一种鸡坏死性肠炎的A、C型产气荚膜梭菌类毒素和菌体二价两类抗原疫苗的制备方法.pdf

本发明涉及动物细菌学领域，提供了一种鸡坏死性肠炎的A、C型产气荚膜梭菌类毒素和菌体二价两类抗原疫苗制备方法，该方法以A型、C型产气荚膜梭菌增菌液接种于产毒培养基中，在43℃厌氧环境下振荡培养5h产毒素。经甲醛灭活，加入佐剂乳化获得A、C型产气荚膜梭菌类毒素和菌体二价两类抗原疫苗。通过上述方法获得的疫苗免疫商品鸡，攻毒后其保护率达到100％，证明该类毒素和菌体抗原复合疫苗，既能针对细菌的感染致病作用，也能够针对细菌毒素的致病作用对家禽产生很好的免疫保护效果。

权利要求书
1.  一种鸡坏死性肠炎的A、C型产气荚膜梭菌类毒素和菌体二价两类抗原疫苗的制备方法， 具体步骤如下：
(1).菌种的复苏及增菌
将产气荚膜梭菌标准菌种A型NCTC528、C型NCTC3180分别接种于血琼脂平板，39℃在 厌氧箱中培养24h复苏；挑取一个典型菌落接种于7ml硫乙醇酸盐流体培养基中39℃厌氧增 菌培养12h；
(2).菌液的制备
上述获得的A型、C型产气荚膜梭菌增菌培养液均以4ml接种于100ml产毒培养基中， 43℃厌氧箱中160r/min振荡培养5h获得菌液；
(3).菌液的灭活
将制取的菌液用1MNaOH调pH至7.2，然后加入甲醛溶液使甲醛质量分数达到0.3％进 行灭活，充分振荡混匀置于37℃摇床，4天后灭活完全；
(4).疫苗的制备
灭活检验合格的菌液与灭菌的白油佐剂按体积比1：2的比例充分乳化，并按照每100毫 升上述乳化混合液加入0.01克硫柳汞的比例加入硫柳汞即可获得疫苗；
其中所述的产毒培养基，其获得方法如下：2.5克蛋白胨、2克酵母提取物、1.5克糊精、 1.4克L-精氨酸溶于100mlPBS缓冲液，以1M HCl调pH至7.4即得；
所述的酵母提取物是试剂YEAST EXTRACT。

2.  根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：所述厌氧箱内气体组成按体积分数如下： 88％N2，7％H2，5％CO2。

3.  根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：所述的血琼脂为1g葡萄糖和3.8g豆琼 脂粉溶于100ml蒸馏水灭菌后，加入5ml绵羊血获得。

说明书一种鸡坏死性肠炎的A、C型产气荚膜梭菌类毒素和菌体二价两类抗原疫苗的制备方法
技术领域
本发明涉及动物细菌学领域，本发明提供了一种鸡坏死性肠炎的A、C型产气荚膜梭菌 类毒素和菌体二价两类抗原疫苗的制备方法。
背景技术
坏死性肠炎(Necrotic Enteritis，简称NE)主要由A型或C型产气荚膜梭菌引起， 但C型不普遍。产生肠黏膜坏死等特征性病变，病死禽以肝肿大、肠道出血和肠黏膜有麸皮 样坏死灶为特征。多种禽类可发生此病，已证实坏死性肠炎在肉鸡、蛋鸡、火鸡和鹌鹑中都 有发生。随着对抗生素类促生长剂的禁用，该病在全世界主要养禽的国家和地区都有发生， 全球经济损失达20亿美元。
产气荚膜梭菌是厌氧、产孢子、革兰氏阳性大杆菌。它是脊椎动物肠道共栖菌，但在正 常宿主肠道内数量较低。它也是一种条件致病菌，如果条件适宜，会在肠道大量繁殖。产气 荚膜梭菌致病主要是其产生的外毒素引起。可产生至少17种毒素或潜在毒性的外源蛋白， 根据起主要致病作用的α、β、ε、ι毒素可将其分为A、B、C、D、E 5个产毒素型。
目前研究，肉用种母鸡免疫A型和C型类毒素可产生较强的IgY血清抗体反应，并 可传递给后代，虽然A型抗体应答高于C型，但免疫C型类毒素对亚临床坏死性肠炎和肝 炎的肉鸡保护效果更为显著。2010年Crouch等运用NetvaxTM公司的A型类毒素与轻质 矿物油乳化成苗，肌肉注射免疫接种肉种母鸡安全，精神状态和生产性能无全身副反应，可 明显减少由NE引起的后代仔鸡的死亡和肠道损伤。2011年，Saleh等运用当地流行毒株制 备A型、C型及A+C型类毒素，皮下注射免疫7日龄商品肉鸡，0.5ml/只，21日龄以 同样剂量及途径加免一次，在35日龄进行混喂(2L产气荚膜梭菌肉汤培养物+1kg饲料 或1L产气荚膜梭菌肉汤培养物+2L水)攻毒，结果证明免疫鸡，特别免疫A+C型类 毒素的鸡肠道损伤明显下降，但是上述方法中采用的是直接以类毒素免疫肉鸡，具有较多的 局限性，如免疫期短，需要多次加强免疫等缺陷。因此如何克服上述缺陷，对于疫苗的研制 具有很重要的意义。
发明内容
本发明提供了一种鸡坏死性肠炎的A、C型产气荚膜梭菌类毒素和菌体二价两类抗原疫 苗的制备方法，该方法以A型、C型产气荚膜梭菌增菌液各4ml接种于产毒培养基中，在43℃ 厌氧环境下(88％N2、7％H2、5％CO2)振荡培养5h。经甲醛灭活，加入佐剂乳化获得A、C型产 气荚膜梭菌类毒素和菌体二价两类抗原疫苗。通过上述方法获得的疫苗，含有α、β两种主要 毒素抗原，且类毒素和产气荚膜梭菌菌体抗原成分俱全，对于产气荚膜梭菌感染引起的家禽 的坏死性肠炎有着极佳的免疫效果，免疫商品鸡攻毒后其保护率达到100％，证明该类毒素和 菌体抗原复合疫苗，既能针对细菌的感染致病作用，也能够针对细菌毒素的致病作用对家禽 产生很好的免疫保护效果。
发明人在本发明中所采用的A、C型产气荚膜梭菌采用现有菌种，特别选自标准菌种A 型NCTC528、C型NCTC3180(均保藏于National Collection of Type Cultures英国微生物 菌种保藏中心)，可通过现有渠道直接获得，故而该生物材料属于现有技术中可直接获得的材 料，不需进行单独的生物保藏。
本发明的具体技术方案如下：具体步骤如下：
(1).菌种的复苏及增菌
将产气荚膜梭菌标准菌种A型NCTC528、C型NCTC3180分别接种于血琼脂平板，39℃在 厌氧箱中培养24h复苏；挑取一个典型菌落接种于7ml硫乙醇酸盐流体培养基中39℃厌氧增 菌培养12h；
(2).菌液的制备
上述获得的A型、C型产气荚膜梭菌增菌培养液均以4ml接种于100ml产毒培养基中， 43℃厌氧箱中160r/min振荡培养5h获得菌液；
(3).菌液的灭活
将制取的菌液用1MNaOH调pH至7.2，然后加入甲醛溶液使甲醛质量分数达到0.3％进 行灭活，充分振荡混匀置于37℃摇床，4天后灭活完全；
(4).疫苗的制备
灭活检验合格的菌液与灭菌的白油佐剂按体积比1：2的比例充分乳化，并按照每100毫 升上述乳化混合液加入0.01克硫柳汞的比例加入硫柳汞即可获得疫苗；
其中所述的产毒培养基，其获得方法如下：2.5克蛋白胨、2克酵母提取物、1.5克糊精、 1.4克L-精氨酸溶于100mlPBS缓冲液，以1M HCl调pH至7.4即得；
所述的酵母提取为是试剂YEAST EXTRACT，市场直接购得。
上述培养基为发明人针对本发明的产气荚膜梭菌设计的全新培养基，较之现有的培养基 可以更好的符合产气荚膜梭菌培养产毒的需要，具有明显的针对性和有效性，且配制工艺简 便、节约生产成本且稳定性好，能够满足工业化生产之要求。
其中所述厌氧箱内气体组成按体积分数如下：88％N2，7％H2，5％CO2；
所述的血琼脂为1g葡萄糖和3.8g豆琼脂粉溶于100ml蒸馏水灭菌后，加入5ml绵羊血 获得。
其中，为了获得A型和C型菌的最佳接种比例，发明人在步骤菌液的制备时，将A型、 C型产气荚膜梭菌增菌培养液接种体积比分为2ml：6ml、4ml：4ml、6ml：2ml三组分别进行 了对应的培养试验，之后利用常规的双夹心ELISA试剂盒测定各组产毒素量，测定结果接种 比例为4ml：4ml时，产毒素量最大，故而选择该体积比。
为了验证上述疫苗的效果，发明人对其进行了效力检测，具体方法如下：
9日龄健康易感鸡10只，其中5只皮下注射上述疫苗0.1ml，另5只鸡不接种作对照， 21日后各肌肉注射致死量的A、C型产气荚膜梭菌毒素，观察10日，对照组全部死亡，免疫 组全部存活，表明该疫苗对鸡的保护率为100％。
综上所述，本发明所获得的疫苗与现有弱毒疫苗、基因工程疫苗相比，具有如下有益效 果：(1)本发明疫苗含有α毒素和β毒素两种与鸡坏死性肠炎相关的毒素抗原，并通过双夹 心ELISA方法测定A型和C型菌的接种比例，结果表明接种比例在4ml：4ml时达到最高产毒 素量；(2)由于产毒素量高，疫苗中每单位所含的类毒素抗原高，机体相应产生抗毒素抗体 高，动物保护率高。疾病发生时，机体产生的抗毒素抗体可直接中和产气荚膜梭菌产生的外 毒素，达到良好的免疫预防效果。
具体实施方式
实施例1
一种鸡坏死性肠炎的A、C型产气荚膜梭菌类毒素和菌体二价两类抗原疫苗的制备方法， 具体步骤如下：
(1).菌种的复苏及增菌
将产气荚膜梭菌标准菌种A型NCTC528、C型NCTC3180分别接种于血琼脂平板，39℃在 厌氧箱中培养24h复苏；挑取一个典型菌落接种于7ml硫乙醇酸盐流体培养基中39℃厌氧增 菌培养12h；
(2).菌液的制备
上述获得的A型、C型产气荚膜梭菌增菌培养液均以4ml接种于100ml产毒培养基中， 43℃厌氧箱中160r/min振荡培养5h获得菌液；
(3).菌液的灭活
将制取的菌液用1MNaOH调pH至7.2，然后加入甲醛溶液使甲醛质量分数达到0.3％进 行灭活，充分振荡混匀置于37℃摇床，4天后灭活完全；
(4).疫苗的制备
灭活检验合格的菌液与灭菌的白油佐剂按体积比1：2的比例充分乳化，并按照每100毫 升上述乳化混合液加入0.01克硫柳汞的比例加入硫柳汞即可获得疫苗；
其中所述的产毒培养基，其获得方法如下：2.5克蛋白胨、2克酵母提取物、1.5克糊精、 1.4克L-精氨酸溶于100mlPBS缓冲液，以1M HCl调pH至7.4即得；
所述的酵母提取为是试剂YEAST EXTRACT，市场直接购得。
其中所述厌氧箱内气体组成按体积分数如下：88％N2，7％H2，5％CO2；
所述的血琼脂为1g葡萄糖和3.8g豆琼脂粉溶于100ml蒸馏水灭菌后，加入5ml绵羊血 获得。
实施例2
疫苗效力检验，具体方法如下：
9日龄健康易感鸡10只，其中5只皮下注射实施例1中获得的疫苗0.1ml，另5只鸡不 接种作对照，21日后各肌肉注射致死量的A、C型产气荚膜梭菌毒素，观察10日，对照组全 部死亡，免疫组全部存活，表明该疫苗对鸡的保护率为100％，证明该类毒素和菌体抗原复合 疫苗，既能针对细菌的感染致病作用，也能够针对细菌毒素的致病作用对家禽产生很好的免 疫保护效果。