一种抗肿瘤抗生素和其药学上可接受的盐、及其制备方法和用途 【技术领域】
本发明涉及一种抗肿瘤抗生素NC0604和其药学上可接受的盐，及其制备方法和用途，属于微生物发酵领域。
背景技术
博莱霉素是一类具有独特结构和独特作用的广谱抗菌抗肿瘤抗生素，博莱霉素抗生素的分子结构：
A2 R＝-NH(CH2)3S(CH3)3
B2 R＝-NH(CH2)4NHC(＝NH)NH2
博莱霉素(A2+B2为主)具有有效的抗淋巴、头、颈癌和生殖细胞肿瘤的作用。博莱霉素在肿瘤治疗过程中的骨髓抑制作用和免疫抑制作用都很低，因此已成为临床上广泛应用的抗肿瘤药。然而，因为会产生剂量依赖型肺纤维化的副作用，使其应用受到局限。因此开发疗效好，肺毒性低的新的博莱霉素族化合物一直是研究的热点。
本发明研究人员在研究过程中发现了一种与已知博莱霉素族化合物结构有所不同的新的化合物，并对其生物活性和肺毒性作用进行了初步检测，发现与临床在用的博莱霉素相比，其活性更好，肺毒性更低。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种抗肿瘤活性更好而肺毒性更低的具有更好开发前景的博莱霉素族新抗生素化合物。
本发明的另一目的是提供一种博莱霉素族抗肿瘤抗生素化合物在药学上可接受的盐。
本发明的再一目的是提供一种博莱霉素族抗肿瘤抗生素化合物及其在药学上可接受的盐的微生物发酵、分离、提取方法。
本发明的再一目的是提供一组博莱霉素族抗肿瘤抗生素化合物及其在药学上可接受的盐在抗肿瘤药物上的用途。
为了实现本发明目的，本发明提供具有结构式(I)的博莱霉素族抗肿瘤抗生素NC0604及其所形成的在药学上可接受的盐：
其中，R为-NH-(CH2)3-NH-(CH2)4-NH-CH2-CH2-CONH2。
所述的药学上可接受的盐为盐酸盐、硫酸盐、其他无机酸盐或有机酸盐。
本发明博莱霉素族抗肿瘤抗生素化合物NC0604分子量为1510，分子式为：C60H94N20O22S2，其生物学性质和理化性质如下：
1.颜色：无定形白色粉末。
2.熔点：无固定熔点，随温度升高，颜色加深。
3.溶解性：易溶于水、甲醇，微溶于乙醇，不溶于丙酮、氯仿等低极性有机溶剂。
4.颜色反应：胍基反应阴性，茚三酮反应不典型；与Cu2+螯合形成蓝色的螯合物。
5.紫外光谱：含铜品水溶液的紫外光谱在243～245、292～295nm处有两个最大吸收峰，并且两峰的比值为1.23，脱铜后243～245nm处的吸收峰变为肩峰，是典型的博莱霉素族的紫外吸收光谱。脱铜品及含铜品的紫外光谱分别见图1和图2。
6.红外光谱：其红外光谱在3200～3400cm-1(OH/NH)，1720cm-1(C＝O)，1650和1550cm-1(CONH)以及1050cm-1(OH)有特征吸收峰，表明其分子中具有糖肽类结构。见图3。
7.质谱：图4是NC0604的MALDI-TOF质谱图，显示其[M+H]+峰为m/z 1511。图5是MS-MS高分辩质谱图(a)及给出的元素组成报告(b)，提供NC0604的分子式为C60H95N20O22S2。
8.核磁共振谱：图6是NC0604的1H-NMR谱图，在δH7～9ppm有四个芳香质子信号，分别归属为博莱霉素分子主核中两个噻唑环和咪唑环的四个质子，它们是博莱霉素族化合物具有鉴别意义的特征。图7是其13C-NMR谱图，根据已报道的博莱霉素族化合物的13C-NMR，对照已知化学位移数据及1H-1H COSY(图8)，HSQC(图9)和HMBC(图10)，对NC0604的核磁共振谱进行了研究并对13C信号进行了归属，见表1，最终确证了其结构。
表1 NC060413C-NMR谱各峰归属
9.抗菌活性：如表2所示。可以看出NC0604具有广谱抗菌作用。
表2 NC0604抗菌活性
10.抗肿瘤活性：
MTT法和克隆形成率法检测了NC0604和Bleomycin对不同类型肿瘤细胞的生长抑制作用，结果表明，NC0604对KB、HepG2、MCF-7和MCF-7/DOX细胞的抑制作用要敏感得多。这几种细胞在两种药物作用下的生存活力曲线如图11a-h。
11.肺毒性：
羟脯氨酸(HYP)含量的变化是反映肺毒性的一个指标，羟脯氨酸含量升高，说明肺毒性增强。在对昆明白小鼠分别连续腹腔注射Bleomycin和NC0604十六天，停药二十八天后处死，检测肺组织HYP含量如表3。NC0604和Bleomycin给药组经统计学检验，p＜0.01，差异非常显著。
表3药物作用下鼠肺组织HYP含量
药物HYP(μg/mg组织湿重) Control(同剂量生理盐水)0.7100±0.07407 NC06040.7750±0.04037 Bleomycin博来霉素1.0750±0.04950
采用轮枝链霉菌属的微生物可获得本发明所述NC0604化合物，优选的是轮枝链霉菌平阳变种(Streptomyces verticillus var.Pingyangensis n.sp)，可先采用适宜的培养基培养轮枝链霉菌平阳变种(Streptomyces verticillus var.Pingyangensis n.sp)；然后从发酵液中分离含有本发明的粗提物，再从粗提物中分离纯化得到NC0604。
本发明所述NC0604的制备方法，包括发酵培养、分离、提取和精制，发酵培养所用的菌株为轮枝链霉菌平阳变种(Streptomycesverticillus var.Pingyangensis n.sp)。
用于培养所述微生物的培养基中，采用可被其利用的营养源即碳源、氮源、无机盐、有机盐和能被其利用地痕量营养物，这些成分可预先一次性地加入培养基中，或者间歇或者连续地加入培养基中。
对本发明所用的较好的微生物来说，可采用如下培养基(按重量计)：葡萄糖0.4～0.6％；豆饼粉3～4％；玉米浆0.4～0.6％；NaCl4～5％；玉米粉1～3％；淀粉2.0～3.0％；KH2PO4 0.01～0.02％；ZnSO40.04～0.06％；CuSO4 0.08～0.12％；玉米油0.3～0.5％，其余为水，调pH值为6.0～6.5。
培养的方式可采用静态培养、摇床培养、搅拌培养、浸没培养或其它方式，但对大量生产来说，优选为浸没培养。
培养条件(时间、温度、pH等)随菌种不同而变，也随培养基成分的变化有所不同，本领域技术人员按照培养工艺能够根据具体情况而选择。
在发酵产生NC0604的过程中，可加入也可不加入NC0604的前体物质或者通过微生物代谢能够产生NC0604侧链(R基团)的物质。
当NC0604在培养基中积累达到最大浓度时终止培养，从发酵液中分离含有化合物的粗品，可采用发酵产物的一般提取分离方法进行。例如，可使用吸附、离子交换、冷干等方法，亦可在每一分离步骤中将二种或以上的方法结合使用。更详细地说，按照常规方法，首先进行过滤或离心，分离出固形的菌丝和培养滤液，本发明的化合物主要存在于培养滤液中，将培养滤液用大孔树脂进行层析、浓缩，收集活性成分，减压蒸馏除去有机溶剂，减压冷冻干燥，即得到NC0604物质的粗品。
为了从粗品中进一步精制，可进一步采用大孔吸附树脂吸附层析、离子交换、葡聚糖凝胶层析等。如果有必要进一步精制时，可重复采用上述方法以制得高纯度的NC0604。NC0604可以游离的形式得到分离，也可以药学上可接受的盐的形式(如盐酸盐、硫酸盐、其它无机酸盐或有机酸盐，尤其是盐酸盐的形式)得到分离。如果需要，可以用本领域常规方法将NC0604的盐的形式转化成游离形式，或将游离形式转化成药学上可接受的盐如盐酸盐、硫酸盐、其它无机酸盐或有机酸盐中的一种。
含铜品的脱铜方法可以是八羟基喹啉法、H2S法、Na2S法，二苯磺卡贝松法，EDTA法。
对分离、提取及精制过程中NC0604物质的确认，可使用本物质对其有抑制作用的微生物，如枯草杆菌(Bacillus subtilis)的生物检测法或凝胶法或高效液相法，二者或三者并用更好。
本发明所述的化合物及其在药学上可接受的盐具有广谱抗菌和较好的抗肿瘤活性，可用于制备抗肿瘤药物。
采用本发明的微生物发酵方法而精制得到的NC0604物质，用作医药组成物时的给药形态，可为片剂、胶囊、注射剂，亦可根据其活性的进一步研究与各种适于药用的载体、添加剂、赋形剂、稀释剂和溶剂等混合而开发成适用的制剂形式，如软膏，霜剂，酊剂、微胶囊等制剂。这些制剂都可采用本领域技术人员熟知常用的制备方法而获得。
本发明所用的微生物发酵方法采用本领域熟知的轮枝链霉菌发酵条件，工艺简单。
本发明所用轮枝链霉菌平阳变种(Streptomyces verticillus var.Pingyangensis n.sp)，为已知菌株，有关其形态特征、培养特征、生理特性、碳源利用及其产物的抗菌谱等已有文献记载(赵仪英等，微生物学报，1979，19(4)：361-364)。
【附图说明】
图1为本发明所述化合物NC0604的紫外谱图；
图2为本发明所述化合物NC0604含铜品的紫外谱图；
图3为本发明所述化合物NC0604的红外谱图；
图4为本发明所述化合物NC0604的MALDI-TOF质谱图；
图5a为本发明所述化合物NC0604的MS-MS高分辩质谱图；
图5b为本发明所述化合物NC0604的元素组成报告；
图6为本发明所述化合物NC0604溶于D2O中的1H-NMR谱图；
图7为本发明所述化合物NC0604溶于D2O中的13C-NMR谱图；
图8为本发明所述化合物NC0604溶于D2O中1H-1HCOSY谱
图9为本发明所述化合物NC0604溶于D2O中的HSQC谱图；
图10为本发明所述化合物NC0604溶于D2O中的HMBC谱图；
图11a为MTT法检测Bleomycin、Nc0604对KB细胞增殖的影响；
图11b为MTT法检测Bleomycin、Nc0604对HepG2细胞增殖的影响；
图11c为MTT法检测Bleomycin、Nc0604对MCF-7细胞增殖的影响；
图11d为MTT法检测Bleomycin、Nc0604对MCF-7/DOX细胞增殖的影响；
图11e为Colony Formation法检测Bleomycin、Nc0604对KB细胞增殖的影响；
图11f为Colony Formation法检测Bleomycin、Nc0604对HepG2细胞增殖的影响；
图11g为Colony Formation法检测Bleomycin、Nc0604对MCF-7细胞增殖的影响；
图11h为Colony Formation法检测Bleomycin、Nc0604对MCF-7/DOX细胞增殖的影响。
【具体实施方式】
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1 发酵
由葡萄糖1.0％；蛋白胨0.5％；淀粉1.0％；NaCl 0.5％；琼脂2.0％(pH7.2-7.5)为斜面培养基，120℃下灭菌30分钟，制成斜面，于37℃恒温3天。至表面水分稍干，无杂菌生长时，接种到轮枝链霉菌平阳变种菌种孢子(Streptomyces verticillus var.Pingyangensis n.sp)，于28℃培养8天，外观为白色，气生菌丝丰满呈绒毛状，无染菌时即可收取使用。在多个500ml玻璃瓶中分别装入100ml培养基(培养基成分：淀粉2.5％，葡萄糖0.5％，豆饼粉3.5％，KH2PO4 0.1％，ZnSO40.05％，CuSO4 0.01％，pH自然)。加棉塞，于120℃下灭菌30分钟，由斜面挖块接种。28℃在旋转摇床旋转培养48小时后，作为种子。
然后将与种子培养基相同成分的发酵培养基(pH自然)，在500ml的三角瓶中分装100ml，灭菌后加入2％上述培养的种子，29℃旋转培养7-8天后收获发酵液。
实施例2 提取纯化
将实施例1的发酵培养液(25升)用草酸溶液调pH2～3，过滤，滤液通过122(H+)阳离子交换树脂(1升)吸附，后用0.3mol/L HCl(4升)洗脱，活性部分调pH至7.0，并加适量CuSO4溶液使其充分螯合Cu2+，然后用大孔吸附树脂进行脱盐，用含0.01M HCl的20％丙酮溶液洗脱，收集洗脱液并除去丙酮后进行CM-SephadexC-25(NH4+)柱层析，用0.1～1M的NH4Cl梯度洗脱，分离得到NC0604含铜品洗脱液，再经大孔吸附树脂脱盐，脱盐后的洗脱液经真空浓缩及冷冻干燥即可得到蓝色的NC0604含铜纯品(313mg)。将含铜品在酸性甲醇(pH2)中用二苯磺卡贝松进行脱铜处理，用丙酮沉淀，将沉淀溶于水后再进行真空浓缩及冷冻干燥即得到NC0604盐酸盐纯品(266mg)。
实施例3提取纯化
将实施例1的发酵培养液(25升)用草酸溶液调pH2～3，过滤，滤液通过151(H+)离子交换树脂(1升)吸附，水洗后用0.3mol/LHCl(4升)洗脱，活性部分调pH至6.5并加适量CuSO4溶液使其充分螯合Cu2+，然后用大孔吸附树脂4006进行脱盐，用含0.01M HCl的10％丙酮溶液洗脱，收集洗脱液，除去丙酮后用氨水调pH6.5，进行CM-Sephadex C-25(NH4+)柱层析，水冲洗柱子后，用0.1～1M的NH4Cl梯度洗脱，按峰位收集，合并。分离得到NC0604含铜品洗脱液，再经大孔吸附树脂脱盐，脱盐后的洗脱液经真空浓缩及冷冻干燥即可得到蓝色的NC0604含铜纯品(336mg)。将含铜品用含5％NaCl和5％EDTA二钠盐的水溶液洗脱，除去产物螯合的铜，得NC0604盐酸盐纯品(290mg)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。