一种含有海藻酸钠的药用组合物及其制备方法.pdf

本发明提供了一种用于骨软骨组织修复的含有海藻酸钠的药用组合物，该组合物的活性成分为骨形态发生蛋白-4转染的脂肪来源干细胞、海藻酸钠和氯化钙，该组合物可使填充软骨柱之间、及其与周围软骨、软骨下骨间的缝隙被新生组织完全填平，且具备与正常软骨相似的力学性能，实现了镶嵌骨软骨与周围软骨、软骨下骨的完全融合，显著地提高了术后患者关节功能的改善和恢复水平；此外本发明还提供了所述药用组合物的制备方法。

权利要求书
1.  一种用于骨软骨组织修复含有海藻酸钠的药用组合物，其特征在于，该组合物的活 性成分为：细胞浓度不低于0.5×107/ml的骨形态发生蛋白-4转染的脂肪来源干细胞，及含量 为1～2％(w/v)的海藻酸钠和0.3～0.5％(w/v)的氯化钙。

2.  如权利要求1所述的组合物，其特征在于，该合物还包括以下含量的辅料：0.5～0.7％ (w/v)的氯化钠，和0.3～0.5％(w/v)的4-羟乙基哌嗪乙磺酸。

3.  如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述海藻酸钠的含量为1.4～1.8％。

4.  如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述骨形态发生蛋白-4转染的脂肪 来源干细胞的浓度为(1～2)×107/ml。

5.  如权利要求1-4任一条所述的组合物，其特征在于，该组合物由细胞浓度为(1～1.5) ×107/ml的骨形态发生蛋白-4转染的脂肪来源干细胞，含量为1.6～1.7％的海藻酸钠、 0.35～0.45％的氯化钙、0.5～0.7％的氯化钠、0.3～0.5％的4-羟乙基哌嗪乙磺酸和适量pH调节剂 制成。

6.  权利要求1所述的组合物的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
⑴提取并制备骨形态发生蛋白-4转染的脂肪来源干细胞；
⑵制备海藻酸钠溶液；
⑶制备氯化钙溶液；
⑷临用前将步骤⑴得到的细胞悬浮于步骤⑵得到的海藻酸钠溶液中；
⑸将步骤⑷和步骤⑶所得物按体积比2:1的比例混合均匀，即得本发明组合物。

7.  如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤⑴包括：
a.脂肪组织干细胞的提取、分离与培养，取3～10代细胞；
b.骨形态发生蛋白-4重组腺病毒；
c.骨形态发生蛋白-4重组腺病毒体外转染脂肪来源干细胞；
d.检测转染效果，取转染率大于70％的细胞于-65～-75℃环境下储存，备用。

8.  如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤⑵具体为：将氯化钠、4- 羟乙基哌嗪乙磺酸溶于70～95％的去离子水中，加热到50～80℃，保温，加入海藻酸钠，搅拌， 得均一溶液，放置室温，加pH调节剂调节pH值至7.35～7.45，用去离子水定容，备用。

9.  如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤⑶具体为：取氯化钙及4- 羟乙基哌嗪乙磺酸，加50～95％去离子水制成溶液，调节pH值至7.35～7.45，去离子水定容， 0.22μm滤膜过滤，备用。

10.  权利要求1所述的组合物在制备骨软骨组织修复药物和/或医用材料中的应用。

说明书一种含有海藻酸钠的药用组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种含有海藻酸钠的组合物及其制备方法，特别是一种可促进骨软骨组织修复 的含有海藻酸钠的药用组合物。
背景技术
因创伤和关节炎等疾病导致的关节内骨软骨复合型损伤在临床上十分常见，在关节内占据 重要地位的软骨组织一旦破坏便极大程度上影响关节功能的正常发挥。由此引发的恶性循环造 成关节内环境的进一步紊乱，机械力学传导异常导致正常关节软骨的连锁破坏，最终导致自主 运动不同程度受限等后果，严重影响着广大患者的身心健康，也给家庭和社会造成沉重的负担。
由于软骨损伤后修复能力十分有限，只能依赖于手术治疗，如微骨折术、钻孔术和骨软骨 自体/异体移植等。但是这些治疗方法都存在或多或少的不足之处，并不能达到理想的治疗效果， 特别是对大面积软骨损伤的治疗，不足之处更为突出。
目前，Mosaicplasty技术(自体骨软骨镶嵌移植术)是临床应用较为广泛的解决大面积骨软 骨复合损伤修复的方法，其采用自体非负重区骨软骨柱进行镶嵌式移植修复负重区骨软骨缺损。 镶嵌的骨软骨柱之间及其与周围和基底部骨和软骨组织的“整合”不良，从而不可避免地导致 许多缺损间隙即“死区”的存在。因此，单纯依靠Mosaicplasty技术无法获得一个完全平整、连 续的关节面，难以达到更佳的关节功能改善和恢复。并且“供区”(自体骨软骨柱的取骨区)也 有愈合不良，造成术后病人“供区”疼痛。因此，解决骨软骨柱之间的“死区”以及“供区” 骨软骨生长修复的问题成为治疗大面积骨软骨损伤的关键。
发明内容
针对目前骨软骨镶嵌移植术在大面积骨软骨损伤修复应用中存在的不足，发明人经过大量 科学的实验研究，提供了一种可高效地促进骨软骨组织再生修复的含有海藻酸钠的药用组合物， 该组合物可使填充的骨柱之间、及其与周围软骨、软骨下骨间的缝隙被新生组织完全填平，且 具备与正常软骨相似的力学性能，实现了镶嵌骨软骨与周围软骨、软骨下骨的完全融合，更显 著地提高了术后患者关节功能的改善和恢复水平。
本发明提供了一种用于骨软骨组织修复的药用组合物，该组合物的活性成分为：细胞浓度 不低于0.5×107/ml的骨形态发生蛋白-4(BMP-4)转染的脂肪来源干细胞(ADSCs)，及含量为 1～2％(w/v)的海藻酸钠和0.3～0.5％(w/v)的氯化钙。
该组合物也可称为一种用于骨软骨组织修复的含有海藻酸钠的组合物或一种用于骨软骨组 织修复的含有海藻酸钠的药用组合物。
为解决骨软骨镶嵌移植术在大面积骨软骨损伤修复应用中存在的问题，发明人曾经尝试将 海藻酸钙凝胶与该法配合应用，结果该配合对“死区”现象具有一定程度的改善，但该部分的 新生组织并非骨软骨样信号，类似纤维肉芽组织，其力学性能较正常软骨相差很多，无法满足 修复后关节的正常使用。在不断的研究、改良过程中，发明人惊喜地发现，在海藻酸钙凝胶中 复合BMP-4转染的ADSCs，可显著地提高移植骨软骨与周围软骨、软骨下骨间的整合效果，生 成透明软骨样组织，可使植入部分与体内骨或软骨融为一体。从而进一步提高对软骨损伤的修 复效果，降低继发骨性关节炎的可能性。
本发明组合物中还含有pH调节剂，所述pH调节剂为本领域常用pH调节剂，如1N的盐 酸、1N氢氧化钠等。
众所周知，海藻酸钙通常是由水溶性海藻酸盐与钙离子制成，海藻酸钙凝胶粘稠、流动性 差，其凝胶化速度、粘稠状态与原料的种类、比例及pH值有关。而凝胶化速度及其强度对与本 发明应用领域来说是至关重要的。一方面，交联完毕的海藻酸钙凝胶的粘稠状态使其无法满足 镶嵌软骨与自身骨/软骨间的细小、复杂且不规则空间的填充要求。另一方面，其强度不合要求 会导致凝胶破碎，不能为携带目的基因的种子细胞提供生长的支架，也难以很好的起到对植入 骨柱的固定及支撑作用，会直接影响到手术效果。
为兼顾交联(凝胶)速度、凝胶的强度，及钙离子过量对细胞的负面影响等因素，发明人 经过反复试验，得到本发明组合物所述的海藻酸钠与氯化钙的配比，及适合的pH值范围，即， 重量百分比为1～2％的海藻酸钠和0.3～0.5％的氯化钙，及调节组合物pH值至7.35～7.45的pH调 节剂。该比例的两部分混合后凝胶化时间、凝胶强度适中，约20-30秒时间即可交联完成。而且， 本发明所述组合物采用在临用前将海藻酸钠部分及氯化钙部分混合，并立即注入体内的方式应 用，自混合至注射完成耗时约10-15秒，此时的混合物尚处于比较稀薄的状态，可实现该手术创 口内任何细小、深远的缝隙填充完全的目的，填充完毕也无需刻意等待，组合物已成为具有一 定强度的凝胶状，便可进行缝合。即使所有缝隙填充完全又不延长伤口开放时间，且凝胶具备 适当的强度，足以保护植入软骨柱的位置及形状，较小外力不会致其变形，为细胞早期的生长 提供支架及合适的生长环境。
BMP-4转染的ADSCs在体内可较长时间(约4-6周)持续分泌细胞因子，刺激其分裂增殖， 启动并加速修复进程，改善关节内的病理环境，增强修复质量；而ADSCs的双向分化潜能使其 在关节腔与软骨下骨床的不同微环境内分化为相应的软骨细胞或骨细胞。
复合BMP-4转染的ADSCs的海藻酸钙凝胶注入“死区”，凝胶在固定、保护植入软骨柱 的同时，为植入的干细胞提供了类似生理状态的三维生长环境，细胞在凝胶中均匀分布，可进 行营养和代谢物质的交换，受凝胶的应变力刺激利于增生分化并形成细胞外基质，最终新生软 骨组织将“死区”完全填平，使植入部分于自体融合为一体，大大提高了一期完整修复骨软骨 复合组织损伤的可操作性和成功率，更重要的是显著提高了大面积软骨损伤患者的预后效果， 提高了该类患者的生活质量。
本发明所述组合物与骨软骨镶嵌移植术配合应用2-3个月，软骨柱边缘便会新生软骨样组 织，该凝胶部分有大量软骨细胞，该部分与植入软骨柱及自体软骨结合牢固，关节修复效果良 好。此外，发明人还将本发明组合物直接应用于小面积或微小面积软骨损伤的填充，同样达到 了很好的修复效果。
需要说明的是，本发明所用的骨形态发生蛋白-4转染的脂肪来源干细胞为制备48小时内的 细胞，即，转染步骤在组合物使用前的48小时内完成，优选24小时内制备完成。
为使本发明所述的组合物具备与肌体相适应的渗透压，及恒定的pH值，上述组合物还含 有以下含量的辅料：0.5～0.7％的氯化钠，和0.3～0.5％的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)。
实验结果显示，所述组合物中海藻酸钠的含量直接影响细胞(脂肪来源干细胞和软骨细胞) 生长的效果，且，该影响并非简单的正比、反比关系，而是在一个特定的范围内，该组合物中 海藻酸钠的含量优选为1.4～1.8％。
所述骨形态发生蛋白-4转染的脂肪来源干细胞(即，BMP-4转染的ADSCs)的浓度优选 为(1～2)×107/ml。
本发明所述的组合物，由细胞浓度为(1～1.5)×107/ml的骨形态发生蛋白-4转染的脂肪来 源干细胞，含量为1.6～1.7％的海藻酸钠、0.35～0.45％的氯化钙、0.5～0.7％的氯化钠、0.3～0.5％的 4-羟乙基哌嗪乙磺酸和适量pH调节剂制成。该组合物应用状态为凝胶剂，即海藻酸钠溶液部分 与氯化钙溶液部分混合后发生交联反应，生成海藻酸钙凝胶。
组织学和生物力学检测结果证明，本发明组合物与Mosaicplasty技术配合修复软骨缺损， 再生组织无论在组织结构还是功能性(生物力学)上都与正常关节软骨没有差别，达到了前所 未有的修复效果，进一步完善了大面积软骨缺损修复技术。
本发明的另一目的在于，提供所述组合物的制备方法，该方法包括以下步骤：
⑴提取并制备骨形态发生蛋白-4转染的脂肪来源干细胞；
⑵制备海藻酸钠溶液；
⑶制备氯化钙溶液；
⑷临用前将步骤⑴得到的细胞悬浮于步骤⑵得到的海藻酸钠溶液中；
⑸将步骤⑷和步骤⑶所得物按体积比2:1的比例混合，即得本发明组合物。
上述制备方法所述的步骤⑴包括：
a.自体脂肪组织干细胞的提取、分离与培养，取3～10代细胞；
b.骨形态发生蛋白-4重组腺病毒；
c.骨形态发生蛋白-4重组腺病毒体外转染脂肪来源干细胞；
d.检测转染效果，取转染率大于70％的细胞于-65～-75℃环境下储存，备用。
上述步骤a中的脂肪组织干细胞的提取、分离与培养的方法为本领域技术公知技术，各种 常用方法均可使用。如采用以下方法：
取自体或同种异体腹股沟处的脂肪组织。用大量PBS液冲洗去除表面血液，在1：1配置的 PBS和0.1％Ⅰ型胶原酶中用眼科剪剪碎，37℃消化30min后用含10％胎牛血清的DMEM中和 消化液，取300g离心5min，弃去含有成熟脂肪细胞的悬浮物，再含有脂肪组织来源干细胞的 沉淀物中加入160mM NH4Cl红细胞裂解液，室温静置10min，将其通过200-lm的尼龙筛，收 取过滤物，用含10％FBS,1％青链双抗的DMEM培养基在37℃/5％CO2培养箱过夜。原代细 胞培养4-5天，待其融和生长，以1：3给以传代。原代细胞标记为0代，实验所用细胞为3-10 代。所分离的细胞具有向脂肪及骨细胞的分化。
上述步骤b和c中的重组及转染方法同样为本领域技术公知技术，各种常用方法均可使用。 其中的转染方法可以采用以下方法：将第三代脂肪组织干细胞等量种植于6孔板中，达90％汇 合后，弃生长培养基，取3个孔消化细胞并计数。按MOI＝100、250、400计算每孔所需病毒(骨 形态发生蛋白-4重组腺病毒)量，并在冰上让存储的病毒自发融化后取不同量的病毒分别加到 400μl无血清的DMEM液中。将6孔板中的完全培养液弃除，PBS清洗2遍后加入病毒液，十 字形晃动培养板让病毒液充分接触细胞，37℃孵育3小时，期间每20分钟晃动培养板一次。3 小时后吸取病毒液并向每孔中加入1ml完全培养液继续培养。
为提高本发明组合物的软骨细胞分化能力及软骨修复能力，优选在藻酸钙凝胶中复合转染 率大于85％的BMP-4转染的ADSCs。
所述的制备方法的步骤⑵具体为：将氯化钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶于总体积70～95％的去 离子水中，加热到50～80℃，加入海藻酸钠，搅拌，得均一溶液，放置室温，加pH调节剂调节 pH值至7.35～7.45，用去离子水定容，备用。
所述的制备方法的步骤⑶具体为：取氯化钙及4-羟乙基哌嗪乙磺酸，加50～95％去离子水 制成溶液，调节pH值至7.35～7.45，去离子水定容，0.22μm滤膜过滤，备用。
其中，所述步骤⑵所得的海藻酸钠溶液和步骤⑶所得的氯化钙溶液中4-羟乙基哌嗪乙磺酸 的浓度约为2:1。
所述的制备方法的步骤⑷的细胞悬浮方法为常规方法，使细胞浓度达到0.75×107/ml以上。
按照所述步骤⑸所述方法混合均匀后得到本发明组合物，混合后藻酸盐立即开始交联，应 立刻将混合物注射入骨缝，填充完毕即可缝合。
本发明还提供了所述组合物在制备骨软骨组织修复药物和/或医用材料中的应用。
发明人进一步通过具体实验来验证本发明产品的功能效果。
再次重申：以下实验只是本发明研制过程中众多实验中举例性实验，并未涵盖和穷尽发明 人为本发明所做的所有实验，目的仅仅在于用那些数据来阐述本发明产品的有益效果。
实验方法：以小型猪为研究对象，在股骨内髁负重区做一直径8mm，深5mm骨软骨缺损； 在股骨滑车边缘非功能区分别取3个直径3.5mm长5mm骨软骨柱以Mosaicplasty技术填充大部 分缺损面积。实验随机平均分为3组进行修复。分别在术后12周，24周进行扫描电镜、组织学 评分以及生物力学观察。定量结果用均数±标准差表示，统计学分析使用SPSS软件采用 Mann–Whitney检验，P<0.05为有统计学意义
a组：单纯Mosaicplasty组；
b组：Mosaicplasty+海藻酸钙凝胶组；
c组：Mosaicplasty+复合BMP-4转染的ADSCs的海藻酸钙凝胶(实施例1所述本发明组合物) 组。
1、扫描电子显微镜检查
检查方法：动物处死后，迅速取下软骨缺损修复处，生理盐水冲洗。投入预冷的2％戊二醛 溶液固定8小时。蒸馏水充分清洗，加入1％四氧化锇固定1小时。吸出固定液，加入蒸馏水充 分清洗1小时，每15分钟更换一次蒸馏水。吸出蒸馏水，乙醇逐级梯度脱水，吸出乙醇，加入 醋酸异戊酯乙醇混合液(醋酸异戊酯与乙醇比例为1：1)20分钟后，吸入液体，加入纯醋酸异 戊酯30分钟。滤纸吸干样品表面醋酸异戊酯，将样品转入临界点干燥仪，在31℃、72.8个大气 压的临界状态下干燥。离子溅射法表面镀金。扫描电镜观察。
检查结果：(参见附图1)
12周时，a组可见移植骨软骨柱与周围边界清晰，骨软骨柱变形明显(图1-a1)；b组可见骨软 骨柱变形较小，注射藻酸钙凝胶处有新生组织，但组织纤维排列无序紊乱，且骨软骨柱与周围 仍存在裂隙(图1-b1)；c组可见骨软骨柱变形小，软骨柱边缘有新生软骨样组织，新生组织表面 与软骨柱表面类似。软骨柱之间未完全融合，但裂隙明显小于前两组(图1-c1)；
24周时，a组移植骨软骨柱之间及与周围正常软骨组织间裂隙清晰，骨软骨柱变形明显(图 1-a2)；b组可见移植骨软骨柱之间及与周围正常软骨组织间有部分裂隙被再生组织基本填平，但 表面不平整，纤维排列不整齐，有深沟(图1-b2)。c组可见骨软骨柱变形小，软骨柱间裂隙消失， 骨软骨组织间完全融合，表面连续完整，再生组织表面为均一的纤维状，较平整，纤维排列整 齐，与正常软骨相似。(图1-c2)。
上述结果表明：单纯采用a组方法，研究对象无法自行完成植入部分与自身间的融合生长， 注入部分容易移位变形，手术效果很不理想；b组方法虽然较a组效果有所改善，但融合较差， 稳定性差，不能满足正常活动带来的刺激；而采用本发明组合物的c组再生出软骨样组织，实现 了骨软骨柱间完全融合。
2、组织学检查
检查方法：动物麻醉后，分别从植入处取出标本，细心剔除多余的软组织，PBS冲洗后浸入 4％的多聚甲醛中固定48小时。从固定液中取出标本，自来水冲洗20min，蒸馏水洗2遍。上行 梯度酒精依次脱水，入二甲苯透明后浸蜡、包埋制成蜡块并切片，H.E、甲苯胺兰染色染色和II 型胶原染色进行观察。
检查结果：(参见附图2)
12周时：a组，可见移植骨软骨柱交界处无新生软骨，极少量纤维样组织填充软骨下骨， 移植软骨柱间裂隙存在，未能融合(图2-a1)；b组，可见移植软骨柱间软骨下骨愈合较好，软 骨组织间由纤维样组织填充裂隙仍然存在(图2-b1)。甲苯胺蓝和II型胶原染色均为阴性。C 组可见移植骨软骨柱交界处由软骨样组织修复，表面较平整，内有大量软骨细胞，位于软骨 陷窝内，排列成柱状或簇状；深层软骨中可见软骨内骨化，软骨下骨部分重建；与周围正常 软骨交界处无细胞缺失带，但界线明显(图2-c1)。甲苯胺蓝和II型胶原染色均为阳性。
24周时：a组，可见移植骨软骨柱交界处裂隙变窄由少量纤维组织填充，裂隙仍然存在(图 2-a2)，甲苯胺蓝染和Ⅱ型胶原染色阴性。b组，可见移植骨软骨柱交界处裂隙由纤维软骨样 组织混合修复，表面不平整，内有软骨细胞及纤维细胞，零散分布于再生组织内(图2-b2)。 甲苯胺蓝、masson染色及Ⅱ型胶原染色弱阳性。c组，可见移植骨软骨柱交界处由软骨组织修 复，表面平整，内有大量软骨细胞，表层细胞平行于表面，深层细胞成柱状排列，趋于正常， 可见软骨下潮线；与周围正常软骨交界处无细胞缺损带，界线不清(图2-c2)。甲苯胺蓝染色、 masson染色和II型胶原染色均为阳性。
上述结果表明：只有C组新生的修复组织具有正常软骨的组织学特点。
组织学评分采用O’Driscol评分标准，分数越高说明修复效果越好，满分为24分。其中12周 时，a组分数在5.2±1.60，b组分数为8.8±3.12，而c组分数就已经达到16.2±2.63；24周时，a组分 数在7.2±1.32，b组分数为12±4.56，而c组分数高达到21.4±1.35，已接近满分。
上述结果表明：c组新生的修复组织在组织学上接近正常组织。
3、生物力学检测
检查方法：纳米压痕生物力学测定
主要采用三个指标来评价修复组织的生物力学特性，包括contact stiffness(接触刚度)， reduced modulus(弹性模量)，hardness(硬度)。接触刚度主要用来评价修复组织抵抗外力引 起的形变的能力。弹性模量主要用来评价修复组织的弹性。硬度是评价修复组织的硬度的指标。
实验结果显示(参见附图3-6)，c组修复组织的力学性能在这三个指标上均明显优于另外 两组，接近正常软骨。b修复组织力学性能虽强于a组，但较c组相差甚远。a、b两组的修复组 织的生物力学性能远未达到正常软骨及填充区，无法满足软骨修复需求。说明，本发明组合物 可持续诱导、促进再生组织向骨软骨分化，实现在短期内恢复骨软骨缺损区的组织学和功能学 特性。
为了验证本发明组合物的功能效果，发明人正在进行重复性的实验，与上述实验不同的是， 各组分用量、细胞浓度不同(包括实施例2-6)，制备方法中的参数进行微调。其中，所述各组分 用量(w/v)的浮动范围为：1～2％的海藻酸钠、0.3～0.5％的氯化钙、0.5～0.7％的氯化钠，和0.3～0.5％ 的4-羟乙基哌嗪乙磺酸；所述BMP-4转染的ADSCs的浓度范围为(0.5～2)×107/ml。
已完成的实施例1-3的结果显示，各组分用量、细胞浓度在一定范围内调整后，仍然具备很 好的促进骨软骨组织修复效果。在此基础上进行统计学分析的数据显示，上述浮动范围内的组 合物对于促进骨软骨组织修复的效果具有相似性。
由于篇幅所限，上述实验的方法、步骤以及相关数据在此不再赘述。
附图说明
图1：扫描电子显微镜检查图谱，其中，a、b、c分别代表组别，第一排为12周动物标本， 第二排为24周动物标本；
图2：组织学检查HE染色图谱，其中，a、b、c分别代表组别，第一排为12周动物标本，第 二排为24周动物标本；N为正常软骨，R为新生软骨；
图3：a组生物力学检查，Normal为正常软骨区，Mosaic为移植的骨软骨区，blank为手术时 的缺损区；
图4：b组生物力学检查，Normal为正常软骨区，Mosaic为移植的骨软骨区，Alginate为手术 时填充藻酸钙凝胶区；
图5：c组生物力学检查，Normal为正常软骨区，Mosaic为移植的骨软骨区，Alginate+ADSC 为手术时填充本发明组合物区。
图6：三组之间的生物力学比较。
具体实施方式
实施例1：
150ml组合物配方：

制备方法：
⑴提取并制备骨形态发生蛋白-4转染的脂肪来源干细胞；
取自体腹股沟处的脂肪组织。用大量PBS液冲洗去除表面血液，在1：1配置的PBS和0.1％Ⅰ 型胶原酶中用眼科剪剪碎，37℃消化30min后用含10％胎牛血清的DMEM中和消化液，取300g 离心5min，弃去含有成熟脂肪细胞的悬浮物，再含有脂肪组织来源干细胞的沉淀物中加入 160mM NH4Cl红细胞裂解液，室温静置10min，将其通过200-lm的尼龙筛，收取过滤物，用 含10％FBS,1％青链双抗的DMEM培养基在37℃/5％CO2培养箱过夜。原代细胞培养4-5天， 待其融和生长，以1：3给以传代。原代细胞标记为0代，所用细胞为第3代。
转染方法(组合物使用前24小时内操作)：将第3代脂肪组织干细胞等量种植于6孔板中， 达90％汇合后，弃生长培养基，取3个孔消化细胞并计数。按MOI＝100、250、400计算每孔所 需病毒(骨形态发生蛋白-4重组腺病毒)量，并在冰上让存储的病毒自发融化后取不同量的病 毒分别加到400μl无血清的DMEM液中。将6孔板中的完全培养液弃除，PBS清洗2遍后加入 病毒液，十字形晃动培养板让病毒液充分接触细胞，37℃孵育3小时，期间每20分钟晃动培养 板一次。3小时后吸弃病毒液并向每孔中加入1ml完全培养液继续培养。
取转染率大于85％的BMP-4转染ADSCs于约-70℃环境下储存，备用。
⑵制备海藻酸钠溶液：(100ml)
称取HEPES 0.48g，氯化钠0.88g，溶于80ml去离子水中，加热到60℃，保温，加入2.5g 海藻酸钠，持续搅拌，直到溶液混匀，冷却到室温后，滴加浓度为1N的盐酸调整pH 7.4，补充 去离子水至100ml，备用。
⑶制备氯化钙溶液：50ml
称取0.57g的氯化钙和0.12g的HEPES，溶于40ml去离子水中，滴加1N的盐酸使pH值为7.4 ，补充去离子水至50ml，0.22μm滤膜过滤，备用。
⑷临用前将步骤⑴得到的细胞悬浮于步骤⑵得到的海藻酸钠溶液中。具体是：将细胞用胰 酶从培养皿中消化下来，用血清中和胰酶，离心，其上清，培养基重旋离心的细胞，具体步骤 参考细胞培养；使细胞浓度达2×107/mL。
⑸将步骤⑷和步骤⑶所得物按体积比2:1的比例混合，混匀后得到本发明组合物。本发明 组合物在实际应用中，应在混合后立即将其注入体内填充区，注射完成交联基本完成，呈凝胶 状态。
实施例2：
150ml组合物配方：

制备方法：
与实施例1不同之处在于：
⑴提取并制备骨形态发生蛋白-4转染的脂肪来源干细胞；原代细胞标记为0代，所用细胞 为第5代；取转染率大于90％的BMP-4转染ADSCs于约-65℃环境下储存(转染步骤于组合物 应用前48小时内进行)，备用。
⑵制备海藻酸钠溶液：(100ml)
称取HEPES 0.6g，氯化钠0.75g，溶于70ml去离子水中，加热到70℃，保温，加入2.1g 海藻酸钠，持续搅拌，直到溶液混匀，冷却到室温后，滴加1N的盐酸，调整pH 7.35，补充去 离子水至100ml，备用。
⑶制备氯化钙溶液：50ml
称取0.45g的氯化钙和0.15g的HEPES，溶于47.5ml去离子水中，滴加1N的盐酸使pH值为 7.35，补充去离子水至50ml，0.22μm滤膜过滤，备用。
⑷临用前将步骤⑴得到的细胞悬浮于步骤⑵得到的海藻酸钠溶液中；使细胞浓度达 1.5×107/mL。
实施例3：
150ml组合物配方：

制备方法：
与实施例1不同之处在于：
⑴提取并制备骨形态发生蛋白-4转染的脂肪来源干细胞；原代细胞标记为0代，所用细胞 为第7代；取转染率大于70％的BMP-4转染ADSCs于约-75℃环境下储存，备用
⑵制备海藻酸钠溶液：(100ml)
称取HEPES 0.36g，氯化钠1.05g，溶于95ml去离子水中，加热到50℃，保温，加入2.7g 海藻酸钠，持续搅拌，直到溶液混匀，冷却到室温后，滴加1N的盐酸调整pH 7.45，补充去离 子水至100ml，备用。
⑶制备氯化钙溶液：50ml
称取0.75g的氯化钙和0.09g的HEPES，溶于25ml去离子水中，滴加1N的盐酸使pH值为7.45 ，补充去离子水至50ml，0.22μm滤膜过滤，备用。
⑷临用前将步骤⑴得到的细胞悬浮于步骤⑵得到的海藻酸钠溶液中；使细胞浓度达 0.75×107/mL。
实施例4：
150ml组合物配方：


制备方法与实施例1不同之处在于：
⑴提取并制备骨形态发生蛋白-4转染的脂肪来源干细胞；原代细胞标记为0代，所用细胞 为第10代；取转染率大于80％的BMP-4转染ADSCs于约-70℃环境下储存，备用
⑵制备海藻酸钠溶液：(100ml)
称取HEPES 0.46g，氯化钠0.9g，溶于90ml去离子水中，加热到80℃，保温，加入2.4g 海藻酸钠，持续搅拌，直到溶液混匀，冷却到室温后，滴加盐酸调整pH值至7.4，补充去离子 水至100ml，备用。
⑶制备氯化钙溶液：50ml
称取0.6g的氯化钙和0.12g的HEPES，溶于35ml去离子水中，滴加盐酸使pH值为7.4，补充 去离子水至50ml，0.22μm滤膜过滤，备用。
⑷临用前将步骤⑴得到的细胞悬浮于步骤⑵得到的海藻酸钠溶液中；使细胞浓度达 3×107/mL。
实施例5：
150ml组合物配方：

制备方法：
与实施例1不同之处在于：
⑴提取并制备骨形态发生蛋白-4转染的脂肪来源干细胞；原代细胞标记为0代，所用细胞 为第4代；取转染率大于90％的BMP-4转染ADSCs于约-70℃环境下储存，备用
⑷临用前将步骤⑴得到的细胞悬浮于步骤⑵得到的海藻酸钠溶液中；使细胞浓度达 2.25×107/mL。
实施例6：
150ml组合物配方：

制备方法同实施例1。
本发明不局限于上述实施方式，任何人在本发明的启示下得出的其他任何与本发明相同或 相近似的产品，均不排除在本发明的保护范围之外。