具有降低血清胆固醇的发酵酸乳.pdf

本发明公开了一种具有降低血清胆固醇的发酵酸乳，其中乳酸菌GL—03、保加利亚杆菌和嗜热链球菌3种混合菌种和山楂提取物经发酵制得；所述乳酸菌GL—03、所述保加利亚杆菌和所述嗜热链球菌之间的比例为：1.0：0.5—1.0：0.5～1.0。本发明的乳酸菌GL—03体外培养试验表明其有很强的耐酸、耐胆盐能力，粘附性好，对常见的肠道致病菌有明显的抑制作用，不携带耐药性因子，是一种适宜于人体肠道定植的乳酸菌，同时体外胆固醇降解率可达56％，具有降低血清胆固醇的功能。

权利要求书
1.  具有降低血清胆固醇的发酵酸乳，其特征在于：乳酸菌GL—03、保加 利亚杆菌和嗜热链球菌3种混合菌种和山楂提取物经发酵制得；所述乳酸菌 GL—03、所述保加利亚杆菌和所述嗜热链球菌之间的比例为：1.0：0.5— 1.0：0.5～1.0。

说明书具有降低血清胆固醇的发酵酸乳
技术领域
本发明涉及降胆固醇功能酸乳的技术领域，具体涉及一种具有降低血清 胆固醇的发酵酸乳。
背景技术
随着社会的发展、科技的进步，人们生活水平不断提高，日常膳食营养 也日益增加，但随之而来的负面影响是动脉粥样硬化、冠心病等心脑血管疾 病的发生率不断攀升。根据世界卫生组织公布的1996年度卫生统计年鉴， 全球因心血管疾病死亡1530万人，占总死亡人数的29％，心血管疾病因此 而高居世界五大死因之首，而它们共同的病理基础都是动脉硬化。动脉粥样 硬化由许多因素促成，其中最重要的危险因素是高脂血症即血胆固醇和血甘 油三脂的升高。因而，保持血液中胆固醇浓度在正常范围内，对于预防动脉 粥样硬化和心脑血管疾病是至关重要的。
美国、我国国内的营养和医学专家推荐食物胆固醇的摄入量标准为250 —300mg／d／人。但随着人民生活水平的不断提高和膳食营养的增加，胆固 醇的摄入量很容易超标。据上海市心血管病研究所在1997-1999年间对3467 名上海居民的调查，由于每日的营养摄取量比20世纪70年代有明显增加， 脂肪由24.1％增至31.8％，胆固醇由282mg上升至388mg，而碳水化合物 则由65.7％降至53.7％，上海人的血脂则明显增高。因此研究不影响食 品风味，经济实用的降低食品和人体血清胆固醇的方法，已成为当前改善食 品质量、提高人们生活水平重要的研究课题。
国外对降胆固醇乳酸菌的研究起步较早。1977年，Gilliland对肠道乳 杆菌降胆固醇作用进行了研究，提出乳杆菌在生长过程中通过降解胆盐促进 胆固醇的分解代谢，从而降低胆固醇含量的观点。随后Rasic等也证实了嗜 酸乳杆菌和两双歧杆菌对胆固醇的脱除作用。迄今为止人体及动物实验也证 明了乳酸菌的降胆固醇作用。
我国国内关于乳酸菌降胆固醇方面的研究起步较晚，且多数都停留在体 外研究的水平，还未见有成功的降胆固醇乳酸菌类产品的报道和问世。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有降低血清胆固醇的发酵酸乳。其中主要 包括高效降胆固醇乳酸菌的分离筛选、降胆固醇酸乳发酵的配方、降胆固醇 酸乳的发酵工艺条件。
本发明所提供的技术方案是：
具有降低血清胆固醇的发酵酸乳，其特征在于：乳酸菌GL—03、保加利 亚杆菌和嗜热链球菌3种混合菌种和山楂提取物经发酵制得；所述乳酸菌GL —03、所述保加利亚杆菌和所述嗜热链球菌之间的比例为：1.0：0.5—1.0∶ 0.5～1.0。
本发明还提供了降低血清胆固醇的发酵酸乳的制备方法，其所涉及的工 艺方法有：
1.降胆固醇乳酸菌GL-03的筛选及胆固醇降解诱导
本发明所用的菌种为从天然发酵干酪中筛选出的高效降胆固醇的乳酸 菌GL—03，经16SrDNA测序鉴定为干酪乳杆菌干酪亚种(／ 6ctobaciJluscaseisubsp.casef)。降胆固醇乳酸菌乩—03经底物诱导试 验，其胆固醇降解率从诱导前的50％增加到56％，同时其具有较好的耐胃 酸、耐胆盐及对小肠上皮细胞粘附性、抑制致病菌等特性，是一种适宜于定 植人体肠道的益生菌。
分离筛选方法：称取适量天然发酵干酪，经无菌水稀释后，无菌操作吸 取2ml加入灭菌的脱脂乳中，37℃静置富集培养48h。无菌操作取1ml上述 富集培养液加入含9ml无菌的改良KENJI选择性培养基(含0.04％溴百里香 草酚兰)中，37℃振荡培养1—2天，然后取培养液100虬加到同样的培养基 里培养，共需三次转管培养。根据培养基的比混浊度和指示剂颜色的变化， 取第三次培养后的菌液200pL加入到pH2的MRS液体培养基培养6h，取其 100ml培养液转接
到含0.30％猪胆盐MRS液体培养基中培养24h，然后取200pL培养液 的涂布在改良MRS平板上，37℃叵温培养48—72h。挑取产酸的典型菌落， 反复的划线分离、纯化，革兰氏染色、镜检，至纯菌落为止。然后，经16SrDNA 测序进行菌种鉴定。
定向诱导：将选育的乳酸菌GL-03活化后，定量加到含0.25％胆固醇 的KENJI发酵培养基中进行培养，每培养一次胆固醇的浓度都要增加 0.15％，五次驯化培养后，使培养基中胆固醇的含量达到1mg／mL。选择生 长良好的乳酸菌GL-03，在含胆固醇0.1mg／mL的MRS液体培养基中，测定 其在诱导驯化前后的胆固醇降解率的变化，从中筛选出降胆固醇能力提高较 大的菌株。
2.本发明提供的降低血清胆固醇的发酵酸乳的制备方法，其包括的工艺步骤 为：
(一)原料准备
(1)菌种活化和发酵剂制作
将冰箱保藏的经分离筛选、定向诱导而得乳酸菌GL—03、保加利亚杆菌 和嗜热链球菌由MRS斜面转接到液体MRS培养基中，37℃培养12h，活化三 次；活化的菌种按2％接种到灭菌的含10％(W／V)的脱脂奶粉液体中，37℃ 培养至凝乳，转接三次制成发酵剂；
(2)山楂提取物的制备
粉碎后的山楂50克，加4—7.5倍的水，浸泡2.1～3.5h，煮沸后用纹 火持续32—40min滤出煎液，滤渣继而分别加3—5倍、2～4的水，用相同 的方法进行20～30min的二煎、三煎，合并滤液浓缩至100mL，取上清液， 115℃灭菌15min，4℃冰箱保存备用；
(二)发酵酸乳的制备：
(3)原料配方

其中三种混合菌种为乳酸菌GL—03、保加利亚杆菌和嗜热链球菌3种菌 混合。
(4)工艺步骤
1)原料奶经奶检、净化、待用；
2)将蔗糖、稳定剂用少量乳液于50—60℃溶解，加入净化后的奶液中， 搅拌均匀，升温至58—62℃，15—17Mpa进行均质；
3)将均质后的奶液加热至88—92℃，5min灭菌，然后降温至43℃，接 种；
4)接种后于40～45℃,叵温室发酵4—5h，至pH4.6—4.8，迅速冷却 到10℃以下，并移至0—4℃冷库冷藏后熟。
3.降胆固醇酸乳质量标准
(1)感官指标：
色泽：色泽均匀一致，呈乳白色或稍带微黄色。
滋味气味：具有纯乳酸发酵剂制成的酸牛乳特有的滋味和气味，无酒精 发酵味、霉味和其它不良气味。
组织状态：凝块均匀细腻、无气泡、允许少量乳清析出。
(2)理化指标：
乳脂肪≥3.00wt％，全乳固体ml0wt％，酸度70—110°T，砂糖≥ 5.0wt％，汞≤0.01％ppm。每100g降胆固醇酸乳含有热量60—70Kcal， 非脂乳固体≥8.1g，蛋白质≥重明显增加(P<0.05)，C组小鼠体重与A组 没有显着性差异(P>0.05)。饲喂高脂饲料的B组小鼠的肝重／体重明显 高于基础日粮组的小鼠，而灌胃组(C组)的低于高脂模型组(B组)，说明 由于降胆固醇酸乳的作用，使脂肪在小鼠肝脏内的存积量减少。各组间肾 重／体重和脾重／体重未见显着差异，表明在对小鼠灌胃降胆固醇酸乳期 间未见明显毒副作用。
表2降胆固醇酸乳对小鼠体重的影响(G)


表3降胆固醇酸乳对小鼠脏体比的影响

综上所述，本发明使用的高效降胆固醇乳酸菌一千酪乳杆菌干酪亚种， 分离白天然发酵乳制品，体外培养试验表明其有很强的耐酸、耐胆盐能力， 粘附性好，对常见的肠道致病菌有明显的抑制作用，不携带耐药性因子，是 一种适宜于人体肠道定植的乳酸菌，同时体外胆固醇降解率可达56％，体内 降胆固醇的动物实验也表明该酸乳可明显降低小鼠血清胆固醇。
本发明的有益效果为：采用高效降胆固醇的干酪乳杆菌干酪亚种为酸奶 发酵菌剂，以山楂提取物为乳酸菌生长促进剂，生产高效降胆固醇酸乳。体 外实验、体内动物实验均表明，该降胆固醇酸乳具有降低血清胆固醇的功 能，效果明显优于现有的文献报道。原料乳中添加山楂提取物后，发酵酸乳 乳酸菌活菌数可提高102倍，可明显增强酸乳乳酸菌的益生作用和降胆固醇 的功能性。
具体实施方式
实施例1
全脂酸乳的制备
(1)乳酸菌GL—03用如下方法制得：
无菌操作：天然发酵干酪经无菌水稀释后，吸取2ml加入灭菌的脱脂 乳中，37℃静置富集培养48h；取1ml富集培养液加入含0.04％溴百里香 草酚兰9ml无菌的改良KENJI选择性培养基中，37℃振荡培养1—2天；取 培养液100pL加到同样的培养基里培养，共需三次转管培养；根据培养基 的比混浊度和指示剂颜色的变化，取第三次培养后的菌液200ml加入到 pH2的MRS液体培养基培养6h，取其100虬培养液转接到含0.30wt％猪 胆盐MRS液体培养基中培养24h，然后取200PL培养液的涂布在改良MRS 平板上，37℃恒温培养48—72h；挑取产酸的典型菌落，反复的划线分离、 纯化，革兰氏染色、镜检，至纯菌落为止；然后，经16SrDNA测序进行菌 种鉴定；
定向诱导：将选育的乳酸菌GL—03活化后，定量加到含0.25％胆固醇 的KENJI发酵培养基中进行培养，每培养一次胆固醇的浓度都要增加 0.15wt％，五次驯培养后，使培养基中胆固醇的含量达到1mg／mL；选择生 长良好的乳酸菌G1—03，在含胆固醇0.1mg／mL的MRS液体培养基中，测 定其在诱导驯化前后的胆固醇降解率的变化，从中筛选出降胆固醇能力提 高较大的菌株而成。
(2)菌种活化和发酵剂制作：
将干酪乳杆菌GL—03、保加利亚杆菌、嗜热链球菌分别由MRS斜面转接 到液体MRS培养基中，37℃培养12h，活化三次；活化后的三菌种按1：0.5： 0.5接种到灭菌的含10％(W／V)的脱脂奶粉液体中，37℃培养至凝乳，转 接三次制成发酵剂。
(3)山楂提取物的制备
取山楂50克，先将材料切成碎末或粉末，加3倍的水，浸泡4h，煮沸 后用纹火持续40min；滤出煎液，滤渣加5倍的水，进行二煎30min，滤出 煎液，滤渣加3倍的水，进行三煎20min(4)原料配方与发酵酸乳的制备：原 料质量百分配比为：部分脱脂鲜奶85.0％，蔗糖浓度6.0％，山楂浸提物 4.9％，乳酸菌6L-03、保加利亚杆菌和嗜热链球菌3种菌混合比例为1：1： 1，接种量为4.0％，稳定剂CMC-Na0.1％，发酵温度43℃。
操作步骤：
将蔗糖、稳定剂用少量乳液(50—60℃)溶解，加入净化后的奶液中，同 时按比例加入山楂浸提物搅拌均匀，升温至60℃左右进行均质(压力为15— 17Mpa)。
均质后的奶液加热至90℃，5min或超高温瞬时灭菌(135℃，3-5s)，然 后降温至43℃，将乳酸菌GL—03、保加利亚杆菌和嗜热链球菌以1：1：1 比例混合，接种量为5wt％。接种后料液快速分装到容器中，并送至43℃恒 温室发酵4—5h，至pH4.6—4.8。迅速冷却到10‘C以下，并移至0—4℃ 冷库冷藏后熟。
(5)产品规格与理化指标：
乳脂肪≥0.5～≤3.0wt％，全乳固体≥10wt％，酸度70～110°T，砂 糖≥5.0wt％，汞≤0.01％ppm。
每100g降胆固醇酸乳含有蛋白质3.0g，脂质0.5·3.0g，砂糖5.1g， 乳酸菌活菌数≥1X16cfu／g。
实施例3
脱脂酸乳的制备
(1)乳酸菌GL—03用实施例1方法制得；
(2)菌种活化和发酵剂制作：
将干酪乳杆菌GL—03、保加利亚杆菌、嗜热链球菌分别由MRS斜面转接 到液体MRS培养基中，37℃培养12h，活化三次；活化后的三菌种按1：0.5： 0.5接种到灭菌的含10％(W／V)的脱脂奶粉液体中，37℃培养至凝乳，转 接三次制成发酵剂。
(3)山楂提取物的制备
取山楂50克，先将材料切成碎末或粉末，加3—8倍的水，浸泡2—4h， 煮沸后用纹火持续30～40min；滤出煎液，加3—5倍的水，进行二煎(20— 30min)滤出煎液，加2—4倍的水，进行三煎(20～30min)，合并滤液浓缩至 100mL，取上清液，115℃，灭菌15min，4℃冰箱保存备用。(4)原料配方与 发酵酸乳的制备：原料质量百分配比为：脱脂鲜奶85％，蔗糖浓度6.9％， 山楂浸提物6.0％，乳酸菌GL—03、保加利亚杆菌和嗜热链球菌3种菌混 合比例为1：1：1，接种量为2.0％，稳定剂CMC—Na0.1％。
操作步骤：
将蔗糖、稳定剂用少量乳液(50—60℃)溶解，加入净化后的奶液中，同 时按比例加入山楂浸提物搅拌均匀，升温至60℃左右进行均质(压力为 15-17Mpa)。均质后的奶液加热至90℃，5min或超高温瞬时灭菌(135℃，3 —5s)，然后降温至43℃，将乳酸菌GL—03、保加利亚杆菌和嗜热链球菌以 1：1：1比例混合，接43℃种量。接种后料液快速分装到容器中，并送至43℃ 恒温室发酵4—5h，至pH4.6—4.8。迅速冷却到10℃以下，并移至0—4℃ 冷库冷藏后熟。
(5)理化指标：
乳脂肪≤0.5wt％，全乳固体≥10wt％，酸度70～110°T，砂糖≥5.0wt％， 汞≤0.01％ppm。
每100g降胆固醇酸乳含有蛋白质3.0g，脂质0.5g，砂糖5.1g，乳 酸菌活菌数≥1X106cfu／g。
实施例4
脱脂酸乳的制备
(1)菌种活化和发酵剂制作；
(2)山楂提取物的制备同以上实施例；
(3)发酵乳原料质量百分配比为：
脱脂还原奶80.0％，脱脂奶粉2.0％，蔗糖6.9％，山楂浸提物6.0％， 乳酸菌GL-03、保加利亚杆菌和嗜热链球菌3种菌混合比例为1：1：1，接 种量为5.0％，稳定剂CMC—Na0.1％，发酵温度43℃。发酵操作步骤同实 施例3。
(4)理化指标：同实施例3
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式 的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更 或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依 据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型， 仍属于本发明技术方案的保护范围。