取柔毛水杨梅重量的1-20倍，更优选1-10倍，最优选10倍。
在本发明的实施方式中，所述步骤a)的提取可以是浸泡或渗滤。
在本发明的实施方式中，步骤a)在通常的提取温度下进行，优选在室温下进行。步骤a)的提取可以进行多达数天，例如进行3天。步骤a)的提取可以是重复多次的提取，所得提取物可以是多次重复后合并的产物。步骤a)的提取物可以是经过干燥的提取物，例如是喷雾干燥后的固体残留物。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述步骤b)的提取包括首先将步骤a)的提取物溶于或混悬于与氯仿不相溶的溶剂。特别地，首先将步骤a)的提取物溶于或混悬于水。特别地，步骤b)的氯仿相对于所述步骤a)的提取物的溶液或混悬液的用量为体积比不小于1，优选为等体积。
第二醇溶液是甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇或叔丁醇，或其与水的混合物。例如，第二醇溶液是正丁醇。第二醇溶液相对于氯仿的用量优选体积比不小于1，更优选等体积。
在本发明的一些实施方式中，步骤b)的提取可以是重复多次的提取，例如重复2次。步骤b)的提取可以是萃取。步骤b)得到的提取物，即所述第二醇溶液提取物可以是过滤并干燥的提取物，其中干燥例如是喷雾干燥。
本发明所述步骤c)的层析柱的类型可以是任何用于对中药提取物进行层析的可商业购买的柱子。例如，所述层析柱是Sephadex，或DiaionHP20和反相柱。
在本发明的一些实施方式中，第三醇溶液是甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇或叔丁醇，或其与水的混合物。第四醇溶液是甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇或叔丁醇，或其与水的混合物。第三醇溶液和第四醇溶液可以是相同的醇溶液。
在一个实施方案中，所述柱层析使用10％乙醇溶液平衡的SephadexLH-20柱，用梯度浓度渐增的乙醇溶液洗脱，所述浓度选自10％-100％，并收集洗脱组分。特别地，采用浓度范围为20％-100％且梯度为10％的乙醇溶液洗脱，收集约30％乙醇溶液洗脱的组分。
在另一个实施方案中，所述柱层析使用10％甲醇溶液平衡的Sephadex LH-20柱，使用梯度浓度渐增的甲醇溶液洗脱，所述浓度选自10％-100％，并收集洗脱组分。特别地，采用浓度范围为10％-100％且梯度为10％的甲醇溶液洗脱，收集约20％-40％甲醇溶液洗脱的组分。特别地，采用浓度范围为10％-100％且梯度为10％的甲醇溶液洗脱，收集约30％-50％甲醇溶液洗脱的组分。
另一方面，提供使用本文上述的提取方法产生的柔毛水杨梅提取物。
本发明的柔毛水杨梅提取物可以是主要含有单宁类和三萜皂苷类的提取物。
本发明的柔毛水杨梅提取物抑制肿瘤细胞生长和/或杀伤肿瘤细胞和/或诱导肿瘤细胞的凋亡或向良性分化，但不影响或损伤正常细胞，即特异性抑制肿瘤细胞生长和/或杀伤肿瘤细胞和/或诱导肿瘤细胞的凋亡或向良性分化。本文所述肿瘤指良性或恶性肿瘤，优选所述肿瘤细胞指癌症细胞。本文所用术语“正常细胞”是尚未异常增殖而转变为肿瘤细胞的细胞。
另一方面，涉及药物组合物，包括本发明的柔毛水杨梅提取物和药学上可接受的载体。优选地，所述药物组合物包括0.1-1倍的治疗有效量的柔毛水杨梅提取物。
再一方面，涉及本发明的柔毛水杨梅提取物在制备药物或药物组合物中的用途，所述药物或药物组合物用于治疗癌症，或者用于抑制肿瘤细胞生长和/或杀伤肿瘤细胞和/或诱导肿瘤细胞的凋亡或向良性分化。
治疗有效量是足以诱发对受治个体的治疗性作用的量。治疗有效量的变化取决于受治疾病类型、给药途径、药学上可接受的载体以及与其它治疗性疗法的可能的共同应用。
在一些实施方式中，本发明的柔毛水杨梅提取物是药物组合物中唯一的治疗活性成分。
在另一些实施方式中，本发明的药物组合物还包括其他治疗活性成分。例如，本发明的药物组合物还包括其他细胞毒性药剂，所述细胞毒性药剂选自放射性同位素、化疗剂和毒素。
药学上可接受的载体包括在药物制剂中的非治疗活性成分，例如与药物给药相容的任何和所有溶剂、分散介质、包被物、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂。
本领域技术人员已知将柔毛水杨梅提取物组方成或配制成药物制剂的方法，例如在美国药典以及类似参考文献中描述或指出的标准方法。本发明的药物组合物可以以各种剂型存在，包括但不限于片剂、丸剂、悬浮剂、霜剂和糊剂。
所述癌症是诸如大鼠、小鼠和灵长类的哺乳动物的癌症，优选是人的癌症。
所述癌症包括但不限于前列腺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、肺癌、肾癌、膀胱癌和/或结肠直肠癌。特别地，所述癌症是前列腺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌和肺癌的一种或多种。在优选实施方式中，所述癌症是前列腺癌、乳腺癌和肺癌的一种或多种。
所述癌症包括原发性癌症和转移性癌症。
所述癌症的治疗包括抑制肿瘤细胞生长和/或杀伤肿瘤细胞和/或诱导肿瘤细胞的凋亡或向良性分化。肿瘤细胞生长的抑制和/或肿瘤细胞的杀伤可以通过免疫系统进行，例如通过淋巴细胞进行。肿瘤细胞的凋亡诱导可以通过激活诸如caspase-8的凋亡相关蛋白来完成。所述肿瘤细胞包括但不限于前列腺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、肺癌、肾癌、膀胱癌和结肠直肠癌的肿瘤细胞。
所述癌症的治疗可以是无副作用的。所述副作用包括但不限于，消化障碍出现的胃腹胞胀、食欲减退、恶心干呕、腹泻等；骨髓抑制所出现的白细胞下降、血小板减少、贫血；机体衰弱导致的全身疲乏、四肢无力、精神不振、甚至心慌、气短、失眠、出虚汗、口干舌燥及脱发；以及发烧，患部疼痛、静脉炎、口腔炎、食管粘膜充血水肿及溃疡等炎症反应。
所述癌症的治疗可以是无副作用的。在细胞水平上，抑制肿瘤细胞生长和/或杀伤肿瘤细胞和/或诱导肿瘤细胞的凋亡或向良性分化可以不伴随对正常细胞的影响或损伤。
在本发明的一些实施方式中，所述药物组合物的治疗活性成分仅为本发明的柔毛水杨梅提取物，所述药物组合物用于抑制肿瘤细胞生长和/或杀伤肿瘤细胞和/或诱导肿瘤细胞的凋亡或向良性分化但不影响或损伤正常细胞。
所述药物或药物组合物可以制备成用于包括但不限于口服、肠胃外、通过吸入、局部或全身性给药的给药途径的制剂。肠胃外给药例如静脉、腹膜内、肌内、皮下、直肠或阴道给药。吸入给药例如鼻内或口腔吸入给药。局部给药例如向表皮外部、口腔给药，以及向耳、眼和鼻中以及不显著进入血流的部位滴注给药。全身性给药例如口服、静脉、腹膜内或肌内给药。
在特定实施方式中，所述药物或药物组合物可制备成通过静脉或皮下给药。在另一实施方式中，所述药物或药物组合物可制备成通过胃内给药。
在特定实施方式中，本发明的药物组合物以50-200μg/ml的治疗活性成分柔毛水杨梅提取物给药。治疗有效量的实例还包括以治疗活性成分柔毛水杨梅提取物计60μg/ml、125μg/ml和180μg/ml。在一个实施方式中，治疗有效量是80mg-300mg/kg体重/日。在另一个实施方式中，治疗有效量是50mg-100mg/kg体重/每日。在又一实施方式中，治疗有效量是25-50mg/kg/体重。给药期间通常取决于药剂的相对效力、受治疾病的严重性和治疗有效量。给药期间的实例包括不足24小时、24小时、48小时、3周、23天、1个月和不足3个月。
本发明的药物组合物可以与其它药剂联用以提供联合治疗。所述其它药剂可以组成同一组合物的一部分，或作为用于在同一时间或不同时间给药的分开的组合物。
实施例
参照以下实施例对本发明进行更详尽的描述。但本发明的范围不局限于这些实施例。
用于本发明的所有操作步骤均遵从美国国立卫生院出版的实验室动物看护及使用指南(the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)，并且得到了香港中文大学动物实验伦理委员会的批准。
除本文另外指明以外，本发明所用方法为本领域常规方法，本文不再赘述。
实施例1
从柔毛水杨梅分离活性组分
从植物柔毛水杨梅获得活性组分，以进行下文公开的实验。
如图1所示，于7月从中国湖南省张家界采集所述植物，干燥(100kg)，室温下使用10倍体积的70％乙醇溶液(1000L)浸泡3天，收集提取液，重复2次。合并所述提取物，将其喷雾干燥，以得到固体残留物(10kg)。将所述固体残留物悬浮于100L H2O，继而用氯仿(100L)萃取2次，随后用n-丁醇(100L)萃取2次，以产生相应的组分。过滤并喷雾干燥所述n-丁醇(GJ-B)可溶性组分，以产生粉状组分。将n-丁醇可溶性组分应用于10％乙醇溶液平衡的Sephadex LH-20柱，并用梯度浓度渐增的(20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％)乙醇溶液洗脱，分别从20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％的乙醇梯度洗脱过程中解析出7种组分。
用约30％的乙醇溶液洗脱的组分3(GJ-B-3)表现强有力的抗肿瘤活性。所述亚组分GJ-B-3包含约15种化合物(主要含有单宁类和三萜皂苷类)。
实施例2
从柔毛水杨梅分离活性组分
从植物柔毛水杨梅获得活性组分，以进行下文公开的实验。
如图2所示，于8月从中国广东省采集所述植物，干燥(20kg)，室温下使用70％乙醇溶液(2000L)浸泡3天，收集提取液，重复1次。合并所述提取物，将其喷雾干燥，以得到固体残留物MIX。
将所述固体残留物悬浮于10L H2O，继而用氯仿(10L)萃取2次，随后用n-丁醇(10L)萃取2次，以产生相应的组分。过滤并喷雾干燥所述n-丁醇(GJ-n)可溶性组分，以产生粉状组分。随后将其应用于10％甲醇溶液平衡的Sephadex LH-20柱，并用浓度渐增的(10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％甲醇溶液洗脱，分别从10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％的甲醇梯度洗脱过程中解析出9种组分。
用约20％-40％的甲醇溶液洗脱的组分2(GJ-n-2)和用约30％-50％的甲醇溶液洗脱的组分3(GJ-n-3)表现强有力的抗肿瘤活性。
实施例3
GJ-B-3和GJ-n-3诱导的体外癌症细胞系死亡
分别使用GJ-B-3和GJ-n-3在体外测试了8种癌症细胞系，包括PC3(前列腺癌)、MCF7(乳腺癌)、HepG2和SK-HEP-1(肝癌)、肾癌细胞株GRC-1、膀胱癌细胞系T24、MKN28(胃癌)以及H292(肺癌)。大鼠骨髓衍生的间充质干细胞和C2C12(小鼠成肌细胞细胞系)被用作正常对照。
实验表明，20μg/ml浓度下，在处理后约12-18小时，GJ-B-3便开始侵袭癌症细胞，并且在48小时内杀死60％-80％的癌症细胞。48小时处理后，残留的癌症细胞丧失其分裂潜能，即使将其再在不含GJ-B-3的培养基培养也是如此。所有被测癌症细胞系对GJ-B-3处理均产生了显著反应，其中PC3、MCF7和H292对GJ-B-3治疗最为敏感。
50μg/ml浓度下，在处理后不到24小时，GJ-n-3便开始侵袭癌症细胞，并且在48小时内杀死60％-80％的癌症细胞(图3)。48小时处理后，残留的癌症细胞完全丧失或者几乎丧失其分裂潜能，即使将其再在不含GJ-n-3的培养基培养也是如此。所有被测癌症细胞系对GJ-n-3处理均产生了显著反应，其中PC3、MCF7和H292最为敏感。
实施例4
GJ-B-3诱导的和GJ-n-3诱导的体外癌症细胞凋亡
Tunnel实验提示GJ-B-3诱导的和GJ-n-3诱导的体外诸如HepG2细胞的癌症细胞生长抑制的可能机制在于激活诸如HepG2细胞的癌症细胞凋亡途径。这由可商购的caspase-8荧光分析试剂盒证明。在分别用10-20μg/mlGJ-B-3和GJ-n-3处理HepG2细胞后，相对于对照组，caspase-8活性均渐增并在18小时达到峰值。
随着GJ-B-3或GJ-n-3浓度的增加，caspase-8的活性也增加，高浓度GJ-B-3或GJ-n-3(20μg/ml)下caspase-8的活性显著高于低浓度GJ-B-3或GJ-n-3(10μg/ml)下的活性(367.3±6.7对286.6±6.3，P＜0.01)，而空白对照组的caspase-8活性更低(76.5±5.3)。
GJ-B-3或GJ-n-3处理组中，HepG2细胞凋亡速率显著高于空白对照组中的凋亡速率(P＜0.001)。因此提示GJ-B-3或GJ-n-3能够通过caspase-8信号转导通路，以时间依赖或浓度依赖方式诱导所培养HepG2细胞的凋亡。
为进一步确定GJ-B-3或GJ-n-3的抗增殖作用机制，用20μg/ml的GJ-B-3或GJ-n-3以时间进程方式处理HepG2细胞，以确定该生物活性组分是否通过凋亡或坏死特异性诱导HepG2细胞死亡。
用GJ-B-3或GJ-n-3处理24小时的HepG2细胞表现凋亡活性，用荧光12dUTP标记核内片段化的DNA。在治疗开始时，绿色荧光的强度暗淡。然而，治疗24小时下，观察到更多的荧光，从而说明更多的细胞(约90％)在经历凋亡。在用作阴性对照的DMSO处理的HepG2细胞中，没有在核内检测到荧光，这提示片段化的DNA的含量低于GJ-B-3处理组(图4)。
在GJ-B-3或GJ-n-3处理后，凋亡细胞的百分比以时间进程方式增加。24小时下大于50％，而至48小时为约90％。代表对照的未处理细胞显示仅有5％的凋亡造成的细胞死亡。
实施例5
MIX诱导的和GJ-B-3诱导的HepG2来源的肝肿瘤生长抑制
为评价MIX或GJ-B-3对肿瘤的潜在治疗性作用，测试了肝癌动物模型中MIX或GJ-B-3的抗癌作用。
取对数生长期的人肝癌HepG2细胞，2.5g/L胰酶消化后，用无血清DMEM配成1×1010细胞/L的单细胞悬液。在无菌条件下接种于裸鼠皮下，0.2mL/只(相当于每只裸鼠接种2×106个肿瘤细胞)。接种1周后，可见肿瘤生长。当肿瘤大小达到直径约为3-4mm时(接种10天以后)，将荷瘤裸鼠按肿瘤大小随机分为2组，每组7-8只裸鼠，雌雄兼有：(1)给药组。每日给药，共给3周；(2)未治疗对照组。自接种后每日测量裸鼠体质量，每周测量裸鼠肿瘤的长径a和短径b，并按以下公式计算相对体积：V＝0.5ab2。各组按时间点的平均瘤体积作生长曲线图。末次给药后24h时处死动物，剥离肿瘤称取质量。做大体和病理观察。实验重复2次。
结果表明，MIX在控制肝癌细胞生长和扩散上是有效的。在以50-200μg/ml(80-300mg/kg体重/日)每日胃内给药3周后，MIX显著减小了肿瘤尺寸(图5)。
GJ-B-3在控制肝癌细胞生长和扩散上是有效的。在以50mg-100mg/kg体重/每日口服3周后，GJ-B-3同样也显著减小了肿瘤尺寸。
实施例6
GJ-B-3诱导的体内癌症细胞凋亡
为证明GJ-B-3诱导的体内癌症细胞死亡是通过在细胞培养系统中发现的凋亡，将HepG2细胞接种于裸小鼠皮下。每日接种所述癌症细胞，连续2周。接种结束1周后，通过实验动物的尾静脉注射GJ-B-3(25mg/kg体重)。
结果证明GJ-B-3诱导体内所接种癌症细胞的凋亡。来自受治动物的所接种癌症细胞已经开始皱缩、变小并变圆。观察到与肿瘤细胞共集中的显著更多的荧光，这说明这些肿瘤细胞正显著地经历凋亡。经比较，来自用5％DMSO(GJ-B-3溶剂)处理的动物的肿瘤细胞显示显著更大的尺寸，并且在肿瘤细胞的核内未显示荧光(图6)。这一发现与体外实验的结果一致。
在电镜下，未治疗HepG2细胞的外形是不规则的，肿瘤细胞的尺寸显著更大。未治疗肿瘤细胞的表面有丰富的微绒毛。经比较，受治肿瘤细胞变得皱缩、更小且更圆。所观察细胞的表面几乎没有微绒毛(图7)。
实施例7
MIX诱导的体内癌症细胞凋亡和免疫反应
受治肿瘤的HE(苏木精和伊红)染色结果显著表明癌症细胞的凋亡，这与体外研究获得的结果一致，即存活的只是外面很薄的一层和里面的少数团块。另外，在受治肿瘤中，出现大量淋巴细胞围绕所述肿瘤。经比较，采自对照组的肿瘤表现出更有活力的癌细胞，并且几乎没有淋巴细胞围绕(图8)。
根据所述结果，MIX在体外和体内的抗肿瘤作用更加令人确信。另外，在体内，MIX激活了对癌症细胞的免疫反应。
实施例8
MIX诱导的对患者的抗癌作用
在已使用MIX作抗肿瘤药的全部3例患者中，均具有显著的治疗作用。简述如下：
a.来自美国的乳腺癌患者1例：用70％乙醇提取液5克/天，口服，给药23天后，她的CEA水平便分别从4.5至3.8降到4.12至2.59。用螺旋计算机X光断层造影扫描(CAT)与正子放射型计算机断层摄影(PET)检查未发现乳腺癌及转移病灶。
b.来自美国的前列腺癌患者1例：用70％乙醇提取液5克/天，口服，给药23天后，他的PSA水平便保持稳定。用螺旋计算机X光断层造影扫描(CAT)与正子放射型计算机断层摄影(PET)检查，发现他的肺部转移病灶缩小。
c.来自澳门的前列腺癌患者1例(体重＝65公斤)，用70％乙醇提取液5-9克/天，口服，头两周5克/天，后两周9克/天。给药30天后，他的PSA水平便分别从4.4至4.0降到3.6。用螺旋计算机X光断层造影扫描(CAT)与正子放射型计算机断层摄影(PET)检查未发现转移病灶。
在所有3个病例中，对他们的给药均没有出现副作用。
在本发明中引用的所有参考文献，包括但不限于公开和未公开的发明、专利和参考文献，都将其全部内容引入本文中作为参考并由此成为本说明书的一部分。当通过参考方式引入的公开和专利或专利发明与本说明书中所包含的公开内容在某种程度上有所抵触时，本说明书旨在取代和/或优先于任何这样的抵触材料。
以上描述公开了本发明的多种方法、产物、组合物和用途。本发明允许对所述方法、产物、组合物和用途进行修饰。这样的修饰对于考虑本公开的本领域所属技术人员而言是显而易见的。因此，本发明并非意在限于本文所公开的特定实施方式，而是覆盖了在本发明真正范围和精神之内的全部修饰和改变。