一种油溶/水溶有机无机三相多孔微纳复合骨修复材料.pdf

本发明公开了一种油溶/水溶有机-无机三相多孔微纳复合骨修复材料及其制备方法，从仿生角度出发，为了更好的模拟天然骨组织中的组分、结构与功能，选用壳聚糖、胶原作为水溶性有机基体，加入油溶性高分子材料聚乳酸改善性能，利用交联达到水溶相和油溶相的结合；利用杂化方法模仿天然骨组织中无机钙磷矿物在有机基质生物大分子调控下的原位析晶过程，在基质上合成纳米羟基磷灰石晶体；利用冷冻干燥相分离技术成型，制备类似天然骨细胞外基质的人工骨缺损修复支架。本发明程序简单，条件温和，制备的复合支架在组成与结构上与天然骨基质类似，并具备一种典型的微纳结构（微米级孔径尺寸及纳米晶体），性能优越，可塑性强，可被加工成所需形状。

权利要求书
1.  一种油溶/水溶有机-无机三相多孔微纳复合骨修复材料，其特征在于：以壳聚糖/胶原为水溶性有机相、聚乳酸为油溶性有机相，以可溶性钙盐和可溶性磷酸盐为无机相纳米羟基磷灰石的先驱物，采用原位杂化和冷冻干燥方法制得所述的油溶/水溶有机-无机三相多孔微纳复合骨修复材料。

2.  根据权利要求1所述的油溶/水溶有机-无机三相多孔微纳复合骨修复材料，其特征在于：制得的复合支架材料的孔径为70-180μm，表面分布粒径小于100nm的纳米羟基磷灰石晶体。

3.  一种制备如权利要求1所述的油溶/水溶有机-无机三相多孔微纳复合骨修复材料的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）将壳聚糖和胶原溶解于体积分数为1～2%的乙酸溶液中，将聚乳酸溶解于1,4-二氧六环中；
（2）在剧烈搅拌下，按照HAP的化学计量比Ca/P = 1.67在壳聚糖/胶原的乙酸溶液中分别加入2～3mol/L可溶性钙盐溶液和1.2～1.8mol/L可溶性磷酸盐溶液；
（3）缓慢加入聚乳酸溶液的1,4-二氧六环溶液，搅拌0.5～1h，使其充分混合均匀；
（4）加入EDC/NHS交联剂，常温交联4～8h后将混合液注入模具， 2～4℃冰箱预冷冻3～5h，转移至-10～-80℃冷冻至少12h；
（5）将冷冻样品转入冷冻干燥机中进行冷冻干燥至完全脱水；
（6）将冷冻干燥后的样品置于0.5～1.5mol/L碱溶液中浸泡8～15h，再用去离子水反复浸洗至中性，-10～-80℃冷藏后进行冷冻干燥，即得到所述的油溶/水溶有机-无机三相多孔微纳复合骨修复材料。

4.  根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的胶原为I型活性胶原蛋白。

5.  根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述的可溶性钙盐是硝酸钙或氯化钙，可溶性磷酸盐是磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠或磷酸二氢钠，二者间隔20～40min加入。

6.  根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（3）的最终混合液中，壳聚糖的浓度为16～20 g/L，胶原的浓度为2.5～5 g/L，聚乳酸浓度为2~4 g/L，加入的Ca/P前驱体溶液理论形成HAP量为10～20 g/L。

7.  根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（4）所述的交联剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺；交联剂1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺的浓度为2～4mg/mL，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为1～3mg/mL。

8.  根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（6）的碱溶液是0.5～1.5mol/L KOH或NaOH的乙醇/水溶液，其中乙醇与水的体积比为1～2:1。

说明书一种油溶/水溶有机-无机三相多孔微纳复合骨修复材料
技术领域
本发明属于骨组织修复支架材料制造领域，具体涉及一种油溶/水溶有机-无机三相多孔微纳复合骨修复材料及其制备方法。
背景技术
天然骨的基本组分包括水、以磷灰石为主的磷酸钙系矿物以及以胶原纤维为主的有机基质。骨中纳米尺度磷酸钙矿物的形核、生长、晶型、取向、大小、形状、有序排列等受到有机基质模板的调控，具有独特性质．胶原纤维的直径在50～500 nm之间，这种纳米纤维构成的有机基质不仅对矿化过程起到调控作用，而且通过与细胞之间的相互作用影响细胞粘附、增殖、迁移、分化等行为。以这些纳米尺度的结构单元为基础，骨组织形成了从微观、介观直到宏观尺度的复杂分级结构。三维仿骨修复支架材料不仅在成分上与骨相似，且其三维构型也为细胞提供三维的结构支架，解决细胞增值空间的问题，使细胞间形成适宜的空间分布和细胞连接，而且为细胞提供特异性的生长和分化信号，形成与体内组织相似的细胞生长微环境，引导组织形成。
近年来，研究者们通过仿生合成、交联处理、引入第三相等方法来提高胶原基纳米羟基磷灰石复合材料的性能。羟基磷灰石(Hydroxyapatite HAp) 在骨质中约占60%，表现为长度在20-40nm、厚度为1.5-3nm 的针状结晶，其周围规则地排列着骨胶原纤维，因此，纳米羟基磷灰石是仿骨成分中重要的一部分。然而，纯nHAp微粒其力学性能差，较脆，抗压强度和抗弯曲强度不够，为改善其不稳定性，有必要采用有机-无机方式制备复合材料以便获得强度高、生物相容性更好的骨组织支架材料满足生物医学需要。本研究中利用杂化仿生方法在壳聚糖-胶原有机基体上结晶纳米级羟基磷灰石晶体，这种方法作用条件温和，降低有机和无机界面的界面能，使得纳米晶体的结晶更易发生，并且达到均匀分布状态。
壳聚糖 (chitosan ,CS)是甲壳素脱乙酰基后的产物，由β-(1-4)-2-乙酰氨基-D-葡萄糖单元和β-(1-4)-2-氨基-D-葡萄糖单元共聚而成，基本单元为壳二糖，是自然界中少见的一种带正电荷的碱性多糖。壳聚糖的结构与细胞外基质的主要成分—糖胺聚糖十分类似，降解产物对人体无毒副作用，具有良好的生物降解性和生物相容性。胶原(collagen，Col)是一种天然蛋白质，广泛存在于动物的皮肤、骨、肌腱韧带和角膜等组织中，是动物体内含量最丰富的蛋白质。胶原作为药物载体及构建活性三维支架已得到广泛认可，因此采取壳聚糖与胶原交联做有机基体，二者能很好的复合，并且在体液环境中降解速率能满足骨组织工程的需要，保持稳定性。
而在高聚物的使用中，聚乳酸(Poly(lactic acid)，PLA)因其具有良好的生物可降解性、易加工性、无毒性、无刺激性等优点而在手术缝合线、骨折内固定、药物控释系统以及组织工程支架材料等生物医学领域有着较为广泛的应用。然而聚乳酸属油溶相，其细胞亲和力差，缺乏生物活性，因此利用壳聚糖裸露的氨基与聚乳酸分子链的羧基在交联反应条件下发生脱水缩合反应，使得油溶性的聚乳酸与水溶性的壳聚糖/胶原有机基质结合起来，最终使得各组分的优良性能得到充分地作用。
基于此，本研究以仿自然骨结构为出发点。以壳聚糖/胶原为有机模板，加入聚乳酸利用交联使得油溶性的聚乳酸与水溶性有机基质充分结合，采用原位杂化法结晶分布均匀的无机相纳米羟基磷灰石，在成分仿生的基础上进行结构仿生，形成微米级孔结构与纳米级羟基磷灰石晶体结合的一种微纳结构，利用冷冻干燥相分离技术，最终获得两相间均匀复合、存在化学键合且具有优良生物活性及其它生物学性能的壳聚糖/胶原/聚乳酸复合材料。
发明内容
本发明的目的在于提供一种油溶/水溶有机-无机三相多孔微纳复合骨修复材料及其制备方法。本发明制得的三维立体多孔支架以壳聚糖、胶原为有机基质，制备连通的微米级多孔支架，具有较好的孔隙率和多孔结构，并模拟生物矿化过程在支架上原位杂化形成纳米级羟基磷灰石，利用交联达成了与聚乳酸油溶相的结合，从而开发出一种新型实用的骨组织修复和替代材料。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
从仿生角度出发，选用壳聚糖、胶原、聚乳酸和羟基磷灰石组分的组合，利用冷冻干燥相分离技术结合原位杂化方法，在成分仿生的基础上进行结构仿生制备类似天然骨组织细胞外基质的人工骨缺损修复支架。三相结构指的是油溶相聚乳酸、水溶相有机基体及纳米无机相羟基磷灰石晶体。制得的复合支架材料的孔径为70-180μm，表面分布粒径小于100nm的纳米羟基磷灰石晶体。
一种制备油溶/水溶有机-无机三相多孔微纳复合骨修复材料的方法包括以下步骤：
（1）将壳聚糖和胶原溶解于体积分数为1～2%的乙酸溶液中，将聚乳酸溶解于1,4-二氧六环中；
（2）在剧烈搅拌下，按照HAP的化学计量比Ca/P = 1.67在壳聚糖/胶原的乙酸溶液中分别加入2～3mol/L可溶性钙盐溶液和1.2～1.8mol/L可溶性磷酸盐溶液；
（3）缓慢将聚乳酸溶液加入到步骤（2）的溶液中，搅拌0.5～1h，使其充分混合均匀；
（4）往步骤（3）的混合溶液中加入交联剂，常温交联4～8h，最终混合液注入模具，移至2～4℃冰箱预冷冻3～5h，再放入-10～-80℃冷冻至少12h；
（5）将步骤（4）所得的冷冻样品转入冷冻干燥机中进行冷冻干燥至完全脱水；
（6）将步骤（5）的干燥样品置于0.5～1.5mol/L的碱溶液中浸泡8～15h，再用去离子水反复浸洗至中性，-10～-80℃冷藏后进行冷冻干燥，即得到油溶/水溶有机-无机三相多孔纳米复合骨修复材料。
步骤（1）所述的胶原为I型活性胶原蛋白。
步骤（2）所述的可溶性钙盐是硝酸钙或氯化钙，可溶性磷酸盐是磷酸氢二钾或磷酸氢二钠。二者间隔20～40min加入。
步骤（3）的最终混合液中，壳聚糖的浓度为16～20g/L，胶原的浓度为2.5～5 g/L，聚乳酸浓度为2~4 g/L，加入的Ca/P前驱体溶液理论形成HAP量为10～20 g/L。
步骤（4）所述的交联剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)；交联剂EDC的浓度为2～4mg/mL，NHS的浓度为1～3mg/mL。
步骤（6）的碱溶液是0.5～1.5mol/L KOH或NaOH的乙醇/水(v:v=1～2:1)溶液。
本发明的显著优点在于：壳聚糖在组成和结构上与糖胺聚糖具有部分相似性，且生物相容性好；胶原蛋白是细胞外基质的重要成分之一，是一种天然蛋白质，可特异性识别并与细胞表面整连蛋白受体键合，促进细胞的黏附与生长。原位杂化形成的羟基磷灰石类似人体内生物矿化生成的羟基磷灰石，无毒、安全、具有良好的生物相容性、骨传导性，再加之聚乳酸具有良好的生物可降解性。因此，选用壳聚糖/胶原为有机基质，可溶性钙盐和可溶性磷酸盐为无机相纳米羟基磷灰石的先驱物，聚乳酸改善支架基体性能，并采用冷冻干燥相分离技术原位构筑与人体骨组织细胞外基质相近的人工骨缺损修复支架，相对于其他骨缺损修复支架有以下优点：
（1）从仿生角度出发, 利用带相反电荷的聚电解质间形成的离子键来自组装复合支架，可特异性识别并与细胞表面整连蛋白受体键合，促进细胞的黏附与生长；
（2）交联油溶性聚乳酸改善材料性能，同时分子终端基团提供成核位点，更好的控制了原位结晶羟基磷灰石的纳米尺寸，从而赋予复合材料优异的三维结构、生物相容性及机械性能；
（3）最终得到的复合材料具备油溶/水溶有机-无机三相结构，油溶相与水溶相的结合增强了材料的理化性能，赋予材料更高的稳定性，纳米无机相增强材料的表面能和相结合力，同时改善了材料的生物活性。
（4）油溶/水溶有机-无机三相多孔微纳复合骨修复材料保持了有机基体微米级、纳米级的多级孔径结构；同时采用原位杂化的制备方法，使得羟基磷灰石在支架上实现了纳米级分散，相界面的结合力得到加强。这种微纳结构的组建更有利于细胞的附着、铺展、迁移，培养液和代谢产物的运输及交换，从而有利于细胞生长；
（5）可以通过改变交联剂的用量来控制交联度，得到具有不同生物降解性能和力学性能的复合支架；
（6）该复合支架的制备工艺条件温和，操作方便。
附图说明
图1是油溶/水溶有机-无机三相多孔微纳复合骨修复材料的宏观数码图。
图2是油溶/水溶有机-无机三相多孔微纳复合骨修复材料扫描电镜SEM图。
图3是油溶/水溶有机-无机三相多孔微纳复合骨修复材料图2的孔壁表面放大图，观察到均匀分布的纳米晶粒。
图4是油溶/水溶有机-无机三相多孔微纳复合骨修复材料上附着的纳米粒的XRD衍射图谱。
图5是油溶/水溶有机-无机三相多孔微纳复合骨修复材料的红外FT-IR谱图。
图6是油溶/水溶有机-无机三相多孔微纳复合骨修复材料的接触角对比数据图。
图7-8是SD乳鼠成骨细胞与油溶/水溶有机-无机三相多孔微纳复合骨修复材料联合培养的MTT数据分析图。
图9 是SD乳鼠成骨细胞与油溶/水溶有机-无机三相多孔微纳复合骨修复材料组装体的AO/EB荧光染色图。
具体实施方式
实施例1
壳聚糖/鱼皮胶原/聚乳酸复合支架由以下质量百分比的组分制成：
壳聚糖                        2.0%
鱼皮胶原                      0.2%
聚乳酸                        0.1%
羟基磷灰石                    1.2%
余量为去离子水。
1）按照上述配比称取一定量的壳聚糖、胶原溶解于1%(v/v)乙酸溶液，一定量的聚乳酸溶解于1,4-二氧六环中，充分搅拌混合均匀；
2）配制2mol/L硝酸钙溶液，1.2mol/L磷酸氢二钾溶液，在剧烈搅拌下，按照HAP的化学计量比Ca/P = 1.67往上述有机组分混合溶液中分别加入一定体积的可溶性钙盐和可溶性磷酸盐溶液，二者间隔20min加入；
3）缓慢将聚乳酸溶液加入到壳聚糖/胶原乙酸溶液中，搅拌1h，使其充分混合均匀；
4）接着加入一定量的交联剂进行交联，常温交联5h ；EDC的浓度为2mg/mL ，NHS的浓度为1mg/mL；最终混合液注入模具，移至4℃冰箱预冷冻5h，再放入-10℃冷冻12h；
5）将步骤（5）所得的冷冻样品转入冷冻干燥机中进行冷冻干燥至完全脱水；
6）将上述所得干燥样品置于0.5mol/L KOH的乙醇/水溶液中浸泡10h，再用去离子水反复浸洗至中性，-10℃冷藏后进行冷冻干燥，即得到油溶/水溶有机-无机三相多孔微纳复合骨修复材料。
实施例2
壳聚糖/鱼皮胶原/聚乳酸复合支架由以下质量百分比的组分制成：
壳聚糖                        2.0%
鱼皮胶原                      0.2%
聚乳酸                        0.2%
羟基磷灰石                    1.2%
余量为去离子水。
1）按照上述配比称取一定量的壳聚糖、胶原溶解于1%(v/v)乙酸溶液，一定量的聚乳酸溶解于1,4-二氧六环中，充分搅拌混合均匀；
2）配制2mol/L硝酸钙溶液，1.2mol/L磷酸氢二钾溶液，在剧烈搅拌下，按照HAP的化学计量比Ca/P = 1.67往上述有机组分混合溶液中分别加入一定体积的可溶性钙盐和可溶性磷酸盐溶液，二者间隔20min加入；
3）缓慢将聚乳酸溶液加入到壳聚糖/胶原乙酸溶液中，搅拌1h，使其充分混合均匀；
4）接着加入一定量的交联剂进行交联，常温交联5h ；EDC的浓度为2mg/mL ，NHS的浓度为1mg/mL；最终混合液注入模具，移至4℃冰箱预冷冻5h，再放入-10℃冷冻12h；
5）将步骤（5）所得的冷冻样品转入冷冻干燥机中进行冷冻干燥至完全脱水；
6）将上述所得干燥样品置于0.5mol/L KOH的乙醇/水溶液中浸泡10h，再用去离子水反复浸洗至中性，-10℃冷藏后进行冷冻干燥，即得到油溶/水溶有机-无机三相多孔微纳复合骨修复材料。
实施例3
壳聚糖/鱼皮胶原/聚乳酸复合支架由以下质量百分比的组分制成：
壳聚糖                        2.0%
鱼皮胶原                      0.2%
聚乳酸                        0.3%
羟基磷灰石                    1.2%
余量为去离子水。
1）按照上述配比称取一定量的壳聚糖、胶原溶解于1%(v/v)乙酸溶液，一定量的聚乳酸溶解于1,4-二氧六环中，充分搅拌混合均匀；
2）配制2mol/L硝酸钙溶液，1.2mol/L磷酸氢二钾溶液，在剧烈搅拌下，按照HAP的化学计量比Ca/P = 1.67往上述有机组分混合溶液中分别加入一定体积的可溶性钙盐和可溶性磷酸盐溶液，二者间隔20min加入；
3）缓慢将聚乳酸溶液加入到壳聚糖/胶原乙酸溶液中，搅拌1h，使其充分混合均匀；
4）接着加入一定量的交联剂进行交联，常温交联5h ；EDC的浓度为2mg/mL ，NHS的浓度为1mg/mL；最终混合液注入模具，移至4℃冰箱预冷冻5h，再放入-10℃冷冻12h；
5）将步骤（5）所得的冷冻样品转入冷冻干燥机中进行冷冻干燥至完全脱水；
6）将上述所得干燥样品置于0.5mol/L KOH的乙醇/水溶液中浸泡10h，再用去离子水反复浸洗至中性，-10℃冷藏后进行冷冻干燥，即得到油溶/水溶有机-无机三相多孔微纳复合骨修复材料。
实施例4
壳聚糖/鱼皮胶原/聚乳酸复合支架由以下质量百分比的组分制成：
壳聚糖                        2.0%
鱼皮胶原                      0.2%
聚乳酸                        0.4%
羟基磷灰石                    1.2%
余量为去离子水。
1）按照上述配比称取一定量的壳聚糖、胶原溶解于1%(v/v)乙酸溶液，一定量的聚乳酸溶解于1,4-二氧六环中，充分搅拌混合均匀；
2）配制2mol/L硝酸钙溶液，1.2mol/L磷酸氢二钾溶液，在剧烈搅拌下，按照HAP的化学计量比Ca/P = 1.67往上述有机组分混合溶液中分别加入一定体积的可溶性钙盐和可溶性磷酸盐溶液，二者间隔20min加入；
3）缓慢将聚乳酸溶液加入到壳聚糖/胶原乙酸溶液中，搅拌1h，使其充分混合均匀；
4）接着加入一定量的交联剂进行交联，常温交联5h ；EDC的浓度为2mg/mL ，NHS的浓度为1mg/mL；最终混合液注入模具，移至4℃冰箱预冷冻5h，再放入-10℃冷冻12h；
5）将步骤（5）所得的冷冻样品转入冷冻干燥机中进行冷冻干燥至完全脱水；
6）将上述所得干燥样品置于0.5mol/L KOH的乙醇/水溶液中浸泡10h，再用去离子水反复浸洗至中性，-10℃冷藏后进行冷冻干燥，即得到油溶/水溶有机-无机三相多孔微纳复合骨修复材料。
将SD乳鼠成骨细胞与所制备的支架进行复合培养，考察油溶/水溶有机-无机三相多孔微纳复合骨修复材料的细胞学特性。
结论：本制备方法可以使得原位复合支架根据实际需要预成型成各种形状；由SEM图可以观察到支架形成较好的相互贯穿的微米级连通孔隙结构，支架孔壁上有均匀分布的细小的纳米颗粒。由支架的XRD图谱，可发现支架中的无机结晶物的衍射峰与HAP的特征峰一致，且其衍射峰存在宽化、弥散现象，表明支架中无机相的结晶粒度低，晶格发育不完整，与天然骨的无机相类似。由支架的FT-IR图谱可以发现1571cm-1的C-N伸缩振动得到了加强，说明-COOH和-NH2作用结合，且1031、603、563cm-1是羟基磷灰石中PO43-的振动吸收峰，说明了弱结晶纳米羟基磷灰石纳米相的生成。接触角数据分析说明材料具有良好的亲水性能，为细胞的生长提供了有利的附着环境。SD乳鼠成骨细胞与支架联合培养，MTT数据分析显示支架材料具有良好的生物细胞活性，从AO/EB荧光染色图可以看出，细胞在支架组装体环境下数量得到增殖，形态稳定，这也说明复合支架的细胞相容性好。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。