一种利用水产品加工废水和中草药制备饲用抗生素替代物的方法.pdf

本发明公开了一种利用水产品加工废水和中草药制备饲用抗生素替代物的方法，包括以下主要步骤：将新鲜的水产品加工废水蒸发浓缩至蛋白质含量为18%～25%备用，将中草药粉碎后过60目筛备用；浓缩的水产品加工废水和粉碎的中草药混合，并添加营养物混匀作为发酵培养基；发酵培养基灭菌冷却后接入产枯草菌素的枯草芽孢杆菌HL-1进行固态好氧发酵；发酵后的产物经干燥、粉碎和包装后制备成饲用抗生素替代物成品。本发明方法不但将水产品加工废水变废为宝，而且还制备成一种富含枯草菌素、中草药有效成分和营养小肽的饲用抗生素替代物，它有良好的促生长与抗病功能，在饲料行业中能完全替代饲用抗生素，有着良好的应用前景和社会意义。

权利要求书
1.  一种利用水产品加工废水和中草药制备饲用抗生素替代物的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
（1）将斜面保藏的能产枯草菌素的枯草芽孢杆菌HL-1接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于37 ℃、150r/min培养16h，制备成枯草芽孢杆菌HL-1种子液备用；
（2）将水产品加工废水蒸发浓缩至蛋白质含量为18%～25%备用，将中草药粉碎后过60目筛备用；
（3）将步骤（2）制得的浓缩后水产品加工废水和粉碎后过60目筛的中草药按质量比为0.8~1.5：1的比例混合，并添加营养物混匀，获得混匀的发酵培养基；
（4）将步骤（3）获得的混匀的发酵培养基于121℃灭菌30min；
（5）将步骤（4）获得的灭菌后的发酵培养基冷却至室温，然后接入步骤（1）所制备的枯草芽孢杆菌HL-1种子液，并混匀；
（6）原料的发酵：将步骤（5）获得的加入菌的发酵培养基按照下列方法进行发酵：发酵培养基分装在已消毒的发酵浅盘中，装料厚度为4cm～8cm，浅盘中发酵培养基表面覆盖已灭菌的湿纱布，再将浅盘置于已灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度在28℃~30℃，发酵时间为35h～45h；
（7）成品处理：发酵结束，将发酵后获得的产品经干燥、粉碎和包装后，即制得了一种利用水产品加工废水和中草药制备的饲用抗生素替代物成品。

2.  根据权利要求1所述的一种利用水产品加工废水和中草药制备饲用抗生素替代物的方法，其特征在于：所述步骤（1）中所用的枯草芽孢杆菌HL-1在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No．10379。

3.  根据权利要求1所述的一种利用水产品加工废水和中草药制备饲用抗生素替代物的方法，其特征在于：所述步骤（2）中的水产品加工废水为鱼粉加工废水、甲壳素加工过程的碱洗废水、对虾蒸煮废水和鱼糜加工废水中的一种。

4.  根据权利要求1所述的一种利用水产品加工废水和中草药制备饲用抗生素替代物的方法，其特征在于：所述步骤（2）中的中草药为甘草、连翘、车前草、苏子、五味子、马鞭草中的一种或其中两种以上的混合物。

5.  根据权利要求1所述的一种利用水产品加工废水和中草药制备饲用抗生素替代物的方法，其特征在于：所述步骤（3）中的营养物为葡萄糖、氯化亚铁和磷酸氢二钾所组成的混合物。

6.  根据权利要求1所述的一种利用水产品加工废水和中草药制备饲用抗生素替代物的方法，其特征在于：所述步骤（3）中的营养物的加入量以添加的营养物的质量占发酵培养基总质量百分比计，分别为：葡萄糖0.01%～5%，氯化亚铁0.01%～5%，磷酸氢二钾0.01%～5%。

7.  根据权利要求1所述的一种利用水产品加工废水和中草药制备饲用抗生素替代物的方法，其特征在于：所述步骤（5）中枯草芽孢杆菌HL-1种子液的接种量以接入种子液的质量占发酵培养基总质量百分比计，为0.1%～5%。

说明书一种利用水产品加工废水和中草药制备饲用抗生素替代物的方法
技术领域
本发明涉及一种利用水产品加工废水和中草药制备饲用抗生素替代物的方法，属于饲料添加剂制备的技术领域。
背景技术
近年来随着我国水产品加工业的快速发展，水产品加工废水的处理成为水产品加工企业的一大负担。废水主要来自于水产品加工过程中的原料蒸煮、解冻和清洗等工序，具有有机物浓度高，蛋白质、油脂等大分子有机物质多，生化降解速率慢等特点。特别是鱼粉加工废水、对虾蒸煮废水和甲壳素加工废水等，这些废水的蛋白质含量3%～10%，更是难以处理。目前对于水产品加工废水的处理多采用生化处理的方法，这些方法不但并没有回收利用废水中的蛋白质资源，造成了大量优质蛋白资源的浪费，而且处理成本高。
目前中国每年生产的大约21万吨抗生素原料中有9.7万吨用于畜牧养殖业，占年总产量46.1%。过量的使用抗生素不仅导致了养殖动物对抗生素药物的耐药性，使养殖动物的抗病能力下降，而且这些抗生素会随食物链进入人体，使人体在无意中产生耐药细菌，一旦生病就会增加治疗难度和费用，甚至有可能会产生“超级细菌”，出现无药可治的情况。随着人们生活质量的不断提高，对各类食品包括肉食品的卫生安全有了更高的要求，对 “放心肉”、“绿色食品” 的呼声也日渐强烈。因此，寻找抗生素的绿色替代品是我国饲料和养殖行业发展中亟待解决的问题。
中草药是中国医学宝库中的瑰宝，且中草药作为饲料添加剂，在我国古代已经开始。中草药具有无毒副作用、不易引发细菌抗药性、无残留等特性，作为一种饲用抗生素的绿色替代品在饲料工业得到了广泛的认可。从20世纪80年代起, 中草药已被用于作饲用抗生素替代品, 且取得了一定的应用效果。中草药经过微生物发酵后，其有效成分被充分释放，使其更具生物活性和疗效近年来更是研究热点。中国饲料〔2010，419（15）：13-17〕文献公开了从不同中草药原料中分离得到的米曲霉对中草药进行发酵，发酵料蒸煮液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的抑菌活性分别较对照提高36.03%、60.83%、27.64%、41.32%。但以上对中草药的发酵只是局限在充分让中草药有效成分释放出来，从而提高抑菌活性，然而中草药有效成分的抗菌活性并没有提升。目前发酵中草药存在最大的问题是使用剂量偏大。这不仅增加了产品的使用成本 ，而且还影响饲料营养配比和适口性，从而使得发酵中草药仍没有在饲料工业得到广泛的应用。因此，急需大幅度提高发酵中草药中有效成分的抗菌活性，减少发酵中草药在饲料工业的使用剂量，以促进发酵中草药在饲料工业的广泛应用。
细菌素是一类由微生物产生的具有抗菌作用的蛋白或多肽，能够抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌。由于细菌素具有不污染环境、不会使致病菌产生耐药性、增强宿主免疫力等优点，被公认为是一种天然抑菌剂。但目前，由于高昂的生产成本使得细菌素的应用主要在食品领域，而在饲料行业的应用很少。细菌素在食品上的直接使用，也说明了细菌素对动物和人类是安全的。因此急需提细菌素的抗菌活性与降低其生产成本，以促进细菌素在饲料工业的应用。
1988 年乳酸链球菌素首次作为食品添加剂得到FDA 的认可，已有超过100个国家和地区在使用乳酸链球菌素作为食品防腐剂，从而促进了其他种类细菌素及在其他领域的研究。但目前细菌素的研究多集中于乳酸菌细菌素方面，而国际上对枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）产生的枯草菌素的研究则很少，国内更是少见。工业微生物（2008，38（4）：14～18）公开了一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）FB123 产枯草菌素的液体发酵条件，但是对于提高枯草菌素的抗菌活性及枯草菌素的固态发酵生产还没有研究报道。
发明内容
本发明以水产品加工废水与中草药为原料，制备一种富含中草药有效成分与枯草菌素的复合型饲用抗生素替代物。本发明的目的是不但要降低枯草菌素与中草药发酵的生产成本，而且还要提高中草药有效成分与枯草菌素的抗菌活性，从而降低枯草菌素与中草药在饲料工业的使用剂量，以促进枯草菌素与中草药在饲料工业的广泛的应用。本发明的另一个目的是将水产品加工废水变废为宝，充分回收水产品加工废水中的蛋白质资源。
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：一种利用水产品加工废水和中草药制备饲用抗生素替代物的方法，包括如下步骤：
（1）将斜面保藏的能产枯草菌素的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于37 ℃、150r/min培养16h，制备成枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1种子液备用；
（2）将水产品加工废水蒸发浓缩至蛋白质含量为18%～25%备用，将中草药粉碎后过60目筛备用；
（3）将步骤（2）制得的浓缩后水产品加工废水和粉碎后过60目筛的中草药按质量比为0.8~1.5：1的比例混合，并添加营养物混匀，获得混匀的发酵培养基；
（4）将步骤（3）获得的混匀的发酵培养基于121℃灭菌30min；
（5）将步骤（4）获得的灭菌后的发酵培养基冷却至室温，然后接入步骤（1）所制备的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1种子液，并混匀；
（6）原料的发酵：将步骤（5）获得的加入菌的发酵培养基按照下列方法进行发酵：发酵培养基分装在已消毒的发酵浅盘中，装料厚度为4cm～8cm，浅盘中发酵培养基表面覆盖已灭菌的湿纱布，再将浅盘置于已灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度在28℃~30℃，发酵时间为35h～45h；
（7）成品处理：发酵结束，将发酵后获得的产品经干燥、粉碎和包装后，即制得了一种利用水产品加工废水和中草药制备的饲用抗生素替代物成品。
所述步骤（1）中所用的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1能产生枯草菌素，该菌已于2015年1月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No．10379，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
所述步骤（2）中的水产品加工废水为鱼粉加工废水、甲壳素加工过程的碱洗废水、对虾蒸煮废水和鱼糜加工废水中的一种。所述步骤（2）中的中草药为甘草、连翘、车前草、苏子、五味子、马鞭草中的一种或其中两种以上的混合物。
所述步骤（3）中的营养物为葡萄糖、氯化亚铁和磷酸氢二钾所组成的混合物；所述步骤（3）中的营养物的加入量以添加的营养物的质量占发酵培养基总质量百分比计，分别为：葡萄糖0.01%～5%，氯化亚铁0.01%～5%，磷酸氢二钾0.01%～5%。
所述步骤（5）中枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1种子液的接种量以接入种子液的质量占发酵培养基总质量百分比计，为0.1%～5%。
       本发明跟现有的技术相比，有如下优点。
（1）降低了饲用抗生素的绿色替代品的生产成本。本发明以水产品加工废水与中草药为原料，用能产生枯草菌素的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1来进行固态发酵，不但可发酵产生枯草菌素，而且还使得中草药的有效成分释放出来。本发明将枯草菌素的发酵与中草药的发酵合二为一，从而在总体上降低了饲用抗生素的绿色替代品的生产成本。
（2）提高了枯草菌素与中草药有效成分的抗菌活性，从而显著降低了枯草菌素与中草药有效成分的使用剂量。本发明从成千上万的中草药库上筛选出了其有效成分与枯草菌素具有协同抑菌效应的中草药。本发明不但将枯草菌素的发酵生成与中草药发酵合二为一，而且由于枯草菌素与中草药有效成分的相互作用，二者的抗菌活性都显著增强。这也是目前单一的中草药发酵与枯草菌素发酵生产所不具备的。正是由于本发明提高了所制备的枯草菌素与中草药有效成分的抗菌活性，从而使得本发明所制备的饲用抗生素替代物的使用剂量大大减少，其中所含的枯草菌素与中草药有效成分的实际使用剂量比单独使用时减少了几倍到几十倍。
（3）将水产品加工废水变废为宝，回收利用了废水中的蛋白质资源。与现有的生化处理方法相比，本发明将水产品废水变废为宝，回收利用了废水中的蛋白质资源。非但如此，本发明还通过微生物的发酵作用，将蛋白质降解为小肽，提高了蛋白质的营养价值。
（4）提高了促生长效果。在本发明提供的方法中，水产品加工废水中的蛋白质通过微生物的发酵作用下降解成小肽。小肽对饲养动物具有促生长作用，这已经得到饲料工业的认可。富含小肽，可进一步提高本发明方法制备的饲用抗生素替代物的促生长效果。
本发明提供了一种水产品加工废水与中草药混合发酵的饲料添加剂的制备方法。本发明不但降低了饲用抗生素绿色替代物的生产成本；而且还大大降低了枯草菌素与中草药有效成分的使用剂量；并且还进一步提高了饲用抗生素替代品的促生长效果。本发明得到的富含枯草菌素、中草药有效成分和小肽的饲用抗生素替代物在华南地区的猪、鸡、对虾的养殖试验表明，用本发明方法制备的饲用抗生素替代物可完全替代饲用抗生素，明显降低养殖成本，取得显著的经济效益。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面就水产品加工废水与中草药的种类、发酵参数和发酵方式的选择结合实施例对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围不限于此。
实施例1：将斜面保藏的能产枯草菌素的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于37 ℃、150r/min培养16h，制备成枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1种子液备用。将鱼粉加工废水加热蒸发浓缩至蛋白质含量为25%备用；将甘草粉碎后过60目筛备用。将150公斤浓缩鱼粉加工废水和100公斤粉碎并过60目筛的甘草混合，并加入500克葡萄糖、150克氯化亚铁和600克磷酸氢二钾一起混匀，获得混匀后的发酵培养基；混匀后的发酵培养基于121℃灭菌30min；接着往灭菌后冷却的发酵培养基中加入1公斤枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1种子液，搅拌并混合均匀；接种后的发酵培养基分装在已用75%的酒精表面消毒的发酵浅盘中，浅盘中装料厚度为8厘米，浅盘中物料表面覆盖灭菌处理的湿纱布，再将浅盘置于灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度为 28℃，发酵时间为45h；发酵结束后，将发酵后获得的产品经干燥、粉碎和包装后，即制得了本发明所述的一种利用水产品加工废水和中草药制备的饲用抗生素替代物成品。
实施例2：将斜面保藏的能产枯草菌素的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于37 ℃、150r/min培养16h，制备成枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1种子液备用。将鱼粉加工废水加热蒸发浓缩至蛋白质含量为25%备用；将甘草和五味子粉碎后过60目筛备用。将100公斤浓缩鱼粉加工废水和100公斤粉碎并过60目筛的复合中草药（75公斤甘草和25公斤五味子）混合，并加入400克葡萄糖、200克氯化亚铁和425克磷酸氢二钾一起混匀，获得混匀后的发酵培养基；混匀后的发酵培养基于121℃灭菌30min；接着往灭菌后冷却的发酵培养基中加入1公斤枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1种子液，搅拌并混合均匀；接种后的原料分装在已用75%的酒精表面消毒的发酵浅盘中，浅盘中装料厚度为4厘米，浅盘中物料表面覆盖灭菌处理的湿纱布，再将浅盘置于灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度为 30℃，发酵时间为35h；发酵结束后，将发酵后获得的产品经干燥、粉碎和包装后，即制得了本发明所述的一种利用水产品加工废水和中草药制备的饲用抗生素替代物成品。
实施例3：将斜面保藏的能产枯草菌素的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于37 ℃、150r/min培养16h，制备成枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1种子液备用。将甲壳素加工过程的碱洗废水加盐酸调至7.0，并将废水加热蒸发浓缩至蛋白质含量为18%备用；将连翘粉碎后过60目筛备用。将80公斤浓缩废水和100公斤粉碎并过60目筛的连翘混合，并加入600克葡萄糖、150克氯化亚铁和450克磷酸氢二钾一起混匀，获得混匀后的发酵培养基；混合后的发酵培养基于121℃灭菌30min；接着往灭菌后冷却的发酵培养基中加入1公斤枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1种子液，搅拌并混合均匀；接种后的原料分装在已用75%的酒精表面消毒的发酵浅盘中，浅盘中装料厚度为6厘米，浅盘中物料表面覆盖已灭菌处理的湿纱布，再将浅盘置于灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度在29 ℃，发酵时间为40h；发酵结束后，将发酵后获得的产品经干燥、粉碎和包装后，即制得了本发明所述的一种利用水产品加工废水和中草药制备的饲用抗生素替代物成品。
实施例4：将斜面保藏的能产枯草菌素的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于37 ℃、150r/min培养16h，制备成枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1种子液备用。将对虾蒸煮废水加热蒸发浓缩至蛋白质含量为20%备用；将车前草和苏子碎后过60目筛备用。将90公斤浓缩废水和100公斤粉碎并过60目筛的复合中草药（60公斤车前草+40公斤苏子）混合，并加入400克葡萄糖、150克氯化亚铁和525克磷酸氢二钾一起混匀，获得混匀后的发酵培养基；混合后的发酵培养基于121℃灭菌30min；接着往灭菌后冷却的发酵培养基中加入1公斤枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1种子液，搅拌并混合均匀；接种后的原料分装在已用75%的酒精表面消毒的发酵浅盘中，浅盘中装料厚度为5厘米，浅盘中物料表面覆盖已灭菌处理的湿纱布，再将浅盘置于灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度在30 ℃，发酵时间为38h；发酵结束后，将发酵后获得的产品经干燥、粉碎和包装后，即制得了本发明所述的一种利用水产品加工废水和中草药制备的饲用抗生素替代物成品。
实施例5：将斜面保藏的能产枯草菌素的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于37 ℃、150r/min培养16h，制备成枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1种子液备用。将鱼糜制加工废水加热蒸发浓缩至蛋白质含量为18%备用；将甘草、车前草和五味子粉碎后过60目筛备用。将100公斤浓缩废水和100公斤粉碎并过60目筛的复合中草药（35公斤甘草+35公斤车前草+30公斤五味子）混合，并加入488克葡萄糖、118克氯化亚铁和588克磷酸氢二钾一起混匀，获得混匀后的发酵培养基；混合后的发酵培养基于121℃灭菌30min；接着往灭菌后冷却的发酵培养基中加入1.5公斤枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-1种子液，搅拌并混合均匀；接种后的原料分装在已用75%的酒精表面消毒的发酵浅盘中，浅盘中装料厚度为4厘米，浅盘中物料表面覆盖已灭菌处理的湿纱布，再将浅盘置于灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度在30 ℃，发酵时间为38h；发酵结束后，将发酵后获得的产品经干燥、粉碎和包装后，即制得了本发明所述的一种利用水产品加工废水和中草药制备的饲用抗生素替代物成品。