ST2L拮抗剂及使用方法.pdf

本发明涉及ST2L拮抗剂、编码所述拮抗剂或其片段的多核苷酸以及制备并使用前述物质的方法。

权利要求书
1.   一种分离的人或人适应性抗体拮抗剂或其片段，其特异性结合人ST2L的域I (SEQ ID NO: 9)。

2.   根据权利要求1所述的分离抗体，其中所述抗体阻断IL-33/ST2L相互作用。

3.   根据权利要求2所述的分离抗体，其具有介于约5×10-12M至约7×10-10M之间的对人ST2L的解离常数(KD)，介于约2×106M-1s-1至约1×108M-1s-1之间的对人ST2L的结合速率常数(Kon)，或介于约1×10-6s-1至约1×10-2s-1之间的对人ST2L的解离速率常数(Koff)。

4.   根据权利要求3所述的分离抗体，其具有介于约3×10-12M至约2×10-9M之间的对食蟹猴(Macaca fascicularis (cyno)) ST2L (SEQ ID NO: 2)的解离常数(KD)，介于约4×106M-1s-1至约1×108M-1s-1之间的对cyno ST2L的结合速率常数(Kon)，或介于约7×10-5s-1至约1×10-1s-1之间的对cyno ST2L的解离速率常数(Koff)。

5.   根据权利要求4所述的分离抗体，其包含：
a) SEQ ID NO: 160 (X1X2X3MX4)的重链互补决定区(HCDR) 1 (HCDR1)；其中
X1为S、F、D、I、G或V；
X2为Y或D；
X3为A、D或S；并且
X4为S、F或I；
b) SEQ ID NO: 161 (X5IX6GX7GGX8TX9YADSVKG)的HCDR 2 (HCDR2)；其中
X5为A、S、T、Y或D；
X6为S、R、E、K、G或A；
X7为S、E或N；
X8为S、R、E、G、T、D或A；并且
X9为Y、D、N、A或S；以及
c) SEQ ID NO: 162 (X10X11WSTEGSFFVLDY)的HCDR 3 (HCDR3)；其中
X10为D、A、R、N、Q、P、E、I、H、S、T或Y；并且
X11为P、A、H、Y、E、Q、L、S、N、T、V、或I；以及
d) SEQ ID NO: 163 (RASQSVDDX12LA)的轻链互补决定区(LCDR) 1 (LCDR1)；其中
X12为A或D；
e) SEQ ID NO: 90 (DASNRAT)的LCDR 2 (LCDR2)；以及
f) SEQ ID NO: 164 (QQX13X14X15X16X17X18T)的LCDR 3 (LCDR3)；其中
X13为F或Y；
X14为Y、I或N；
X15为N、G、D或T；
X16为W或A；
X17为P或缺失；并且
X18为L或I。

6.   根据权利要求5所述的分离抗体，其包含：
a) SEQ ID NO: 97的HCDR1；
b) SEQ ID NO: 114的HCDR2；
c) SEQ ID NO: 84的HCDR3；
d) SEQ ID NO: 130的LCDR1；
e) SEQ ID NO: 90的LCDR2；以及
f) SEQ ID NO: 134的LCDR3；或
g) SEQ ID NO: 191的VH和SEQ ID NO: 209的VL。

7.   根据权利要求5所述的分离抗体，其包含如下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3：
a) 分别为SEQ ID NO: 78、81、84、87、90和92；
b) 分别为SEQ ID NO: 78、81、84、130、90和131；
c) 分别为SEQ ID NO: 78、81、84、130、90和132；
d) 分别为SEQ ID NO: 78、81、84、130、90和133；
e) 分别为SEQ ID NO: 78、81、84、130、90和134；
f) 分别为SEQ ID NO: 95、109、84、130、90和131；
g) 分别为SEQ ID NO: 96、110、84、130、90和131；
h) 分别为SEQ ID NO: 97、111、84、130、90和131；
i) 分别为SEQ ID NO: 96、110、84、130、90和134；
j) 分别为SEQ ID NO: 97、111、84、130、90和134；
k) 分别为SEQ ID NO: 97、112、84、130、90和134；
l) 分别为SEQ ID NO: 98、113、84、130、90和134；
m) 分别为SEQ ID NO: 97、114、84、130、90和134；
n) 分别为SEQ ID NO: 97、115、84、130、90和134；
o) 分别为SEQ ID NO: 99、116、84、130、90和133；
p) 分别为SEQ ID NO: 100、117、84、130、90和133；
q) 分别为SEQ ID NO: 101、118、84、130、90和133；
r) 分别为SEQ ID NO: 102、120、84、130、90和132；
s) 分别为SEQ ID NO: 103、121、84、130、90和132；
t) 分别为SEQ ID NO: 103、122、84、130、90和131；
u) 分别为SEQ ID NO: 103、123、84、130、90和131；
v) 分别为SEQ ID NO: 104、124、84、130、90和131；
w) 分别为SEQ ID NO: 105、125、84、130、90和131；
x) 分别为SEQ ID NO: 106、126、84、130、90和131；
y) 分别为SEQ ID NO: 95、127、84、130、90和131；
z) 分别为SEQ ID NO: 107、128、84、130、90和131；
aa) 分别为SEQ ID NO: 108、129、84、130、90和131；
bb) 分别为SEQ ID NO: 97、114、165、130、90和134；
cc) 分别为SEQ ID NO: 97、114、166、130、90和134；
dd) 分别为SEQ ID NO: 97、114、167、130、90和134；
ee) 分别为SEQ ID NO: 97、114、168、130、90和134；
ff) 分别为SEQ ID NO: 97、114、169、130、90和134；
gg) 分别为SEQ ID NO: 97、114、170、130、90和134；
hh) 分别为SEQ ID NO: 97、114、171、130、90和134；
ii) 分别为SEQ ID NO: 97、114、172、130、90和134；
jj) 分别为SEQ ID NO: 97、114、173、130、90和134；
kk) 分别为SEQ ID NO: 97、114、174、130、90和134；
ll) 分别为SEQ ID NO: 97、114、175、130、90和134；
mm) 分别为SEQ ID NO: 97、114、176、130、90和134；
nn) 分别为SEQ ID NO: 97、114、177、130、90和134；
oo) 分别为SEQ ID NO: 97、114、178、130、90和134；
pp) 分别为SEQ ID NO: 97、114、179、130、90和134；
qq) 分别为SEQ ID NO: 97、114、180、130、90和134；
rr) 分别为SEQ ID NO: 97、114、181、130、90和134；
ss) 分别为SEQ ID NO: 97、114、182、130、90和134；
tt) 分别为SEQ ID NO: 97、114、183、130、90和134；
uu) 分别为SEQ ID NO: 97、114、184、130、90和134；或
vv) 分别为SEQ ID NO: 97、114、185、130、90和134。

8.   根据权利要求4所述的分离抗体，其包含如下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3：
a) 分别为SEQ ID NO: 23、27、31、35、39和43；
b) 分别为SEQ ID NO: 24、28、32、36、40和44；
c) 分别为SEQ ID NO: 24、28、146、36、40和147；或
d) 分别为SEQ ID NO: 24、28、146、36、40和44。

9.   根据权利要求2所述的分离抗体，其中所述抗体与包含SEQ ID NO: 47的重链可变区(VH)和SEQ ID NO: 51的轻链可变区(VL)的分离抗体竞争结合于人ST2L (SEQ ID NO: 1)。

10.   根据权利要求9所述的分离抗体，其中所述抗体在SEQ ID NO: 1的第35-48位氨基酸残基（rcprqgkpsytvdW；SEQ ID NO: 210）处结合人ST2L。

11.   根据权利要求10所述的分离抗体，其中所述抗体还在SEQ ID NO: 1的氨基酸残基T93和F94处结合人ST2L。

12.   根据权利要求1所述的分离抗体，其包含具有来源于人IGHV3-23 (SEQ ID NO: 158)、IGHV1-24*01 (SEQ ID NO: 148)或IGHV1-f*01 (SEQ ID NO: 149)框架序列的VH框架的重链可变区(VH)、以及具有来源于人IGKV3-11 (L6) (SEQ ID NO: 159)、IGKV3-15*01 (L2) (SEQ ID NO: 150)、IGKV1-9*01 (L8) (SEQ ID NO: 151)、IGKV1-5*01 (L12) (SEQ ID NO: 152)、IGKV1-12*01 (L5) (SEQ ID NO: 153)、IGKV1-39*01 (O12) (SEQ ID NO: 154)、IGKV1-27*01 (A20) (SEQ ID NO: 155)或IGKV1-33*01 (O18) (SEQ ID NO: 156)框架序列的VL框架的轻链可变区(VL)。

13.   根据权利要求1所述的分离抗体，其为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4型。

14.   根据权利要求13所述的分离抗体，其在Fc区中具有置换。

15.   根据权利要求14所述的分离抗体，其中所述置换包括置换M252Y/S254T/T256E、V234A/G237A/P238S/H28A/V309L/A330S/P331S或P238S/L234A/L235A，其中残基编号根据EU编号。

16.   根据权利要求12所述的分离抗体，其包含与SEQ ID NO: 191的VH具有至少90%同一性的VH和与SEQ ID NO: 209的VL具有至少94%同一性的VL。

17.   根据权利要求16所述的分离抗体，其包含SEQ ID NO: 143、144、145、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204或205的VH和SEQ ID NO: 135、136、137、138、139、140、141、142、206、207、208或209的VL。

18.   根据权利要求17所述的分离抗体，其包含如下序列的VH和VL：
a) 分别为SEQ ID NO: 186和SEQ ID NO: 206；
b) 分别为SEQ ID NO: 187和SEQ ID NO: 206；
c) 分别为SEQ ID NO: 197和SEQ ID NO: 206；
d) 分别为SEQ ID NO: 198和SEQ ID NO: 206；
e) 分别为SEQ ID NO: 199和SEQ ID NO: 206；
f) 分别为SEQ ID NO: 200和SEQ ID NO: 206；
g) 分别为SEQ ID NO: 201和SEQ ID NO: 206；
h) 分别为SEQ ID NO: 202和SEQ ID NO: 206；
i) 分别为SEQ ID NO: 203和SEQ ID NO: 206；
j) 分别为SEQ ID NO: 204和SEQ ID NO: 206；
k) 分别为SEQ ID NO: 205和SEQ ID NO: 206；
l) 分别为SEQ ID NO: 195和SEQ ID NO: 207；
m) 分别为SEQ ID NO: 196和SEQ ID NO: 207；
n) 分别为SEQ ID NO: 188和SEQ ID NO: 208；
o) 分别为SEQ ID NO: 189和SEQ ID NO: 208；
p) 分别为SEQ ID NO: 190和SEQ ID NO: 208；
q) 分别为SEQ ID NO: 187和SEQ ID NO: 209；
r) 分别为SEQ ID NO: 191和SEQ ID NO: 209；
s) 分别为SEQ ID NO: 192和SEQ ID NO: 209；
t) 分别为SEQ ID NO: 193和SEQ ID NO: 209；或
u) 分别为SEQ ID NO: 194和SEQ ID NO: 209。

19.   一种分离的多核苷酸，其编码SEQ ID NO: 143、144、145、186、187、197、198、199、200、201、202、203、204或205的VH，或者SEQ ID NO: 135、136、137、138、139、140、141、142、206、207、208或209的VL。

20.   一种载体，其包含权利要求19所述的分离多核苷酸。

21.   一种宿主细胞，其包含权利要求20所述的载体。

22.   一种制备权利要求18所述的抗体的方法，该方法包括培养权利要求21所述的宿主细胞以及从所述细胞回收所述抗体。

23.   一种药物组合物，其包含权利要求1或权利要求6所述的分离抗体以及配药学上可接受的媒介物。

24.   一种治疗或预防ST2L介导的病症的方法，该方法包括将治疗有效量的权利要求1或权利要求6所述的分离抗体向对其有需求的患者施用足以治疗或预防所述ST2L介导的病症的时间。

25.   根据权利要求24所述的方法，其中所述ST2L介导的病症是哮喘、气道过度反应、结节病、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、特发性肺纤维化(IPF)、囊性纤维化、炎性肠病、(IBD)、嗜酸细胞性食道炎、硬皮病、特应性皮炎、过敏性鼻炎、大疱性类天疱疮、慢性荨麻疹、糖尿病性肾病、类风湿性关节炎、间质性膀胱炎或移植物抗宿主病(GVHD)，或与肺中的炎性细胞募集、杯状细胞增生、增加的粘液分泌或肥大细胞响应相关联。

26.   一种抑制患者体内肥大细胞响应的方法，该方法包括将治疗有效量的权利要求1所述的分离抗体向对其有需求的患者施用足以抑制所述肥大细胞响应的时间。

27.   根据权利要求26所述的方法，其中所述抑制肥大细胞响应包括用50μg/ml抗体使人脐带血源性肥大细胞释放的GM-CSF、IL-5、IL-8、IL-10或IL-13的水平抑制至少50%。

28.   一种在受治疗者中抑制IL-33和ST2L的相互作用的方法，该方法包括以足以抑制IL-33和ST2L的相互作用的量向所述受治疗者施用特异性结合ST2L的域I的抗体。

29.   根据权利要求28所述的方法，其中所述受治疗者患有ST2L介导的病症。

30.   根据权利要求29所述的方法，其中所述ST2L介导的病症是哮喘、气道过度反应、结节病、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、特发性肺纤维化(IPF)、囊性纤维化、炎性肠病、(IBD)、嗜酸细胞性食道炎、硬皮病、特应性皮炎、过敏性鼻炎、大疱性类天疱疮、慢性荨麻疹、糖尿病性肾病、类风湿性关节炎、间质性膀胱炎或移植物抗宿主病(GVHD)，或与肺中的炎性细胞募集、杯状细胞增生、或增加的粘液分泌、或肥大细胞响应相关联。

31.   根据权利要求29所述的方法，其中所述抗体包含：
a) SEQ ID NO: 97的HCDR1；
b) SEQ ID NO: 114的HCDR2；
c) SEQ ID NO: 84的HCDR3；
d) SEQ ID NO: 130的LCDR1；
e) SEQ ID NO: 90的LCDR2；以及
f) SEQ ID NO: 134的LCDR3；或
g) SEQ ID NO: 191的VH和SEQ ID NO: 209的VL。

32.   用于治疗的权利要求1、权利要求6或权利要求9所述的抗体。

说明书ST2L拮抗剂及使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年3月13日提交的美国申请序列号13/798,204、2013年3月13日提交的美国申请序列号13/798,226、2012年4月30日提交的美国临时申请号61/640,407以及2012年4月30日提交的美国临时申请号61/640,238的权益，所述申请的全部内容以引用方式并入本文。
技术领域
本发明涉及ST2L拮抗剂、编码所述拮抗剂或其片段的多核苷酸以及制备并使用前述物质的方法。
背景技术
ST2L(IL-1RL1或IL-33Rα)是Toll/IL-1受体家族成员，在多种免疫细胞的细胞表面上表达，所述免疫细胞包括T细胞、NK/NKT细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞及新发现的非B/非T的2型先天性淋巴细胞、nuocytes和自然辅助细胞。也可在树突状细胞(DC)、巨噬细胞和嗜中性粒细胞上诱导ST2L表达。ST2L能够下调Toll样受体TLR2、TLR4和TLR9的响应性，但也能经由被其配体IL-33活化及与辅助蛋白IL-1RAcP缔合而诱导2型细胞因子释放。IL-33已被描述为“警报素”，因为在内稳态过程中其以全长形式存在于上皮细胞和内皮细胞的细胞核中，但在细胞坏死过程中可被裂解并释放。
ST2L信号传导需要辅助蛋白IL-1RAcP缔合于预先形成的ST2L/IL-33复合物。IL-1α/β信号传导复合物也共用辅助蛋白IL-1RAcP。已提出了ST2L、IL-33和IL-1RAcP相互作用以及IL-1R1与IL-1RAcP之间相互作用的模型(Lingel等人，Cell 17：1398-1410，2009；Wang等人，Nat Immunol11：905-11，2010)。近来发现，ST2L/IL-33/IL-1RAcP与肥大细胞上的c-Kit(干细胞因子(SCF)的受体)形成信号传导复合物。IL-33以SCF依赖方式 在原代肥大细胞中诱导细胞因子产生(Drube等人，Blood 115：3899-906，2010)。
ST2L的活化导致过度的2型细胞因子响应(尤其是IL-5和IL-13)、肥大细胞和嗜酸性粒细胞活化，以及气道过度反应，并且据报道还可通过诱导来自NKT细胞的IFNγ和来自肥大细胞的IL-1β及IL-6放大Th1和Th17响应。ST2L/IL-33途径失调已表明与多种免疫介导的疾病有关，包括哮喘、类风湿性关节炎、炎性肠病、特应性皮炎、过敏性鼻炎、鼻息肉以及全身性硬化症(综述于Palmer和Gabay，Nat Rev Rheumatol 7：321-9，2011和Lloyd，Curr Opin Immunol 22：800-6，2010；Shimizu等人，Hum Molec Gen 14：2919-27，2005，Kamekura等人，Clin Exp Allergy 42：218-28，2012；Manetti等人，Ann Rheum Dis 69：598-605，2010)。
因此，需要适合用于治疗ST2L介导的疾病和失调的ST2L拮抗剂。
附图说明
图1示出在与同种型对照CNTO5516相比时，在经鼻内施用IL-33而诱导的肺炎症模型中，通过ST2L域I结合单克隆抗体CNTO3914抑制气道过度响应。当乙酰甲胆碱(MCH)以升高的剂量(mg/ml)施用时，测量到气道阻力的峰值。CNTO3914/IL-33相对于CNTO5516/IL-33，**p＜0.05；以及CNTO3914/IL-33相对于经IL-33处理的PBS组，***p＜0.001。
图2示出在与同种型对照CNTO5516相比时，在经鼻内施用IL-33而诱导的肺炎症模型中，通过ST2L域I结合单克隆抗体CNTO3914抑制支气管肺泡灌洗(BAL)细胞募集。***p＜0.001。
图3示出在经鼻内施用IL-33而诱导的肺炎症模型中，通过ST2L域I结合单克隆抗体CNTO3914在无细胞的BAL液中剂量依赖性抑制小鼠肥大细胞蛋白酶1(MMCP-1)的释放。相对于经IL-33处理的CNTO5516(同种型对照)，**p＜0.01，***p＜0.001。
图4示出在体外通过ST2L域I结合单克隆抗体CNTO3914，抑制小鼠骨髓源性肥大细胞的IL-33诱导的GM-CSF(图4A)、IL-5(图4B)和TNFα(图4C)释放。在括号中，所使用的CNTO3914浓度示出为μg/ml，并且IL-33浓度示出为ng/ml。
图5示出在指定IL-33和C2494浓度，通过ST2L域I结合单克隆抗体C2494(STLM62)，抑制IL-33所诱导的人脐带血源性肥大细胞的前列腺素D2(PGD2)释放。MOX-PDG2：甲氧胺-PGD2。
图6示出在StemPro-34培养基中的1ng/ml IL-33+100ng/ml SCF(干细胞因子)存在下，通过指定浓度(μg/ml)的ST2L域I结合单克隆抗体C2244和C2494，抑制人脐带血源性肥大细胞(hCBMC)中的GM-CSF(图6A)、IL-8(图6B)、IL-5(图6C)、IL-13(图6D)和IL-10(图6E)释放。
图7示出在StemPro-34培养基中的1ng/ml IL-33+100ng/ml SCF存在下，通过指定浓度(μg/ml)的ST2L域III结合单克隆抗体C2519或C2521，对人脐带血源性肥大细胞中的GM-CSF(图7A)、IL-8(图7B)、IL-5(图7C)、IL-13(图7D)和IL-10(图7E)释放的影响。
图8示出在RPMI/10％FCS培养基中3ng/ml IL-33+100ng/ml SCF存在下，通过ST2L域I结合单克隆抗体C2494和ST2L域III结合单克隆抗体ST2M48(M48)、ST2M49(M49)、ST2M50(M50)和ST2M51(M51)，对人脐带血源性肥大细胞(hCBMC)中的A)GM-CSF；B)IL-8；C)IL-5；D)IL-13以及E)IL-10释放的影响。
图9示出结合ST2L的域I(D1)或域III(D3)的抗-ST2L抗体，如所指示使用50μg/ml或2μg/ml的每种被测抗体时，抑制人脐带血源性肥大细胞在受IL-33和SCF诱导时的GM-CSF、IL-5、IL-8、IL-10和IL-13释放的平均百分比(％)。负值指示活化％。
图10示出抗-ST2L抗体的重链可变区(VH)和重链CDR序列，其来源于噬菌体展示文库，且后续经亲和力成熟筛选(affinity-maturation campaign)。
图11示出抗-ST2L抗体的轻链可变区(VL)和轻链CDR序列，其来源于噬菌体展示文库，且后续经亲和力成熟筛选。
图12示出抗-ST2L抗体STLM208VH ST2H257HCDR3变体的VH和VL区，以及重链CDR的序列。
图13示出抗-ST2L抗体的A)VH和B)VL序列，其来源于噬菌体展示文库，且后续经亲和力成熟筛选。
图14示出转移到人框架(被转移部分标记为HFA“human framework adaptation”(人框架适应性))的C2494VH和VL抗原结合位点的划分。Kabat CDR带有下划线，并且Chothia HV在所示转移HFA区的上方以虚线指示。VH和VL残基的编号根据Chothia。VH中以灰色突出显示的残基在一些HFA变体中未被转移。C2494VH：SEQ ID NO：48；C2494VH：SEQ ID NO：52。
图15示出来源于C2494的人框架适应性(HFA)抗体的CDR序列。
图16A)抗-ST2L抗体CNTO3914的血清水平；B)支气管肺泡灌洗(BAL)细胞募集的抑制；C)被IL-33刺激的全血细胞的IL-6分泌的抑制；D)在经鼻内施用IL-33而诱导肺炎症6小时模型中，给药后24小时通过CNTO3914抑制用IL-33刺激的全血细胞的MCP1分泌。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；NQ＝低于检出限；@＝一个数据点低于检出限。
图17各种抗-ST2L抗体之间的竞争。A)30nM经标记的C2244Fab与指定抗体竞争结合涂布在微孔上的ST2L-ECD。C2244与C2494竞争，但不与C2539竞争。B)10nM经标记的C2494与指定抗体竞争结合涂布在微孔上的ST2L-ECD。C2494与STLM208和STLM213竞争，但不与C2539竞争。
图18示出与C2244Fab复合的人ST2-ECD(SEQ ID NO：119)的简化H/D交换图。被抗体保护的区域以所示不同的灰度显示。包含第18-31位残基(虚线方框内)(对应SEQ ID NO：1的全长ST2L的第35-48位残基)的片段由Fab保护。包含第71-100位残基(实线方框内)(对应SEQ ID NO：1的第88-117位残基)的区域被重度糖基化且未被肽覆盖。
图19示出ST2L域I结合抗体对图中所示ST2L变体的动力学和亲和力常数。
图20示出抗-ST2L抗体STLM208对原代人肺肥大细胞的A)GM-CSF；B)IL-5；C)IL-8；D)IL-13分泌的抑制。
发明内容
本发明提供一种分离的人或人适应性抗体拮抗剂或其片段，其特异性结合人ST2L的域I(SEQ ID NO：9)。
本发明还提供特异性结合具有下列序列的人ST2L的人适应性抗体拮抗剂：特定轻链和重链可变区序列，或特定重链和轻链互补决定序列。
本发明还提供在限定表位区特异性结合人ST2L和/或具有如本文所述特定特征的人或人适应性抗体拮抗剂。
本发明还提供一种分离的多核苷酸，其编码本发明的重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)。
本发明还提供一种载体，其包含本发明的分离的多核苷酸。
本发明还提供一种宿主细胞，其包含本发明的载体。
本发明还提供一种制备本发明的抗体的方法，该方法包括培养本发明的宿主细胞以及从所述细胞回收抗体。
本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明的分离抗体以及配药学上可接受的媒介物。
本发明还提供一种治疗或预防ST2L介导的病症的方法，该方法包括将治疗有效量的本发明的分离抗体向对其有需求的患者施用足以治疗或预防ST2L介导的病症的时间。
本发明还提供一种抑制患者体内肥大细胞响应的方法，该方法包括将治疗有效量的本发明的分离抗体向对其有需求的患者施用足以抑制肥大细胞响应的时间。
本发明还提供一种在受治疗者中抑制IL-33和ST2L的相互作用的方法，该方法包括以足以抑制IL-33和ST2L的相互作用的量向该受治疗者施用特异性结合ST2L的域I的抗体。
具体实施方式
本说明书中所引用的所有出版物(包括但不限于专利和专利申请)均以引用方式并入本文，如同在本文中完整给出。
应当理解，本文所用的术语只是为了描述具体实施例，并非旨在进行限制。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。
虽然与本文所述的那些方法和材料相似或等效的任意方法和材料都可以用于检验本发明的实践中，然而本文中描述示例性材料和方法。在描述和要求保护本发明时，将使用以下术语。
如本文所用，术语“拮抗剂”意指通过任何机制部分或完全抑制ST2L生物活性的分子。示例性拮抗剂是抗体、融合蛋白质、肽、模拟肽、核酸、寡核苷酸和小分子。拮抗剂可使用下述ST2L生物活性测定法鉴定。ST2L拮抗剂可使所测量的ST2L生物活性抑制20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
术语“ST2L”或“huST2L”或“人ST2L”是指具有基因库登录号NP 057316中所示的氨基酸序列的人ST2L多肽。SEQ ID NO：1示出全长人ST2L的氨基酸序列。如本文所用，“ST2L胞外域”、“ST2L-ECD”或“huST2L-ECD”意指具有SEQ ID NO：1的第19-328位氨基酸的多肽。huST2L-ECD具有三个Ig样C2型域，其跨越SEQ ID NO：1的第19-122位残基(域I，SEQ ID NO：9)、第123-202位残基(域II，SEQ ID NO：10)以及第209-324位残基(域III，SEQ ID NO：11)。“域I”或“ST2L域I”或“huST2L域I”或“D1”是指人ST2L上的第一免疫球蛋白样域，其具有SEQ ID NO：9中所示的序列。“域III”或“ST2L域III”是指人ST2L上的第三免疫球蛋白样域，其具有SEQ ID NO：11中所示的序列。
如本文所用，术语“IL-33”包括全长IL-33(基因库登录号NP_254274SEQ ID NO：3)及其变体和活性形式。IL-33变体包括具有基因库登录号NP_001186569和基因库登录号NP_001186570中所示的氨基酸序列的蛋白质。IL-33活性形式包括“成熟IL-33”，其具有SEQ ID NO：3的第112-270位残基。另外的活性形式包括IL-33片段，其具有SEQ ID NO：3的第11-270位、第115-270位、第95-270位、第99-270位或第109-270位残基(LeFrancais等人，Proc Natl Acad Sci(USA)109：1673-8，2012)，或从内源性表达IL-33的细胞分离的任何形式或形式的组合。“IL-33活性形式”是诱导ST2L生物活性的SEQ ID NO：3的IL-33的片段或变体。
如本文所用，术语“抗体”含义广泛且包括：免疫球蛋白分子，包括多克隆抗体；单克隆抗体，包括鼠、人、人适应性、人源化和嵌合单克隆抗体；抗体片段；由至少两个完整抗体或抗体片段所形成的双特异性或多特异性抗体；二聚体、四聚体或多聚体抗体；以及单链抗体。
免疫球蛋白可根据重链恒定域氨基酸序列被指定为五种主要种类，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgA和IgG进一步亚分类为同种型IgA1、 IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。任何脊椎动物物种的抗体轻链可基于其恒定结构域的氨基酸序列被指定至两种明显不同类型中的之一，即κ(κ)和λ(λ)。
术语“抗体片段”是指免疫球蛋白分子的一部分，其保留重链和/或轻链抗原结合位点，诸如重链互补决定区(HCDR)1、2和3，轻链互补决定区(LCDR)1、2和3，重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)。抗体片段包括熟知的Fab、F(ab′)2、Fd和Fv片段以及由一个VH域组成的域抗体(dAb)。VH和VL域可经由合成接头连接在一起以形成各种类型的单链抗体设计，其中在VH和VL域由单独的单链抗体构建体表达的情况下，VH/VL域在分子内或分子间配对，以形成单价抗原结合位点，诸如单链Fv(scFv)或双价抗体(diabody)；例如在国际专利公开WO98/44001、国际专利公开WO88/01649、国际专利公开WO94/13804、国际专利公开WO92/01047中所描述的。
抗体可变区由插入有三个“抗原结合位点”的“框架”区组成。使用不同术语来定义抗原结合位点：(i)三个在VH(HCDR1、HCDR2、HCDR3)中且三个在VL(LCDR1、LCDR2、LCDR3)中的互补决定区(CDR)，是基于序列变异性(Wu和Kabat，J Exp Med 132：211-50，1970；Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.，1991)。(ii)三个在VH(H1、H2、H3)中且三个在VL(L1、L2、L3)中的“超变区”、“HVR”或“HV”，是指抗体可变域中的在结构上超变的区域，如Chothia和Lesk所定义(Chothia和Lesk，Mol Biol 196：901-17，1987)。其他术语包括“IMGT-CDR”(Lefranc等人，Dev Comparat Immunol 27：55-77，2003)和“特异性决定残基用途”(SDRU)(Almagro，Mol Recognit17：132-43，2004)。International ImMunoGeneTics(IMGT)数据库(http://www_imgt_org)提供了抗原结合位点的标准化编号和定义。CDR、HV与IMGT划分之间的对应性描述于Lefranc等人，Dev Comparat Immunol 27：55-77，2003。
如本文所用，“Chothia残基”是抗体VL和VH残基，其根据Al-Lazikani来编号(Al-Lazikani等人，J Mol Biol 273：927-48，1997)。
“框架”或“框架序列”是可变区的除了被定义为抗原结合位点的那些序列之外的其余序列。因为抗原结合位点可以由如上所述的不同术语定义，所以框架的精确氨基酸序列取决于如何定义抗原结合位点。
“人抗体”或“完全人抗体”是指包含来源于人免疫球蛋白序列的可变区和恒定区序列的抗体。本发明的人抗体可包括置换，因此其可能不是表达的人免疫球蛋白或种系基因序列的精确拷贝。然而，“人抗体”的定义并不包括抗原结合位点来源于非人物种的抗体。
“人适应性”抗体或“人框架适应性(HFA)”抗体是指根据美国专利公开No.US2009/0118127中所描述的方法适应化的抗体，并且也指将来源于非人物种的抗原结合位点序列移植到人框架的抗体。
“人源化抗体”是指其中抗原结合位点来源于非人物种且可变区框架来源于人免疫球蛋白序列的抗体。人源化抗体在框架区中可包括置换，因此该框架可能不是表达的人免疫球蛋白或种系基因序列的精确拷贝。
如本文所用，术语“基本上相同”意指所比较的两个抗体可变区氨基酸序列是相同的或具有“非实质差异”。非实质差异是在抗体或抗体可变区序列中不会不利地影响抗体特性的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸的置换。与本文所公开的可变区序列基本上相同的氨基酸序列在本申请范围内。在一些实施例中，所述序列同一性可以为约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。可使用Vector NTI v.9.0.0(Invitrogen，Carslbad，CA)的AlignX模块的默认设置，例如通过逐对比对来测定百分比同一性。本发明的蛋白质序列可用作执行公共或专利数据库检索的查询序列，以例如识别相关序列。用于执行此类检索的示例性程序为使用默认设置的XBLAST或BLASTP程序(http_//www_ncbi_nlm/nih_gov)、或GenomeQuestTM(GenomeQuest，Westborough，MA)套件。
如本文所用，术语“表位”是指抗体特异性结合的抗原的一部分。表位通常由化学活性的(诸如极性、非极性或疏水性)表面部分组而组成，诸如氨基酸或多糖侧链，并且可具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。表位可由形成构象空间单元的连续和/或不连续氨基酸构成。对于不连续表位而言，抗原线性序列不同部分的氨基酸，通过蛋白质分子的折 叠，在三维空间中紧密靠近。示例性表位是以SEQ ID NO：9示出的huST2L的域I。
如本文所用，术语“互补位”意指抗原特异性结合的抗体的一部分。互补位可以是线状特征的或可以是不连续的，通过抗体的非连续性氨基酸之间的空间关系所形成，而非氨基酸的线型系列。“轻链互补位”和“重链互补位”或“轻链互补位氨基酸残基”和“重链互补位氨基酸残基”分别是指与抗原相接触的抗体轻链和重链残基。
如本文所用，术语“特异性结合”或“特异性地结合”是指抗体以比针对其他抗原或蛋白质更高的亲和力结合于预定的抗原。通常，抗体以1×10-7M或更小的解离常数(KD)结合于预定的抗原，例如1×10-8M或更小、1×10-9M或更小、1×10-10M或更小、1×10-11M或更小、或1×10-12M或更小，通常KD为其结合于非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白或任何其他特定多肽)的KD的至少十倍。可以使用标准程序来测量解离常数。然而，特异性结合于预定抗原的抗体可能对其他相关的抗原具有交叉反应性，例如对于来自其他物种(同源)的相同预定抗原，诸如人或猴，例如食蟹猴(Macaca fascicularis)(食蟹猕猴(cynomolgus))。
如本文所用，“双特异性”是指结合两个不同抗原或抗原内的两个不同表位的抗体。
如本文所用，“单特异性”是指结合一个抗原或一个表位的抗体。
如本文所用，术语“进行组合”是指所描述药剂可以在混合物中、作为单一药剂同时地或作为单一药剂以任何顺序先后地共同向动物施用。
如本文所用，“炎性病症”是指对于有害刺激诸如病原体、受损细胞、物理伤害或刺激物的急性或慢性局部或全身性响应，所述响应部分由细胞因子、趋化因子或炎性细胞(如，嗜中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、巨噬细胞)的活性介导，并且所述炎性病症在多数情况下的特征在于疼痛、发红、肿胀和组织功能损伤。
如本文所用，术语“ST2L介导的炎性病症”是指至少部分由于不适当的ST2L信号传导途径活化而造成的炎性病症。示例性ST2L介导的炎性病症是哮喘和过敏。
如本文所用，术语“ST2L介导的病症”涵盖ST2L在疾病和医学病症中直接或间接发挥作用的所有疾病和医学病症，包括疾病或病症的引发、发展、进程、持续或病变。
如本文所用，术语“ST2L生物活性”是指由于ST2L配体IL-33结合于ST2L所出现的任何活性。示例性ST2L生物活性导致NF-κB响应于IL-33而活化。NF-κB活化可在用IL-33诱导ST2L时使用报告基因测定法测定(Fursov等人，Hybridoma 30：153-62，2011)。其他示例性ST2L生物活性导致Th2细胞的增殖，或促炎性细胞因子和趋化因子的分泌，例如IL-5、GM-CSF、IL-8、IL-10或IL-13。细胞因子和趋化因子从细胞、组织中或在循环中的释放可使用熟知的免疫测定法来测量，诸如ELISA免疫测定法。
术语“载体”是指能够在生物系统内复制或可以在此类系统间移动的多核苷酸。载体多核苷酸通常含有诸如复制起点、聚腺苷酸化信号或选择标记之类的元件，其功能是促进这些多核苷酸在生物系统中的复制或保持。此类生物系统的例子可包括细胞、病毒、动物、植物和用能够复制载体的生物组分再造的生物系统。包含载体的多核苷酸可以是DNA或RNA分子或这些分子的杂交体。
术语“表达载体”是指可用于在生物系统或再造生物系统中指导由存在于表达载体中的多核苷酸序列所编码的多肽的翻译的载体。
术语“多核苷酸”是指包含由糖-磷酸主链或其它等同的共价化学方式所共价连接的核苷酸链的分子。双链DNA和单链DNA以及双链RNA和单链RNA是多核苷酸的典型例子。
术语“多肽”或“蛋白质”是指包含至少两个由肽键连接以形成多肽的氨基酸残基的分子。少于50个氨基酸的小多肽可以称作“肽”。
本文使用如下的常规单字母和三字母氨基酸代码：


物质的组成
本发明提供特异性结合ST2L并抑制ST2L生物活性的抗体，及此类抗体的用途。本发明人已得出令人惊讶的发现，结合于人ST2L的域I(SEQ ID NO：9)的抗体阻断IL-33/ST2L相互作用并抑制一系列的ST2L生物活性，包括IL-33诱导的肥大细胞响应，然而结合人ST2L的域III(SEQ ID NO：11)的抗体并不会阻断IL-33/ST2L相互作用，虽然其对于一系列的ST2L生物活性具有抑制性。然而，域III结合抗体对于IL-33诱导的肥大细胞响应具有降低的抑制作用或没有抑制作用，或在一些情况下刺激IL-33诱导的肥大细胞响应。
在本文所述的一些实施例中，阻断IL-33/ST2L相互作用并抑制包括IL-33诱导的肥大细胞响应的一系列ST2L生物活性的抗体，结合人ST2L域I内的表位(RCPRQGKPSYTVDW；SEQ ID NO：210)和任选的ST2L氨基酸残基T93和F94(残基编号根据SEQ ID NO：1)。
术语“肥大细胞响应”或“肥大细胞活性”是指IL-33诱导的细胞因子诸如GM-CSF、IL-8、IL-5、IL-13和IL-10以及过敏介质诸如前列腺素D2从肥大细胞的释放。
本发明提供新型的抗原结合位点，其结合如本文所述的人ST2L的域I。用于携带抗原结合位点的结构通常为抗体VH或VL。
如本文所述的本发明抗体可为分离的人或人适应性抗体拮抗剂或其片段，其特异性结合人ST2L的域I(SEQ ID NO：9)。结合人ST2L的域I (SEQ ID NO：9)的示例性抗体是抗体STLM15(C2244)，其包含分别为SEQ ID NO：23、27和31的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列以及分别为SEQ ID NO：35、39和43的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；或抗体C2494(STLM62)，其包含分别为SEQ ID NO：24、28和32的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列以及分别为SEQ ID NO：36、40和44的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列(表3)。结合人ST2L的域I的另外示例性抗体是表16和图13中所示的抗体，例如抗体STLM103、STLM107、STLM108、STLM123、STLM124、STLM208、STLM209、STLM210、STLM211、STLM212和STLM213。示例性人抗体拮抗剂示于图12和图13中。示例性人适应性拮抗剂示于表14中。
在本文所述的一些实施例中，特异性结合人ST2L的域I(SEQ ID NO：9)的分离的人或人适应性抗体拮抗剂或其片段阻断IL-33/ST2L相互作用。
可通过标准ELISA测试抗体阻断IL-33/ST2L相互作用的能力。例如，将平板用人ST2L的胞外域(huST2L-ECD)涂布，并与抗体一起温育，之后测量平板上生物素酰化IL-33的结合。“阻断IL-33/ST2L相互作用”或“抑制IL-33/ST2L相互作用”的抗体，是在使用huST2L-ECD涂布的平板的ELISA测定法中，在50μg/ml抗体浓度下，当与抗体不存在的情况下的IL-33结合相比时，使来源于结合平板的生物素酰化IL-33的信号降低至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的抗体。
可通过使用标准方法及下文所示例的方法，评估抗体对于例如由人脐带血源性肥大细胞或原代人肺肥大细胞的GM-CSF、IL-5、IL-10或IL-13释放的抑制活性，而测试抗体对肥大细胞响应的抑制。如本文所述的“抑制肥大细胞响应”或“抑制肥大细胞活性”的抗体，是在10μg/ml浓度下，当与未经抗体处理的肥大细胞相比时，使1-3ng/ml IL-33诱导的GM-CSF、IL-5、IL-13或IL-10分泌降低至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的抗体。通常，肥大细胞可通过熟知的方法及如下文示例而来源于人脐带血或肺实质以及小气道CD34+祖细胞。肥大细胞培养条件可影响抗体的抑制％的量度，因此培养和测试条件在6-10周长的分化过程中，可使用例如StemPro-34培养基保持标准。在细胞因子释放测定之前的4天，每天 以10ng/ml IL-4、10ng/ml IL-6和100ng/ml SCF刺激肥大细胞。对于细胞因子释放测定而言，肥大细胞可重悬于新鲜的StemPro-34培养基中，或含有10％无抗生素的FCS及100ng/ml SCF的RPMI中。适合测定的接种密度为65,000至75,000个细胞/0.16ml/孔。如本文所述的抑制肥大细胞响应的本发明示例性抗体是抗体STLM15、STLM62和STLM208。抗体CNTO3914结合小鼠ST2L域I，而无对于人ST2L的交叉反应性，并在小鼠细胞中抑制肥大细胞响应。
本领域的技术人员将会知道，肥大细胞响应也包括如下物质的释放：IL-1和IL-32，以及趋化因子(诸如CCL1、CCL4、CCL5、CCL18和CCL23)，以及过敏介质(诸如半胱氨酰白三烯、组胺)，以及多种肥大细胞蛋白酶(包括类胰蛋白酶、糜酶、羧肽酶和组织蛋白酶G)。如本文所述的本发明抗体可使用标准方法测试其抑制这些另外的肥大细胞响应的能力。如本文所述的结合ST2L的域I并阻断IL-33/ST2L相互作用的本发明的抗体，当在这些条件下，以10μg/ml的最小浓度测试时，可预期使这些另外的肥大细胞响应抑制至少40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。
如本文所述的本发明的抗体以下列常数结合人ST2L：介于约5×10-12M至约7×10-10M之间的解离常数(KD)，介于约2×106M-1s-1至约1×108M-1s-1之间的对人ST2L的结合速率常数(Kon)，或介于约1×10-6s-1至约1×10-2s-1之间的对人ST2L的解离速率常数(Koff)。例如，如本文所述的本发明的抗体以小于约7×10-10M、小于约1×10-10M、小于约5×10-11M、小于约1×10-11M或小于约5×10-12M的KD结合人ST2L。
如本文所述的本发明的抗体可与食蟹猴(cyno)ST2L(SEQ ID NO：2)交叉反应，并以下列常数结合于cyno ST2L：介于约3×10-12M至约2×10-9M之间的解离常数(KD)，介于约4×106M-1s-1至约1×108M-1s-1之间的对cyno ST2L的结合速率常数(Kon)，或介于约7×10-5s-1至约1×10-1s-1之间的对cyno ST2L的解离速率常数(Koff)。例如，如本文所述的本发明的抗体以小于约2×10-9M、小于约1×10-9M、小于约1×10-10M、小于约1×10-11M或小于约3×10-12M的KD结合cyno ST2L。
抗体对ST2L的亲和力可使用任何合适的方法通过实验测定。此类方法可利用本领域技术人员已知的ProteOn XPR36、Biacore 3000或KinExA 仪器、ELISA或竞争性结合测定。如果在不同条件下(例如渗透压、pH)测量，则所测得的特定抗体/ST2L相互作用的亲和力可不同。因此，亲和力和其他结合参数(如，KD、Kon、Koff)的测量优选地用标准化条件和标准化缓冲液诸如本文所述的缓冲液进行。本领域技术人员将会知道，使用例如Biacore 3000或ProteOn进行亲和力测量的内部误差(测量为标准偏差，SD)通常可在典型检出限内的测量值的5-33％内。因此术语“约”反映测定中的典型标准偏差。例如，1×10-9M的KD的典型SD为至多±0.33×10-9M。
以所需亲和力结合人ST2L并任选地与cyno ST2L交叉反应的抗体，可通过用人和/或cyno ST2L淘选，并任选地通过进一步抗体亲和力成熟，从变体或片段的文库中选择。抗体可根据其对ST2L生物活性的抑制使用任何合适的方法来鉴定。此类方法可使用报告基因测定法或测量细胞因子制备的测定法，使用所熟知的方法并如本发明中所描述来进行。
本发明的一个实施例是特异性结合人ST2L的分离抗体拮抗剂，其包含：
SEQ ID NO：160(X1X2X3MX4)的重链互补决定区(HCDR)1(HCDR1)；其中
X1为S、F、D、I、G或V；
X2为Y或D；
X3为A、D或S；并且
X4为S、F或I；
SEQ ID NO：161(X5IX6GX7GGX8TX9YADSVKG)的HCDR 2(HCDR2)；其中
X5为A、S、T、Y或D；
X6为S、R、E、K、G或A；
X7为S、E或N；
X8为S、R、E、G、T、D或A；并且
X9为Y、D、N、A或S；以及
SEQ ID NO：162(X10X11WSTEGSFFVLDY)的HCDR 3(HCDR3)；其中
X10为D、A、R、N、Q、P、E、I、H、S、T或Y；并且
X11为P、A、H、Y、E、Q、L、S、N、T、V、或I。
本发明的另一个实施例是特异性结合人ST2L的分离抗体拮抗剂，其包含：
SEQ ID NO：163(RASQSVDDX12LA)的轻链互补决定区(LCDR)1(LCDR1)；其中
X12为A或D；
SEQ ID NO：90(DASNRAT)的LCDR 2(LCDR2)；以及
SEQ ID NO：164(QQX13X14X15X16X17X18T)的LCDR 3(LCDR3)；其中
X13为F或Y；
X14为Y、I或N；
X15为N、G、D或T；
X16为W或A；
X17为P或缺失；并且
X18为L或I。
分别包含SEQ ID NO：160、161、162、163、90和164的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的本发明的抗体，可通过熟知的诱变方法，分别使用例如SEQ ID NO：78、81、84、87、90和92的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列作为模板来制备。可分别将SEQ ID NO：160、161、162、163、90和164的重链CDR和轻链CDR移植到人框架，诸如下文所述的框架。可使用本文所述的方法分析该抗体对ST2L的结合，其阻断IL-33/ST2L相互作用的能力以及其他特征，诸如对人ST2L和/或cyno ST2L的亲和力，以及对肥大细胞响应的抑制。
在一个实施例中，如本文所述特异性结合人ST2L的分离抗体拮抗剂包含：
SEQ ID NO：78或95-108的HCDR1；
SEQ ID NO：81，109-118或120-129的HCDR2；
SEQ ID NO：84或165-185的HCDR3；
SEQ ID NO：87或130的LCDR1；
SEQ ID NO：90的LCDR2；以及
SEQ ID NO：92或131-134的LCDR3。
在另一个实施例中，特异性结合人ST2L的分离抗体拮抗剂包含如图10、图11和图12所示和如本文所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
在另一个实施例中，如本文所述的特异性结合人ST2L的分离抗体拮抗剂包含：
SEQ ID NO：23或24的HCDR1；
SEQ ID NO：27或28的HCDR2；
SEQ ID NO：31或32的HCDR3；
SEQ ID NO：35或36的LCDR1；
SEQ ID NO：39或40的LCDR2；以及
SEQ ID NO：43或44的LCDR3。
在另一个实施例中，如本文所述的特异性结合人ST2L的分离抗体拮抗剂包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列：
分别为SEQ ID NO：23、27、31、35、39和43；
分别为SEQ ID NO：24、28、32、36、40和44；(HFA CDR)；
分别为SEQ ID NO：24、28、146、36、40和147；或
分别为SEQ ID NO：24、28、146、36、40和44。
本发明的另一个实施例为如本文所述的特异性结合人ST2L(SEQ ID NO：1)的分离的人或人适应性抗体拮抗剂或其片段，其包含具有来源于人IGHV3-23(SEQ ID NO：158)、IGHV1-24*01(SEQ ID NO：148)或IGHV1-f*01(SEQ ID NO：149)框架序列的VH框架的重链可变区(VH)，以及具有来源于人IGKV3-11(L6)(SEQ ID NO：159)、IGKV3-15*01(L2)(SEQ ID NO：150)、IGKV1-9*01(L8)(SEQ ID NO：151)、IGKV1-5*01(L12)(SEQ ID NO：152)、IGKV1-12*01(L5)(SEQ ID NO：153)、IGKV1-39*01(O12)(SEQ ID NO：154)、IGKV1-27*01(A20)(SEQ ID NO：155)或IGKV1-33*01(O18)(SEQ ID NO：156)框架序列的VL框架的轻链可变区(VL)。
在另一个实施例中，如本文所述特异性结合人ST2L的域I的分离抗体包含具有来源于人VH 3-23框架序列(SEQ ID NO：158)的VH框架的VH；以及具有来源于人VκL6框架序列(SEQ ID NO：159)的VL框架的轻链可变区(VL)。人框架序列是熟知的，并且通常包括接合到接合(J)序列的人免疫球蛋白种系可变区序列。SEQ ID NO：158中所示的人VH 3-23框架氨基酸 序列包括接合到IGHJ4的人种系VH 3-23序列，并且SEQ ID NO：159中所示的人Vk L6框架氨基酸序列包括接合到IGKJ1的人VκL6种系序列，如Shi等人，J Mol Biol 397：385-96，2010；国际专利公开WO2009/085462；和美国专利公开US2010/0021477中所述。具有来源于人VH 3-23的VH序列和来源于人VκL6的VL序列的示例性抗体为图12和图13中所示的那些。
包含“来源于”特定框架或种系序列的重链或轻链可变区的人或人适应性抗体，是指从使用人种系免疫球蛋白基因的系统，诸如从转基因小鼠或从噬菌体展示文库得到的抗体，如下文所讨论。“来源于”特定框架或种系序列的抗体，与其所来源的序列相比，由于例如自然发生的体细胞突变或有意的置换，可含有氨基酸差异。
在另一个实施例中，特异性结合如本文所述的人ST2L的域I(SEQ ID NO：9)的分离的人或人适应性抗体拮抗剂或其片段，与包含SEQ ID NO：47的重链可变区(VH)和SEQ ID NO：51的轻链可变区(VL)的分离抗体(抗体C2244)，竞争结合于人ST2L(SEQ ID NO：1)。
在另一个实施例中，如本文所述的本发明的分离抗体在SEQ ID NO：1的第35-48位氨基酸残基(RCPRQGKPSYTVDW；SEQ ID NO：210)处结合人ST2L。如本文所述的抗体还可在SEQ ID NO：1的氨基酸残基T93和F94处结合人ST2L。
如本文所述包含某些HCDR1、HCDR2和HCDR3以及LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列、或包含某些VH和VL序列的本发明抗体之间特异性结合于人ST2L的竞争作用，可使用熟知的方法在体外测定。例如，MSD Sulfo-TagTM NHS酯标记抗体在未标记抗体存在下对人ST2L的结合可通过ELISA评估，或可使用Biacore分析法或流式细胞术证实与本发明抗体的竞争作用。测试抗体抑制C2244结合于人ST2L的能力证实该测试抗体可与这些抗体竞争结合于人ST2L。此类示例性抗体为表3和图13中所示的C2494、STLM208和STLM213。
如本文所述的与C2244竞争结合于ST2L的域I的抗体，阻断IL-33/ST2L相互作用并抑制一系列的ST2L生物活性，包括IL-33诱导的肥大细胞响应。ST2L域I上也存在非中和性的(即非抑制性)表位，作为第二抗体竞争基团(以结合ST2L的域I、不与C2244竞争且不抑制ST2L信号传导的抗体C2240表示)。
如本文所述的本发明的结合特定ST2L域或表位的抗体，可通过用编码该表位的肽免疫接种表达人免疫球蛋白基因座的小鼠(Lonberg等人，Nature 368：856-9，1994；Fishwild等人，Nature Biotechnology 14：845-51，1996；Mendez等人，Nature Genetics 15：146-56，1997；美国专利5,770,429、7,041,870和5,939,598)或Balb/c小鼠而制备，所述肽例如为具有人ST2L的域I的氨基酸序列的肽：KFSKQSWGLENEALIVRCPRQGKPSYTVDWYYSQTNKSIPTQERNRVFAS GQLLKFLPAAVADSGIYTCIVRSPTFNRTGYANVTIYKKQSDCNVPDYLM YSTV(SEQ ID NO：9)，或具有氨基酸序列RCPRQGKPSYTVDW(SEQ ID NO：210)的肽，并使用Kohler等人，Nature 256：495-97，1975的杂交瘤方法。所得抗体使用标准方法测试其对该表位的结合。例如，当各个组分的结构均已知时，可进行计算机芯片上的(in silico)蛋白质-蛋白质对接，以鉴定相互作用的相容位点。可使用所述抗原和抗体复合物进行氢-氘(H/D)交换以标测所述抗原上可能受到该抗体结合的区域。可使用所述抗原的片段和点诱变来定位对于抗体结合而言重要的氨基酸。所鉴定的单克隆抗体可进一步通过诸如Queen等人，Proc Natl Acad Sci(USA)86：10029-32，1989和Hodgson等人，Bio/Technology 9：421，1991中所公开的技术，结合经改变的框架支撑残基而修饰以保留结合亲和力。
如本文所述的本发明的抗体可为人抗体或人适应性抗体。如本文所述的本发明的抗体可为IgA、IgD、IgE、IgG或IgM型。
其抗原结合位点氨基酸序列与图10、图11、图12、图13、图15、表3、表9和表12中所示基本上相同的抗体涵盖在本发明的范围之内。通常，这涉及一个或多个用具有相似电荷或疏水性或立体化学特征的氨基酸进行的氨基酸置换，且目的是改善抗体特性，例如稳定性或亲和力。例如，保守性置换可涉及用非天然残基进行的天然氨基酸残基的置换，使得该位置的氨基酸残基的极性或电荷几乎无影响或无影响。此外，多肽中的任何天然残基还可以用丙氨酸来置换，如此前对于丙氨酸扫描诱变所述(MacLennan等人，Acta Physiol Scand Suppl 643：55-67，1998；Sasaki等人，Adv Biophys 35：1-24，1998)。所期望的氨基酸置换(无论是保守性还是非保守性)可由本领域的技术人员在需要此类置换时来决定。例如，可使用氨基酸置换来鉴定对抗体的功能具有重要性的残基，诸如影响亲和力 的残基，或赋予非期望特性诸如聚集的残基。示例性氨基酸置换示于图12和图13中。
与抗原结合位点呈对比，还可产生框架区内的置换，只要它们不会不利地影响所述抗体的特性。可在例如Vernier Zone残基(美国专利6,649,055)进行框架置换以改善抗体亲和力或稳定性。也可在抗体中在与同源人种系基因序列相比时序列不同的框架位置进行置换，以降低可能的免疫原性。这些修饰可对例如来源于从头合成抗体文库诸如pIX文库的抗体进行。
保守性氨基酸置换还涵盖了非天然存在的氨基酸残基，其通常通过化学肽合成并入而非通过生物系统中的合成。氨基酸置换可以例如通过PCR诱变来进行(美国专利4,683,195)。可使用熟知方法生成变体文库，例如使用随机(NNK)或非随机密码子(例如DVK密码子，其编码11个氨基酸(ACDEGKNRSYW))，并筛选具有所需特性的文库或变体。
虽然实例中所示的实施例包含一者来自重链且一者来自轻链的成对可变区、成对全长抗体链、或成对CDR1、CDR2和CDR3区，但技术人员将认识到替代性实施例可包含来自一条抗体链的重链或轻链中的任一者的单一重链可变区或单一轻链可变区、单一全长抗体链、或CDR1、CDR2和CDR3区。可使用一条链的单一可变区、全长抗体链或CDR1、CDR2和CDR3区筛选另一条链中的对应域，这两条链能够形成特异性结合ST2L的抗体。所述筛选可以通过噬菌体展示筛选方法并使用例如在PCT公开WO1992/01047中所公开的分级双组合法(hierarchical dual combinatorial approach)来完成。在此方法中，包含H链克隆或L链克隆的单个菌落被用来感染编码另一链(L或H)的克隆的完全文库，并且所得的双链特异性抗原结合域根据所描述的噬菌体展示技术来选择。
本发明提供如本文所述的本发明抗体的分离VH和VL域，以及包含特定VH和VL域的抗体。如本文所述的本发明的某些抗体的VH和VL可变区示于图13和表12中。
本发明的一个实施例是一种分离的人或人适应性抗体拮抗剂或其片段，其特异性结合人ST2L的域I(SEQ ID NO：9)，包含与SEQ ID NO：191的VH具有至少90％同一性的VH。
本发明的另一个实施例是一种分离的人或人适应性抗体拮抗剂或其片段，其特异性结合人ST2L的域I(SEQ ID NO：9)，包含与SEQ ID NO：209的VL具有至少94％同一性的VL。
在本文所述的一些实施例中，本发明提供一种抗体，其包含SEQ ID NO：143、144、145、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204或205的VH。
在本文所述的一些实施例中，本发明提供一种抗体，其包含SEQ ID NO：135、136、137、138、139、140、141、142、206、207、208或209的VL。
在本文所述的一些实施例中，本发明提供一种抗体，其包含
SEQ ID NO：186、187、197、198、199、200、201、202、203、204或205的VH和SEQ ID NO：206的VL；
SEQ ID NO：195或196的VH和SEQ ID NO：207的VL；
SEQ ID NO：188、189或190的VH和SEQ ID NO：208的VL；或
SEQ ID NO：187、191、192、193或194的VH和SEQ ID NO：209的VL。
本发明的另一个实施例是一种分离的人或人适应性抗体拮抗剂或其片段，其特异性结合人ST2L的域I(SEQ ID NO：9)，包含：
SEQ ID NO：97的HCDR1；
SEQ ID NO：114的HCDR2；
SEQ ID NO：84的HCDR3；
SEQ ID NO：130的LCDR1；
SEQ ID NO：90的LCDR2；
SEQ ID NO：134的LCDR3；或
SEQ ID NO：191的VH和SEQ ID NO：209的VL。
缺少任何非人序列的人单克隆抗体可通过例如Knappik等人，J Mol Biol 296：57-86，2000；和Krebs等人，J Immunol Meth 254：67-842001中引用的技术由噬菌体展示文库制备和优化。在示例性方法中，本发明的抗体分离自将抗体重链和轻链可变区表达为具有噬菌体pIX外壳蛋白质的融合蛋白质的文库。筛选抗体文库中结合于人ST2L-ECD的那些，并进一步表征所得的阳性克隆，从克隆溶解物分离Fabs，并表达为全长IgG。示例性 抗体文库和筛选方法描述于Shi等人，J Mol Biol 397：385-96，2010；国际专利公开WO2009/085462和美国专利号12/546850；美国专利5,223,409、5,969,108和5,885,793)。
所得的单克隆抗体可进一步在其框架区进行修饰，以将某些框架残基改变为相匹配的人种系中存在的残基。
本发明的抗体的免疫效应子特性可通过本领域技术人员已知的技术经由Fc修饰得到增强或沉默。例如，Fc效应子功能诸如C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等，可通过修饰促成这些活性的Fc中的残基来提供和/或控制。药代动力学特性还可通过使Fc域中延长抗体半衰期的残基突变得到增强(Strohl Curr Opin Biotechnol 20：685-91，2009)。示例性Fc修饰是IgG4S228P/L234A/L235A、IgG2M252Y/S254T/T256E(Dall’Acqua等人，J Biol Chem 281：23514-24，2006；或IgG2V234A/G237A/P238S、V234A/G237A/H268Q、H268A/V309L/A330S/P331或IgG2上的V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S(国际专利申请WO2011/066501)(根据EU编号进行编号)。
另外，如本文所述的本发明的抗体可通过诸如糖基化、异构化、去糖基化或非天然存在的共价修饰(诸如添加聚乙二醇部分(聚乙二醇化)和脂质化)等过程进行翻译后修饰。此类修饰可在体内或体外进行。例如，如本文所述的本发明的抗体可缀合至聚乙二醇(聚乙二醇化的)以改善其药代动力学特性。缀合可通过本领域技术人员已知的技术来执行。治疗抗体与PEG的缀合已示出增强药效学，同时不干扰功能(Knigh等人，Platelets 15：409-18，2004；Leong等人，Cytokine 16：106-19，2001；Yang等人，Protein Eng 16：761-70，2003)。
如本文所述经修饰以改善稳定性、选择性、交叉反应性、亲和力、免疫原性或其他所期望的生物或生物物理特性的本发明抗体或其片段在本发明的范围之内。抗体的稳定性受许多因素影响，包括(1)影响其内在稳定性的单独域的核心堆叠，(2)对HC和LC配对具有影响的蛋白质/蛋白质界面相互作用，(3)极性和带电残基的包埋，(4)极性和带电残基的H键网络；以及(5)其他分子内力和分子间力中的表面电荷和极性残基分布(Worn等人， J Mol Biol 305：989-1010，2001)。潜在的结构不稳定残基可根据该抗体的晶体结构或在某些情况下通过分子建模来鉴定，并且所述残基对于抗体稳定性的影响可通过产生并评估在所鉴定残基中携带突变的变体来测试。用于提高抗体稳定性的方法之一是提高热相变中点(Tm)如差示扫描量热法(DSC)所测定。一般来讲，蛋白质的Tm与其稳定性相关联并且与其对溶液中的解折叠和变性以及依赖于该蛋白质解折叠倾向的降解过程的易感性成反向相关(Remmele等人，Biopharm 13：36-46，2000)。大量的研究已经发现了通过DSC以热稳定性而测量的制剂物理稳定性的级别与通过其他方法测量的物理稳定性之间的相关性(Gupta等人，AAPS PharmSci 5E8，2003；Zhang等人，J Pharm Sci 93：3076-89，2004；Maa等人，Int J Pharm 140：155-68，1996：Bedu-Addo等人，Pharm Res 21：1353-61，2004；Remmele等人，Pharm Res 15：200-8，1997)。制剂研究提示，Fab的Tm对于对应单克隆抗体的长期物理稳定性有所牵涉。框架或CDR之内的氨基酸差别对于Fab域的热稳定性可具有显著影响(Yasui等人，FEBS Lett 353：143-6，1994)。
如本文所述的特异性结合人ST2L域I的本发明的抗体，可工程改造成双特异性抗体，其也涵盖在本发明的范围之内。本发明的抗体的VL区和/或VH区，可使用已公布的方法工程改造成结构如设计(国际专利公开WO1999/57150；美国专利公开US2011/0206672)的单链双特异性抗体，或工程改造成结构如公开于美国专利US5869620；国际专利公开WO1995/15388A、国际专利公开WO1997/14719或国际专利公开WO2011/036460中的结构的双特异性scFV。
如本文所述的本发明的抗体的VL区和/或VH区，可工程改造成双特异性全长抗体，其中每个抗体臂结合不同的抗原或表位。通常通过调节这二条抗体重链之间的CH3相互作用制备此类双特异性抗体，以使用诸如美国专利US7695936；国际专利公开WO04/111233；美国专利公开US2010/0015133；美国专利公开US2007/0287170；国际专利公开WO2008/119353；美国专利公开US2009/0182127；美国专利公开US2010/0286374；美国专利公开US2011/0123532；国际专利公开WO2011/131746；国际专利公开WO2011/143545；或美国专利公开US2012/0149876中所述的那些技术来形成双特异性抗体。可在其中结合本发明的抗体的VL区和/或VH区的另外双特异性结构，是例如双可变域免 疫球蛋白(国际专利公开WO2009/134776)，或包括多种二聚域的结构以连接具有不同特异性的两个抗体臂，诸如亮氨酸拉链或胶原二聚域(国际专利公开WO2012/022811；美国专利US5932448；美国专利US6833441)。
本发明的另一个方面是分离的多核苷酸，其编码本发明的任何抗体重链可变区或抗体轻链可变区或其片段，或它们的互补序列。本文公开了某些示例性多核苷酸，然而，鉴于在给定表达系统中的给定的遗传密码简并性或密码子偏倚性而编码本发明抗体拮抗剂的其他多核苷酸也在本发明的范围内。本发明的示例性多核苷酸为在SEQ ID NO：211、212、213和214中所示的那些。
本发明的另一个实施例是包含本发明的多核苷酸的载体。此类载体可以是质粒载体、病毒载体、杆状病毒表达载体、基于转座子的载体或任何其它适用于通过任何手段将本发明的多核苷酸引入给定生物体或遗传背景的载体。
本发明的另一个实施例是包含本发明多核苷酸的宿主细胞。此类宿主细胞可以是真核细胞、细菌细胞、植物细胞或古菌细胞。示例性的真核细胞可以是哺乳动物、昆虫、禽类或其他动物来源。哺乳动物真核细胞包括无限增殖化细胞系，诸如杂交瘤或骨髓瘤细胞系，诸如SP2/0(美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Manassas，VA，CRL-1581)、NS0(欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)，Salisbury，Wiltshire，UK，ECACC No.85110503)、FO(ATCC CRL-1646)和Ag653(ATCC CRL-1580)鼠细胞系。示例性人骨髓瘤细胞系是U266(ATTC CRL-TIB-196)。其他可用的细胞系包括来源于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的那些细胞系，诸如CHO-KlSV(Lonza Biologics，Walkersville，MD)、CHO-K1(ATCC CRL-61)或DG44。
本发明的另一个实施例是制备特异性结合ST2L的域I的抗体的方法，所述方法包括培养本发明的宿主细胞以及回收由该宿主细胞所产生的抗体。制造抗体并将其纯化的方法是本领域所熟知的。
本发明的另一个实施例是在受治疗者中抑制ST2L与IL-33相互作用的方法，其包括以足以抑制ST2L和IL-33的相互作用的量向该受治疗者施用特异性结合ST2L的域I的抗体。
治疗方法
如本文所述的本发明的ST2L拮抗剂，例如阻断IL-33/ST2L相互作用并结合ST2L域I的ST2L抗体拮抗剂、与包含SEQ ID NO：47的重链可变区和SEQ ID NO：51的轻链可变区的分离抗体竞争结合于人ST2L(SEQ ID NO：1)的抗体、或在SEQ ID NO：1的第35-48位氨基酸残基(RCPRQGKPSYTVDW；SEQ ID NO：210)处结合人ST2L的抗体，可用于调节免疫系统。如本文所述的本发明的抗体，当与结合ST2L其他域和/或区的抗体相比时，可更有效地拮抗ST2L生物活性，例如本发明的抗体能够更有效地降低IL-33诱导的肥大细胞响应。本发明的任何抗体可用于本发明的方法中。可用于本发明的方法中的示例性抗体是抗体STLM62、STLM15、STLM103、STLM107、STLM108、STLM123、STLM124、STLM206、STLM207、STLM208、STLM209、STLM210、STLM211、STLM212、STLM213。不希望受任何理论的束缚，据推论结合域I并阻断IL-33/ST2L相互作用的抗体拮抗剂可抑制肥大细胞上IL-1RAcP/IL-33/ST2L/cKit复合物形成或下游的信号传导，然而域III结合抗体，虽然能够抑制IL-1RAcP募集到ST2L/IL-33复合物，但可能无法破坏特异性存在于肥大细胞上的较大IL-1RAcP/IL-33/ST2L/cKit复合物的形成。进行的芯片分析支持所述推论，因为芯片分析证实抗-ST2L域I结合抗体抑制大多数由IL-33诱导的肥大细胞信号传导途径，而抗-ST2L域III结合抗体仅能抑制这些信号传导途径的一小部分。可能的是，由于在辅助蛋白IL-1RAcP缔合之前IL-33先结合于ST2L，通过域I结合抗体阻碍IL-33结合于ST2L即可避免任何其他辅助蛋白的缔合，包括cKit或尚未鉴别的辅助受体。不会干扰IL-33结合于ST2L的域III结合抗体，理论上可阻断IL-1RAcP缔合，但不会阻断其他辅助受体的缔合，包括尚未鉴别的辅助受体。已提出多个模型用于解释IL-1RAcP如何与IL-1/IL-1R或ST2L/IL-33复合物相互作用(Lingel等人，Structure 17：1398-1410，2009；以及综述于Thomas等人，Nat Struct&Molec Biol19：455-457，2012)。这些模型指示，IL-1RAcP可结合于该复合物的一侧，但结合于哪一侧则尚无定论。因此，可能的是，该复合物的“其他侧”或“游离侧”可用于与不会被域III抗体阻断的替代性辅助受体缔合，并且可能出现脱靶效应诸如增加另一辅助受体募集，导致信号传导增加。
在本发明的方法中，可使用任何特异性结合人ST2L域I的抗体拮抗剂、阻断IL-33/ST2L相互作用并结合人ST2L域I的抗体拮抗剂、与包含SEQ ID NO：47的重链可变区和SEQ ID NO：51的轻链可变区的分离抗体竞争结合于人ST2L(SEQ ID NO：1)的抗体、或在SEQ ID NO：1的第35-48位氨基酸残基(RCPRQGKPSYTVDW；SEQ ID NO：210)处结合人ST2L的抗体。此类抗体的另外特征包括该抗体阻断IL-33/ST2L相互作用并抑制人肥大细胞响应的能力。
因此，本发明的抗体适用于治疗一系列ST2L介导的病症、ST2L介导的炎性病症以及需要抑制肥大细胞响应的病症。
本发明的方法可用于治疗属于任何分类的动物患者。此类动物的例子包括哺乳动物，诸如人、啮齿动物、犬类、猫类和农畜。例如，例如，本发明的抗体可用于预防和治疗ST2L介导的病症，诸如炎性疾病，包括哮喘、气道过度反应、结节病、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、特发性肺纤维化(IPF)、囊性纤维化、炎性肠病(IBD)、类风湿性关节炎、嗜酸细胞性食道炎、硬皮病、特应性皮炎、过敏性鼻炎、大疱性类天疱疮、慢性荨麻疹、糖尿病性肾病、间质性膀胱炎或移植物抗宿主病(GVHD)。本发明的抗体可用于预防和治疗至少部分由肥大细胞介导的免疫疾病，诸如哮喘、湿疹、瘙痒、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎，以及自体免疫疾病，诸如类风湿性关节炎、大疱性类天疱疮和多发性硬化症。
本发明的抗体也可用于制备用于此类治疗的药物，其中制备所述药物用于以本文限定的剂量施用。
肥大细胞通过释放多种介质，而在过敏性炎症和哮喘中起到核心作用(综述于Amin，Respir Med 106：9-14，2012)。ST2L在肥大细胞上高表达，且其活化导致多种促炎细胞因子及其他介质的表达。ST2L活性的抑制据推测会干扰肥大细胞介导的炎性细胞募集并调节慢性炎症。
肥大细胞对于刺激会快速响应，所述刺激包括过敏原、冷空气、病原体；这些刺激对上皮细胞的损伤可造成IL-33的释放(综述于Zhao和Hu，Cell&Molec Immunol 7：260-2，2012)。肥大细胞释放白三烯、组胺、前列腺素和细胞因子，以提高血管通透性和支气管收缩，并募集其他免疫细胞，诸如嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和T淋巴细胞到该位点(Henderson等人，JEM 184：1483-94，1996；White等人，JACI 86：599-605，1990)。另 外，它们通过诱导内皮细胞上的粘附分子上调以增加免疫细胞运输而增强免疫响应(Meng等人，J Cell Physiol 165：40-53，1995)。肥大细胞在气道重塑中起到重要作用；在哮喘患者中，在气道平滑肌(ASM)细胞层内发现增加数量的肥大细胞，这些肥大细胞分泌介质来促进ASM增殖(综述于Okayama等人，Curr Opin Immunol 19：687-93，2007)。
炎性肺部病症是炎性病症的一个例子。示例性炎性肺部病症包括感染诱导的肺部病症，包括与病毒、细菌、真菌、寄生虫或朊病毒感染相关联的肺部病症；过敏原诱导的肺部病症；污染物诱导的肺部病症，诸如石棉肺、矽肺或铍肺；胃内容物吸入诱导的肺部病症、免疫失调、具有遗传倾向的炎性病症诸如囊性纤维化，以及物理创伤诱导的肺部病症，诸如呼吸机肺损伤。这些炎性病症还包括哮喘、肺气肿、支气管炎、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、结节病、组织细胞增多病、淋巴管性肌瘤病、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、慢性肺病、支气管肺发育异常、社区获得性肺炎、医院性肺炎、呼吸机关联性肺炎、败血病、病毒性肺炎、流行性感冒感染、变异流行性感冒病毒感染、轮状病毒感染、人类偏肺病毒感染、呼吸道合胞病毒感染和曲霉(Aspergillus)或其他真菌感染。示例性的感染相关炎性疾病可包括病毒性或细菌性肺炎，包括重症肺炎、囊性纤维化、支气管炎、呼吸道急性加重和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。此类感染相关病症可涉及多重感染，诸如原发性病毒感染和继发性细菌感染。失调的ST2L信号传导可能在肺部疾病诸如哮喘和慢性阻塞性肺部疾病(COPD)的病变中起作用(综述于Alcorn等人，Annu Rev Physiol 72：495-516，2010)。常用的哮喘和气道炎症动物模型包括卵清蛋白攻击模型、乙酰甲胆碱致敏模型以及用烟曲霉(Aspergillus fumigatus)致敏(Hessel等人，Eur J Pharmacol293：401-12，1995)。对来自培养的人支气管上皮细胞、支气管成纤维细胞或气道平滑肌细胞的细胞因子和趋化因子的制备的抑制也可用作体外模型。本发明的拮抗剂对于这些模型中的任一个的施用可用于评估这些拮抗剂改善症状和改变哮喘、气道炎症、COPD等等的病程的用途。
哮喘是肺部的炎性疾病，其特征在于气道高反应性(“AHR”)、支气管收缩、哮鸣音、嗜酸性或嗜中性炎症、粘液过分泌、上皮下纤维化以及升高的IgE水平。患有哮喘的患者经历了“急性加重”(症状的恶化)，最常见是因为呼吸道的微生物感染(例如，鼻病毒、流行性感冒病 毒、流感嗜血杆菌)。哮喘发作可由环境因素所触发(例如，蛔虫、昆虫、动物(例如，猫、犬、兔、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠和鸟类)、真菌、大气污染物(例如，烟草烟雾)、刺激性气体、烟雾、蒸气、气溶胶、化学品、花粉、活动或冷空气。除哮喘外，影响肺的多种慢性炎性疾病的特征在于对气道的中性粒细胞浸润，例如慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、细菌性肺炎和囊性纤维化(Linden等人，Eur Respir J 15：973-7，2000；Rahman等人，Clin Immunol 115：268-76，2005)，并且诸如COPD、过敏性鼻炎和囊性纤维化的疾病的特征在于气道过度响应(Fahy和O'Byrne，Am J Respir Crit Care Med 163：822-3，2001)。常用的哮喘和气道炎症动物模型包括卵清蛋白致敏和攻击之后的乙酰甲胆碱攻击的模型(Hessel等人，Eur J Pharmacol 293：401-12，1995)。对来自培养的人支气管上皮细胞、支气管成纤维细胞或气道平滑肌细胞的细胞因子和趋化因子的制备的抑制也可用作体外模型。本发明的抗体拮抗剂对于这些模型中的任一个的施用可用于评估这些拮抗剂改善症状和改变哮喘、气道炎症、COPD等等的病程的用途。
通过在TH2细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞和新发现的先天性2型淋巴细胞上的ST2L受体进行的IL-33信号传导，造成IL-5和IL-13(2型细胞因子)分泌(ILC，综述于Spits等人，Nature Reviews Immunology13：145-149，2013)。靶向哮喘中的IL-5或IL-13的治疗的有益效果证实这些途径的相关性。IL-5活化嗜酸性粒细胞，并且用中和IL-5的单克隆抗体治疗患有唾液嗜曙红细胞过多的重症哮喘患者的亚组，结果为减少恶化情形(Nair等人，N Engl J Med.2009；360(10)：985-93)。据报道IL-13有助于IgE合成、粘液分泌和纤维化。用抗-IL-13单克隆抗体治疗重症哮喘患者，导致肺功能改善，其中亚组显示更大的改善(Corren等人，N.Engl.J.Med.，365：1088-1098，2011)。差别性免疫途径的其他介质也参与哮喘致病机制，并且阻断除ST2L以外的这些介质可提供另外的治疗有益效果。靶向多个2型细胞因子或2型细胞因子产生的上游途径的治疗，在重症疾病中可具有有益效果。
本发明的ST2L抗体的VH域和VL域可结合到双特异性抗体和本文所述的分子中，其中该双特异性抗体特异性结合ST2L的域I及第二抗原，诸 如TSLP(胸腺基质淋巴生成素(thymic stromal lympohpoietin))、IL-25、IL-17RB或TSLPR。
IL-25和TSLP(如IL-33)通过不同的信号传导复合物触发2型细胞因子释放：IL-25(IL-17E)是IL-17家族的成员并通过IL-17RA/IL-17RB进行信号传导，而TSLP是IL-7家族的成员并通过TSLPR/IL-7Rα异源二聚体进行信号传导(综述于Koyasu等人，Immunol 132：475-481，2011)。有IL-33、ST2L、IL-25、IL-17RB、TSLP或TSLPR缺陷的动物在多种不同类型的哮喘小鼠模型中的至少一种中证实气道炎症较不严重；然而在大多数这些动物模型中，可能缺少对气道炎症的保护，从而提高了上皮细胞暴露于多种过敏原或病原体时可伴随触发IL-33、IL-25和TSLP的释放的可能性。Hammad等人报道，将屋尘螨提取物施用给小鼠，造成IL-25、TSLP和IL-33(以及IL-33下游的IL-5和IL-13)释放到气道中(Hammad等人，Nat Med 15：210-216，2009)。这表明，阻断ST2L和TSLP和/或IL-25可具有有益效果，特别是在重症气道疾病中。
在本发明的另一个实施例中，特异性结合人ST2L域I的抗体拮抗剂可用于产生结合ST2L和TSLP、ST2L和IL-25、ST2L和TSLPR、ST2L和IL-17RA、或ST2L和IL-17RB的双特异性分子。
在本发明的另一个实施例中，特异性结合人ST2L域I的抗体拮抗剂是双特异性抗体，其中该抗体进一步结合TSLP、IL-25、TSLPR、IL-17RA或IL-17RB。
TSLP、IL-25、TSLPR、IL-17RA和IL-17RB结合抗体可使用本文所述的方法生成，诸如用相对应的蛋白质或该蛋白质的胞外域或使用如本文所述的噬菌体展示文库，免疫接种表达人免疫球蛋白基因座的小鼠(Lonberg等人，Nature 368：856-9，1994；Fishwild等人，Nature Biotechnology 14：845-51，1996；Mendez等人，Nature Genetics 15：146-56，1997；美国专利5,770,429、7,041,870和5,939,598)或Balb/c小鼠。或者，可使用TSLP、IL-25、TSLPR、IL-17RA和IL-17RB的现有抗体产生双特异性分子。可使用的示例性IL-25抗体是在例如国际专利公开WO2011/123507中所述的那些抗体。
关节炎(包括骨关节炎、类风湿性关节炎、由损伤引起的关节炎的关节等)是可受益于抗炎性蛋白诸如本发明的拮抗剂的治疗性用途的常见炎 性病症。ST2L信号传导的活化可在发炎关节中维持炎症和进一步的组织损伤。多种类风湿性关节炎的动物模型是已知的。例如，在胶原诱导的关节炎(CIA)模型中，小鼠发展出了与人风湿性关节炎高度相似的慢性炎性关节炎。ST2L缺陷(ST2KO)小鼠在该模型中所发展的疾病轻微，且在该模型中的病变依赖于肥大细胞的ST2L表达(Xu等人，PNAS 105：10913-8，2008)。在该模型中，ST2KO小鼠关节内的单核细胞和多形核细胞的浸润以及滑膜增生减少。与胶原(CII)共培养的ST2KO小鼠引流淋巴结，显示出明显减少的IL-17、IFNγ和TNFα产生。在诱导CIA之前过继转移野生型(WT)骨髓源性肥大细胞(BMMC)的ST2L缺陷小鼠，与这些移植ST2KOBMMC的小鼠相比，发展出更严重的CIA。因此肥大细胞的ST2L信号传导，在类似人类风湿性关节炎的小鼠模型中，对关节炎的发展很关键。将本发明的ST2L抗体(其抑制肥大细胞响应)施用给CIA模型小鼠，可用于评估这些拮抗剂改善症状并改变病程的用途。
示例性胃肠炎性病症是炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎(UC)和克隆氏病(CD)、环境损害诱导的结肠炎(例如，治疗方案诸如施用化学疗法、放射治疗等导致的或相关的(例如作为副作用)胃肠炎症(例如，结肠炎))、感染性结肠炎、缺血性结肠炎、胶原性或淋巴性结肠炎、坏死性小肠结肠炎、诸如慢性肉芽肿疾病或腹腔疾病这样的病症下的结肠炎、食品过敏、胃炎、感染性胃炎或小肠结肠炎(例如，幽门螺旋菌(Helicobacter pylori)感染性慢性活动性胃炎)以及由于感染物导致的其它形式的胃肠炎症。存在若干针对胃肠炎性病症的动物模型。某些最广泛使用的模型是2，4，6-三硝基苯磺酸/乙醇(TNBS)诱导的结肠炎模型或唑酮模型，其在结肠中诱导了慢性炎症和溃疡(Neurath等人，Intern Rev Immunol 19：51-62，2000)。另一模型使用了硫酸葡聚糖钠(DSS)，其诱导了急性结肠炎，表现为血性腹泻、体重减轻、结肠缩短和具有中性粒细胞浸润的粘膜溃疡。另一模型涉及初始CD45RB高CD4T细胞向RAG或SCID小鼠的过继转移。在该模型中，供体初始T细胞攻击接受者肠，造成慢性肠炎症和类似于人炎性肠病的症状(Read和Powrie，Curr Protoc Immunol，第15章，第15.13单元，2001)。本发明的拮抗剂在这些模型中任一者的施用可用于评估这些拮抗剂改善症状和改变与肠炎症诸如炎性肠病相关的病程的潜在效能。
肾纤维化可发展自急性损害诸如移植物缺血/再灌注(Freese等人，Nephrol Dial Transplant 16：2401-6，2001)或慢性病症诸如糖尿病(Ritz等人，Nephrol Dial Transplant 11Suppl 9：38-44，1996)。致病机制通常特征在于初始炎性响应，之后是肾小球过滤器和肾小管间质的持续性纤维发生(Liu，Kidney Int 69：213-7，2006)。肾小管间质纤维化已表明在肾损伤到末期肾衰竭的致病机制中起关键作用，且近端小管细胞已证实为中心介质(Phillips 和Steadman，Histol Histopathol 17：247-52，2002；Phillips，Chang Gung Med J30：2-6，2007)。肾小管间质区室中的纤维发生部分由常驻成纤维细胞的活化所介导，该成纤维细胞分泌促炎性细胞因子，刺激近端小管上皮细胞分泌局部炎性介质和纤维发生介质。另外，趋化性细胞因子由成纤维细胞和上皮细胞分泌，并提供方向性梯度，引导单核细胞/巨噬细胞和T细胞浸润到肾小管间质中。炎性浸润产生另外的纤维发生细胞因子和炎性细胞因子，其进一步活化成纤维细胞和上皮细胞性细胞因子释放，同时也刺激上皮细胞进行表型转化，其中该细胞沉积过量的胞外基质组分(Simonson，Kidney Int 71：846-54，2007)。
其他示例性的纤维化病症可包括肝纤维化(包括但不限于酒精诱导的硬化症、病毒诱导的硬化症、自体免疫诱导的肝炎)；肺纤维化(包括但不限于硬皮病、特发性肺纤维化)；肾纤维化(包括但不限于硬皮病、糖尿病肾炎、肾小球肾炎、狼疮肾炎)；表皮纤维化(包括但不限于硬皮病、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩、烧伤)；骨髓纤维化；神经纤维瘤；纤维瘤；肠纤维化；以及外科手术导致的纤维性粘着。所述纤维化可以是器官特异性纤维化或全身纤维化。所述器官特异性纤维化可关联于肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、心脏纤维化、血管纤维化、皮肤纤维化、眼纤维化或骨髓纤维化。所述肺纤维化可关联于特发性肺纤维化、药源性肺纤维化、哮喘、结节病或慢性阻塞性肺部疾病。所述肝纤维化可关联于硬化症、血吸虫病或胆管炎。所述硬化症可以是酒精性硬化症、丙型肝炎后硬化症、原发性胆汁性肝硬化。所述胆管炎可以是硬化性胆管炎。所述肾纤维化可关联于糖尿病性肾病或狼疮肾小球硬化症。所述心脏纤维化可关联于心肌梗塞。所述血管纤维化可关联于血管成形术后的动脉再狭窄或动脉粥样硬化。所述皮肤纤维化可关联于烧伤瘢痕、增生性瘢痕、瘢痕疙瘩或肾源性纤维化皮肤病。所述眼纤维化可关联于眼后纤维化、白内障手术或 增生性玻璃体视网膜病变。所述骨髓纤维化可关联于发性骨髓纤维化或药源性骨髓纤维化。所述全身性纤维化可以是全身性硬化症或移植物抗宿主病。
可通过本发明的方法来预防或治疗的其它炎性病症和神经病变是由自体免疫疾病导致的那些。这些病症和神经病变包括多发性硬化症、系统性红斑狼疮、以及神经退化性和中枢神经系统(CNS)失调(包括阿尔茨海默病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、双相性精神障碍和肌萎缩侧索硬化症(ALS))、肝脏疾病(包括原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、非酒精脂肪肝疾病/脂肪性肝炎、纤维变性、丙型肝炎病毒(HCV)和乙型肝炎病毒(HBV)、糖尿病和胰岛素抗性)、心血管疾病(包括动脉粥样硬化、脑溢血、中风和心肌梗塞)、关节炎、类风湿性关节炎、银屑病性关节炎和青少年类风湿性关节炎(JRA)、骨质疏松、骨关节炎、胰腺炎、纤维变性、脑炎、牛皮癣、巨细胞性动脉炎、强直性脊柱炎、自体免疫肝炎、人免疫缺陷病毒(HIV)、炎性皮肤病症、移植、癌症、过敏、内分泌疾病、创伤修复、其它自体免疫疾病、气道高反应性以及细胞、病毒或朊病毒介导的感染或失调。
本发明的一个实施例是治疗或预防ST2L介导的病症的方法，其包括将治疗有效量的特异性结合人ST2L域I(SEQ ID NO：9)、阻断IL-33/ST2L相互作用、与包含SEQ ID NO：47的重链可变区(VH)和SEQ ID NO：51的轻链可变区(VL)的分离抗体竞争结合于人ST2L(SEQ ID NO：1)和/或在SEQ ID NO：1的第35-48位氨基酸残基(RCPRQGKPSYTVDW；SEQ ID NO：210)处结合人ST2L的分离的人或人适应性抗体拮抗剂向对其有需求的患者施用足以治疗或预防ST2L介导的病症的时间。
本发明的另一个实施例是抑制患者体内肥大细胞响应的方法，其包括将治疗有效量的特异性结合人ST2L域I(SEQ ID NO：9)、阻断IL-33/ST2L相互作用、与包含SEQ ID NO：47的重链可变区(VH)和SEQ ID NO：51的轻链可变区(VL)的分离抗体竞争结合于人ST2L(SEQ ID NO：1)和/或在SEQ ID NO：1的第35-48位氨基酸残基(RCPRQGKPSYTVDW；SEQ ID NO：210)处结合人ST2L的分离的人或人适应性抗体拮抗剂向对其有需求的患者施用足以抑制肥大细胞响应的时间。
本发明的另一个实施例是抑制受治疗者体内IL-33和ST2L的相互作用的方法，其包括以足以抑制IL-33和ST2L的相互作用的量向受治疗者施用特异性结合人ST2L域I(SEQ ID NO：9)、阻断IL-33/ST2L相互作用、与包含SEQ ID NO：47的重链可变区(VH)和SEQ ID NO：51的轻链可变区(VL)的分离抗体竞争结合于人ST2L(SEQ ID NO：1)和/或在SEQ ID NO：1的第35-48位氨基酸残基(RCPRQGKPSYTVDW；SEQ ID NO：210)处结合人ST2L的分离的人或人适应性抗体拮抗剂。
在另一个实施例中，ST2L介导的病症是哮喘、气道过度反应、结节病、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、特发性肺纤维化(IPF)、囊性纤维化、炎性肠病(IBD)、嗜酸细胞性食道炎、硬皮病、特应性皮炎、过敏性鼻炎、大疱性类天疱疮、慢性荨麻疹、糖尿病性肾病、类风湿性关节炎、间质性膀胱炎或移植物抗宿主病(GVHD)。
在另一个实施例中，ST2L介导的病症与肺中的炎性细胞募集、杯状细胞增生或增加的粘液分泌相关联。
在另一个实施例中，ST2L介导的病症与肥大细胞响应相关联。
在另一个实施例中，所述抑制肥大细胞响应包括用50μg/ml抗体使人脐带血源性肥大细胞释放的GM-CSF、IL-5、IL-8、IL-10或IL-13的水平抑制至少50％。
在另一个实施例中，向对其有需求的患者施用的抗体拮抗剂是特异性结合人ST2L域I(SEQ ID NO：9)、阻断IL-33/ST2L相互作用、与包含SEQ ID NO：47的重链可变区(VH)和SEQ ID NO：51的轻链可变区(VL)的分离抗体竞争结合于人ST2L(SEQ ID NO：1)和/或在SEQ ID NO：1的第35-48位氨基酸残基(RCPRQGKPSYTVDW；SEQ ID NO：210)处结合人ST2L并且还结合TSLP、IL-25、TSLPR、IL-17RA或IL-17RB的双特异性抗体。
给药/药物组合物
有效治疗其中期望调节ST2L生物活性的病症的抗-ST2L抗体的“治疗有效量”，可通过标准研究技术确定。例如，将在治疗炎性病症诸如哮喘或类风湿性关节炎中有效的抗-ST2L抗体的剂量，可通过向相关的动物模型诸如本文所述的模型中施用抗-ST2L抗体来确定。
此外，体外测定法可任选地用于辅助鉴定最佳的剂量范围。对具体的有效剂量的选择可由本领域的技术人员根据对多种因素的考量(例如，经 由临床试验)来确定。此类因素包括待治疗或预防的疾病、所涉及的症状、患者体重、患者免疫状态以及技术人员所知的其它因素。将用于制剂中的精确剂量也将取决于给药途径以及疾病严重性，并且应根据执业者的判断以及各个患者的状况来决定。有效剂量可通过来自体外或动物模型测试体系的剂量响应曲线来推导。
本发明的抗体的治疗用途的给药模式可以是将该药剂递送至宿主的任何合适的途经。这些抗体的药物组合物尤其可用于非肠道给药，例如，真皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下或鼻内给药。
本发明的抗体可制备为药物组合物，其含有有效量的药剂作为药学上可接受的载体中的活性成分。术语“载体”是指活性化合物与其一起施用的稀释剂、辅助剂、赋形剂或媒介物。此类药学媒介物可以是液体，诸如水和油，包括那些来源于石油、动物、植物的油或合成的油，诸如，花生油、大豆油、矿物油和芝麻油等等。例如，可使用0.4％盐水溶液和0.3％甘氨酸。这些溶液是无菌的，并且通常不含颗粒物。它们可通过常规的已知的灭菌技术(例如过滤)进行灭菌。组合物可根据需要含有配药学上可接受的辅助物质，以接近生理条件，诸如pH调节剂和缓冲剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂等。此类药物制剂中的本发明的抗体的浓度可广泛改变，即小于约0.5％，通常为或至少约1％到多达15或20重量％，且将根据所选择的具体给药方式，主要基于所需剂量、流体体积、粘度等进行选择。
因此，本发明的用于肌内注射的药物组合物可经制备以包含1ml的无菌缓冲水，以及介于约1ng至约100mg的本发明的抗-ST2L抗体，例如，约50ng至约30mg，或更优选地约5mg至约25mg。相似地，本发明的用于静脉内输注的药物组合物可经制备以包含约250ml的无菌林格氏溶液，以及约1mg至约30mg并且优选地5mg至约25mg的本发明的拮抗剂。用于制备非肠道给药的组合物的实际方法是众所周知的，且更详细地描述在，例如，“Remington′s Pharmaceutical Science”，第15版，Mack Publishing Company，Easton，PA中。
可将本发明的抗体低压冻干用于贮存，并在使用前在合适的载体中重构。已证实此技术对常规免疫球蛋白和蛋白制备有效，并且可以采用本领域已知的冻干法和复构技术。
本发明现结合以下具体的、非限制性实例进行描述。
材料和方法(一般)
人和食蟹猕猴(Macaca fascicularis，cyno)受体-配体结合抑制测定(RLB测定)
用50μl在碳酸氢盐缓冲液中的带有C端His6标签的4μg/ml人ST2L-ECD(SEQ ID NO：1的第19-328位氨基酸)或2μg/ml cyno ST2L-ECD(SEQ ID NO：2的第19-321位氨基酸)在4℃下涂布96孔板16小时。所有后续步骤均在室温下进行。将平板用200μl封闭缓冲液封闭，并用300μl的含有PBS+0.05％吐温的洗涤缓冲液洗涤3次。将30μl各种稀释度的抗-ST2L单克隆抗体添加到孔中并温育1小时。对于人受体-配体结合测定，以100ng/ml终浓度添加20μl的生物素酰化人IL-33(SEQ ID NO：3的第112-270位残基)并温育30分钟。对于cyno受体-配体结合测定，以200ng/ml终浓度添加20μl的生物素酰化cyno IL-33(SEQ ID NO：4的第112-269位残基)并温育30分钟。将平板用300μl的洗涤缓冲液洗涤3次。添加50μl的0.2μg/ml链霉抗生物素蛋白-HRP(Jackson Immunoresearch)并温育30分钟。将平板用300μl的含有PBS+0.05％吐温的洗涤缓冲液洗涤3次。向每孔中添加50μl的TMB底物(EMD Biosciences)。添加100μl的0.2N硫酸，使反应终止。使用Envision酶标仪(Perkin Elmer)测量OD450。
嵌合ST2L构建体的生成
使用标准分子生物学技术设计并生成特征为人和小鼠ST2L域I、II和III交换的各种构建体。所述构建体列于表1中。氨基酸编号对应于人ST2L(hST2L)(SEQ ID NO：1；NP_057316)和小鼠ST2L(mST2L)(SEQ ID NO：5；NP_001020773)蛋白质。
表1.

hST2L：人ST2L SEQ ID NO：1
mST2L：小鼠ST2L SEQ ID NO：5
域结合测定分析。
利用标准捕获ELISA测定法使用电致化学发光检测格式(Meso-Scale Discovery(MSD)技术)测定结合于ST2L域I、II和III的抗体。将10μg/mL的每种抗体在室温下涂布在MSD HighBind平板的每个孔上(5μL/孔)2小时。将平板用150μL的5％MSD封闭缓冲液在室温下封闭2小时，并用HEPES洗涤缓冲液洗涤3次，然后将25μL的经磺酸基标签标记的huST2L-ECD或小鼠ST2L-ECD(SEQ ID NO：5的第28-326位氨基酸)或HHM-ST2L(SEQ ID NO：6)或HMH-ST2L(SEQ ID NO：8)嵌合体或HH-ST2L(SEQ ID NO：1的第19-205位残基)以5nM至40nM的递增浓度添加到平板中。将平板用铝箔覆盖并在室温下温育1小时，同时轻轻摇动。然后将平板用HEPES洗涤缓冲液洗涤3次。将MSD读取缓冲液(150μl)添加到每个孔中，然后使用MSD Sector Imager 6000读取平板。
这些与人ST2L-ECD、HHM-ST2L和HMH-ST2L结合但不与小鼠ST2L-ECD结合的抗体识别人ST2L-ECD的域I。与人ST2L-ECD和HMH-ST2L结合但不与HHM-ST2L和小鼠ST2L-ECD结合的抗体识别人ST2L-ECD的域III。与人和小鼠ST2L-ECD结合但不与HH-ST2L结合的抗体识别人和小鼠的ST2L-ECD的域III。
抗-ST2L单克隆抗体的亲和力测量。
使用标准方法表达抗-ST2L单克隆抗体、huST2L-ECD和cynoST2L-ECD。山羊抗-人IgG Fcγ片段特异性抗体(目录号109-005-098)可购自Jackson ImmunoResearch laboratories(West Grove，PA)。GLC传感器芯片(Bio-Rad目录号176-5011)、CM-5传感器芯片(GE Healthcare目录号BR100014)以及用于制备捕获表面的试剂可购自Biacore(GE healthcare，Piscataway，NJ)或购自Bio-Rad Life Sciences(Bio-Rad，Hercules，CA)。
抗-ST2L抗体与带His6标签的人ST2L-ECD和带His6标签的cyno ST2L-ECD的相互作用由ProteOn使用ProteOn XPR36在25℃下研究。使用胺偶联化学的制造商说明书，通过将山羊抗-人IgG Fcγ片段特异性抗体(Ab)偶联到GLC传感器芯片的表面，来制备生物传感器表面。偶联缓冲液是10mM乙酸钠，pH4.5。将山羊抗-人IgG Fcγ(约4500个响应单元)以 水平取向固定。抗ST2L抗体以经纯化的或粗上清液的形式提供。在任一种情况下，将这些抗体在PRB(PBS pH74，补充有3mM EDTA和0.005％吐温20)中稀释到约0.5μg/mL的浓度。抗体以竖直取向捕获(60-130RU)在抗-人Fcγ抗体修饰的GLC芯片上。抗-ST2L单克隆抗体捕获之后，以水平取向注射溶液形式的huST2L ECD(0.024至15nM，5倍稀释度)或溶液形式的cynoST2L ECD(0.020-5nM，4倍稀释度)。在所有实验中监测缔合4分钟(以50μL/min注射200μL)。监测解离30分钟。用10mM甘氨酸(pH 1.5)的三次15秒脉冲获得该传感器表面的再生。使用ProteOn软件并使用具有质量传递的1∶1结合模型来拟合数据。
Biacore实验使用Biacore 2000或Biacore 3000光学生物传感器(Biacore AB)进行。所有实验均在25℃下在具有或不具有0.1％BSA的情况下在BRB(PBS pH 7.4，补充有3mM EDTA和0.005％吐温20)中操作。
使用胺偶联化学的制造商说明书，通过将山羊抗-人IgG Fcγ片段特异性抗体偶联到CM-5芯片的羧甲基化葡聚糖表面，来制备Biacore生物反应器表面。偶联缓冲液是10mM乙酸钠，pH4.5。将抗体的平均6000个响应单元(RU)固定在四个流通池的每个中。抗-ST2L单克隆抗体捕获(约33RU)于抗-人Fcγ抗体修饰的传感器芯片表面上。抗-ST2L单克隆抗体捕获之后，注射溶液形式的huST2L ECD(0.2至15nM，3倍稀释度)或溶液形式的cynoST2L ECD(0.2至15nM或0.020-5nM，3倍稀释度)。监测缔合4分钟或8分钟(对于C2521和C2519，以50μl/min或20μL/min注射200μL)。监测解离10分钟或至多2.5小时。通过注射50mM NaOH和/或注射100mM H3PO4获得传感器表面的再生。
使用Scrubber软件版本1.1g(BioLogic Software)处理数据。数据的双参比差减通过如下方式进行：从分析物注射的参比扣减曲线减去由缓冲液注射产生的曲线以校正缓冲液对信号与仪器噪声的贡献(Myszka，Journal of Mol Recogn 12：279-84，1999)。
数据处理后，针对动力学和亲和力测定所生成的数据使用Scrubber软件或BIAevaluation软件版本4.0.1(Biacore，AB)分析。动力学数据使用简单1∶1结合模型(包括质量传递的项)分析。
抗-小鼠ST2L mAb(C1999/CNTO3914)对鼠ST2L ECD的亲和力测量。
使用标准方法表达和纯化抗-ST2LmAb(C1999/CNTO3914)和鼠ST2L胞外域(muST2L-ECD)。抗-鼠IgG Fcγ片段特异性抗体可购自Jackson ImmunoResearch laboratories(West Grove，PA)。传感器芯片和用于制备捕获表面的试剂可购自Biacore(GE healthcare，Piscataway，NJ)。实验的Biacore电泳缓冲液(BRB)包含加有0.005％吐温20和0.1mg/mL BSA的PBS pH7.4，并在25℃下收集数据。
在Biacore2000上在25℃下研究抗-ST2L抗体与muST2L-ECD的相互作用。使用胺偶联化学的制造商说明书，通过将抗-小鼠-Fc特异性抗体偶联到CM4传感器芯片的表面，来制备生物传感器表面。将C1999/CNTO3914和muST2L-ECD稀释于BRB中。使用抗-小鼠Fcγ抗体(约85RU)捕获C1999。捕获之后，注射溶液形式(以15nM开始，5个浓度，3倍系列稀释度)的muST2L ECD(SEQ ID NO：5的第28-326位残基)。监测缔合8分钟。监测解离最多至6000秒。使用1/100稀释度的磷酸进行再生。数据使用1∶1结合模型进行拟合。
人嗜碱性粒细胞系测定(嗜碱性粒细胞细胞因子释放测定)
将KU812细胞(人嗜碱性粒细胞系；ATCC，CRL-2099)以25,000或50,000细胞/孔接种于无菌96孔U形底组织培养板中总共40μl的补充有10％FBS和青霉素/链霉素的RPMI 1640生长培养基(Invitrogen)中。以各种浓度(50μl/孔)添加抗-人ST2L单克隆抗体和对照，并在37℃下温育。在温育1小时后，将重组“成熟”IL-33(SEQ ID NO：3的第111-270位氨基酸)以10ng/ml的终浓度添加到10μl RPMI生长培养基中。然后将细胞在37℃下温育18-24小时，以允许IL-33介导的IL-5和IL-6诱导。温育之后，收获细胞并收集细胞上清液以用于使用ELISA(R&D systems)或基于小珠的多重分析(Millipore)进行iL-33诱导的IL-5和IL-6的后续检测。
人肥大细胞细胞因子释放测定和PGD2释放测定
肥大细胞来源于CD34+人脐带血细胞(Lonza)。将＞1.0×106CD34+脐带血细胞的冷冻小瓶快速解冻并转移至50ml锥形管。将数滴温热或室温Stem-Pro 34培养基+补充物(总共25ml；Invitrogen)缓慢添加到细胞。将细胞在1,000rpm下离心15分钟，并重悬于培养基(10ml的StemPro-34，含如下补充物：30ng/ml IL-3、100ng/ml IL-6和100ng/ml SCF。将细胞接种于6孔板的2个孔中，并培养1周。在第4天，使细胞以1∶3在补充的 Stem Pro-34培养基中扩增。在第7天，移除非贴壁细胞，并以0.5×106/ml接种于包含10ng/ml IL-6和100ng/ml SCF的StemPro-34培养基中。细胞每周扩增以保持0.5×106/ml的细胞密度直到肥大细胞在6-10周成熟(通过FcεR1、cKit和类胰蛋白酶的表达来评估)。
将成熟肥大细胞以0.5×106/ml培养于StemPro-34中，并每天在IL-4(10ng/ml；Peprotech)、IL-6(10ng/ml；R&D Systems)和SCF(100ng/ml；Invitrogen)中刺激，持续4天。在测定之前，将细胞收获，在1,000RPM下离心10分钟，并重悬于新鲜StemPro-34培养基或包含10％FCS的RPMI(不含抗生素，含有100ng/ml人重组SCF)中。将细胞以65,000至75,000细胞/0.16ml/孔的密度接种于平底的组织培养处理的96孔板中。在添加IL-33之前30分钟，将抗-ST2L单克隆抗体添加到平板至终浓度为50、10、2、0.4、0.08、0.016、0.0032μg/ml。还在培养基+100ng/ml SCF中制备10X(10或30ng/ml)的重组人“成熟”IL-33(SEQ ID NO：3的第111-270位残基)。将20μl的10X IL-33添加到孔中至终浓度为1(图6和7A-7E)或3ng/ml(图8A-8E)，并将平板在37℃、5％CO2下温育过夜。在刺激后18-24小时，收获培养上层清液。将平板在1,000RPM下离心10分钟。去除上清液，置于U形底96孔板中，并在测定之前保存在-20℃下。使用得自Millipore的人细胞因子试剂盒，利用LuminexTM技术分析细胞因子水平。使用得自Cayman Chemical Company的前列腺素D2-MOX EIA试剂盒，根据制造商说明书测量PGD2的水平。为了增强ELISA的灵敏度，将肥大细胞培养上层清液中的PGD2通过用甲氧胺盐酸盐(MOX-HCl)处理，转化为不可降解的MOX-PGD2(甲氧胺-PGD2)。
小鼠受体-配体结合抑制测定(小鼠RLB测定)
将96孔透明板(VWR)用50μl的2μg/ml山羊抗-人IgG，Fcγ片段特异性(Jackson Immunoresearch)抗体在4℃下涂布约16小时。其余步骤在室温下完成。将孔用封闭缓冲液温育、洗涤并添加50μl的2μg/ml与人Fc融合的小鼠ST2L-ECD，持续1小时。洗涤平板，并添加1μg/ml的具有或不具有抗-mST2L抗体的生物素酰化mIL-33。洗涤平板，用链霉抗生物素蛋白-HRP(Jackson Immune Research)完成检测，并根据制造商说明书用TMB底物(Fitzgerald Industries的RDI分部)显色信号。
小鼠和人报道基因测定(人或小鼠RGA测定)
将HEK293细胞以50,000细胞/孔接种于白色透明底部的组织培养处理的96孔板(NUNC)中的DMEM，10％FBS，并在37℃、5％CO2下在潮湿培养箱中温育24小时。使用Opti-MEM培养基(Invitrogen)中的LipofectamineTM2000，利用标准方案，将细胞用编码人或小鼠ST2L-ECD cDNA的载体、NF-κB-荧光素酶载体(Stratagene，Agilent Technologies，Santa Clara，CA)共转染。在37℃、5％CO2下温育24小时后，在具有或不具有抗-ST2L抗体的情况下，将转染的细胞用小鼠(R&D Systems，SEQ ID NO：5的第109-266位残基)或人IL-33(SEQ ID NO：3的第112-270位残基)在37℃、5％CO2下处理16小时。使用试剂(Promega)根据制造商说明书测量荧光素酶活性。
小鼠T细胞增殖测定
将小鼠Th2细胞(D10.G4.1，ATCC)培养于完全生长培养基：具有2mML-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基经调整以包含1.5g/L碳酸氢钠、4.5g/L葡萄糖、10mM HEPES和1.0mM丙酮酸钠，并补充有：0.05mM 2-巯基乙醇、10pg/ml IL-1α(R&D Systems)、10％胎牛血清、含Con A的10％大鼠T-STIM因子(可得自Becton Dickinson的大鼠IL-2培养补充物)。将细胞用测定培养基(RPMI，10％FBS，无IL-1，无T-STIM)洗涤两次，以1.25x105细胞/ml重悬并接种于白色透明底部的组织培养处理的96孔板(NUNC，Rochester，NY)中80μl的培养基中。将各种量的小鼠IL-33(SEQ ID NO：5的第109-266位残基)添加到细胞中至最终测定体积为100μl。当测试抗体中和时，将对照抗体(加入用过的杂交瘤培养基)或杂交瘤上清液添加到细胞中并温育1小时，然后添加20pg/ml mIL-33。将平板在37℃、5％CO2下在潮湿培养箱中培养24小时。使用试剂(Promega，Madison，WI)实现活细胞的定量；方案根据制造商说明书进行。
小鼠骨髓源性肥大细胞测定
小鼠肥大细胞来源于Balb/c小鼠(6周)的骨髓。将细胞以300,000细胞/孔接种于RPMI培养基(不含内毒素)、10％FBS、10％WEHI细胞系条件培养基、10ng/ml IL-3(Peprotech)、0.1mM必需氨基酸、1％青霉素/链霉素(Invitrogen)中。将抗-ST2L单克隆抗体(100、10、1、0.1或0.01μg/ml)与细胞温育1小时，之后添加重组小鼠“成熟”IL-33(SEQ ID NO：215的第109-266位残基(10ng/ml；R&D Systems)。在约24h时后， 收获上清液并冻存，直到使用LuminexTM的Millipore小鼠22-plex试剂盒根据制造商说明书进行分析。
Cyno内皮细胞测定
将培养于内皮细胞生长培养基-2(Lonza)中的食蟹猕猴主动脉内皮细胞以10,000或20,000细胞/孔接种于96孔组织培养板。将50μl的抗-ST2L抗体添加到细胞中，开始为100μg/ml而后续为4或5倍稀释度，并在37℃下温育1小时，之后添加重组cyno“成熟”IL-33(SEQ ID NO：4)。然后将五十微升的20ng/ml食蟹猕猴IL-33添加到细胞中，并在37℃下温育24小时。为评估IL-33诱导的细胞因子响应，收获上清液，并通过LuminexTM的非人灵长类IL-8试剂盒(Millipore)根据制造商说明书评估细胞因子水平。
小鼠腹膜灌洗测定
将6只Balb/c小鼠的腹膜用总共3ml PBS洗涤以收集腹膜细胞。已发现这些细胞中的大多数为淋巴细胞和巨噬细胞，如通过B220和F4/80表达(FACS分析)确定的。约1％为cKit+(CD117+)肥大细胞。将细胞离心，并将沉淀物重悬于Alpha MEM培养基+10％FBS+100U/ml青霉素+100μg/ml链霉素(Invitrogen)中达到1×106细胞/ml。将细胞以200μl/孔接种于96孔板中，并在37℃下静置2h。将抗-ST2L单克隆抗体添加到细胞中30分钟，之后添加10ng/ml小鼠“成熟”IL-33(R&D Systems；SEQ ID NO：215的第109-266位残基)。在IL-33添加后24h收集上清液，保存在-20℃下直到分析，然后使用LuminexTM的Millipore小鼠22-plex试剂盒根据制造商说明书进行分析。
实例1：大鼠抗-小鼠ST2L抗体的生成
用小鼠ST2-Fc(R&D Systems(SEQ ID NO：5的Ser27-Ser342)经腹膜内使大鼠免疫，并评估特异性IgG效价。一旦获得足够的效价，分离脾细胞并与FO细胞融合。将所得的杂交瘤接种于96孔板或甲基纤维素中并培养10天。通过标准捕获ELISA鉴别结合于mST2-Fc的抗原特异性克隆，并对单独的Fc蛋白质交叉筛选。鼠ST2特异性杂交瘤进一步在ELISA中测试对IL-33结合于ST2的抑制，以及测试对IL-33诱导的D10.G4.1小鼠Th2细胞增殖的抑制。通过限制稀释以克隆方式选择在受体-配体结合与基于细胞的增殖测定两者中表现出中和作用的杂交瘤。对杂交瘤V区进行 测序并克隆到小鼠IgG1背景中。ST2L-ECD域特异性通过标准免疫吸附测定以电致化学发光检测使用各种人-小鼠域交换构建体来处理。
将杂交瘤C1999分泌的抗体克隆到小鼠IgG1背景中并命名为CNTO3914。CNTO3914可变区和CDR的序列示于表2中。CNTO3914不与人ST2L交叉反应并且结合小鼠ST2L-ECD的域I。
表2.

实例2：小鼠抗-人ST2L抗体的生成
进行两种不同的免疫法以生成小鼠抗-人ST2单克隆抗体。
用可溶性ST2-Fc(R&D Systems，SEQ ID NO：157)经腹膜内使BALB/c免疫，并评估特异性IgG效价。一旦获得足够的效价，分离脾细胞并与FO细胞融合。将所得的杂交瘤接种于96孔板中并培养10天。通过标准捕获ELISA鉴别与C端带His6标签的huST2L-ECD结合并与带His6标签的cyno ST2L-ECD交叉反应的抗原特异性克隆。与cyno ST2L交叉反应的人ST2L特异性杂交瘤进一步在ELISA测定中测试对IL-33结合于huST2L的抑制， 以及在报道基因测定中测试对NF-κB活化的抑制。选择报道基因测定中或者ELISA和报道基因测定两者中抑制的克隆供进一步研究。
选择来自杂交瘤C2494、C2519A和C2521A的抗体供进一步分析。C2519A和C2521A与人ST2L结合于域III，并且C2494与人ST2L结合于域I。抗体C2494被克隆到人IgG2背景中，并且全长抗体被命名为STLM62。
在Genovac Gmbh通过专有DNA免疫技术，使用全长ST2L构建体并用被转染以表达人ST2L-ECD的细胞加强免疫来生成抗-人ST2L单克隆抗体。通过流式细胞术筛选与人ST2L-ECD结合的杂交瘤。证实在该测定中呈现结合的克隆与hST2L-ECD结合，并进一步通过标准捕获ELISA表征与cyno ST2L-ECD的结合。所选克隆在受体-配体结合抑制ELISA和报道基因测定中进行表征。选择报道基因测定中或者ELISA和报道基因测定两者中抑制的克隆供进一步研究。
选择来自Genovac杂交瘤C2244的抗体供进一步分析并克隆到人IgG2背景中。全长抗体被命名为STLM15。STLM15与人ST2L结合于域I。
小鼠抗-人抗体的VH、VL和CDR域的序列示于表3中。
表3.

实例3：完全人ST2L抗体的生成
人ST2L结合Fab选自从头合成pIX噬菌体展示文库，如Shi等人，J Mol Biol 397：385-96，2010；国际专利公开WO2009/085462；美国专利公开US2010/0021477)所述。简而言之，通过多样化人支架生成文库，其中种系VH基因IGHV1-69*01、IGHV3-23*01和IGHV5-51*01与人IGHJ-4微小基因经由H3环重组，并且人种系VLkappa基因O12(IGKV1-39*01)、L6(IGKV3-11*01)、A27(IGKV3-20*01)和B3(IGKV4-1*01)与IGKJ-1微小基因重组以组装完整VH域和VL域。选择在围绕H1、H2、L1、L2和L3环的重链和轻链可变区中的位置用于多样化，所述位置与被鉴别为经常与蛋白和肽抗原接触的位置相对应。在选定位置处的序列多样性限于在各个IGHV或IGLV基因的IGHV或IGLV种系基因家族中的每个位置处出现的残基。通过使用长度为7-14个氨基酸的短至中等大小的合成环，产生在H3环处的多样性。设计在H3处的氨基酸分布，以模仿在人抗体中观察到的氨基酸变异。文库设计详述于Shi等人，J Mol Biol 397：385-96，2010。根据它们的人VH和VL种系基因起源，命名用于生成文库的支架。将3个重链文库与4个种系轻链或种系轻链文库相组合，以产生24个独特的VH：VL组合用于筛选。所有24个VH：VL文库组合均用于对huST2L-ECD-Fc的噬菌体淘选实验。
使用huST2L-ECD(SEQ ID NO：1的第19-328位残基)的Fc融合淘选文库。以2种不同格式即溶液形式的抗原(Ag)以及展示的Ag完成淘选。对于溶液形式的Ag，将涂布链霉抗生物素蛋白的磁珠在含3％脱脂奶粉的PBS中封闭。将具有10x较高浓度的人Fc蛋白质的生物素酰化(Bt)抗原huST2L-ECD人Fc融合(Bt-huST2L-ECD-Fc)作为竞争者与Fab-pIX噬菌体文库混合。将结合于Bt-huST2L-ECD-Fc的Fab-pIX噬菌体捕获于封闭的链霉抗生物素蛋白(SA)涂布的磁珠上。进行三轮噬菌体选择，其中huST2L-ECD-Fc浓度从第1轮至第3轮分别改变为100nM、10nM、10nM。对于Ag展示，将Bt-huST2L-ECD-Fc涂布于经SA涂布的磁珠上。同时将Fab-pIX噬菌体文库及10x过量的人Fc蛋白质添加到Bt-huST2L-ECD-Fc展示的SA磁珠。第1轮至第3轮所使用的Bt-Ag浓度分别为100nM、10nM、10nM。两种淘选格式均通过ELISA使Fab结合于huST2L-ECD-Fc蛋白质来完成筛选。由这些选择分离出总共79个结合于hST2L-Fc的Fab。通过排序ELISA(ranking ELISA)测定具有整体最佳结合活性的Fab HuT2SU-39。
对79个Fab进行基于ELISA的IL-33结合抑制测定。总共32个Fab显示抑制IL-33结合于huST2L-ECD-Fc。从pIX从头合成筛选(pIX de novo campaign)选择46个Fab用于亲和力成熟。
实例4：完全人ST2L抗体的亲和力成熟
所选抗体使用Shi等人，J Mol Biol 397：385-96，2010和WO09085462A1中所述的“同步”成熟过程进行亲和力成熟。在该技术中，将在第一选择中获得的Fab克隆的VH区与对应的VL支架的文库组合。将来自实例3所鉴别的46个Fab的所有VH基因克隆到适当的VL成熟文库作为根据其初始VL基因家族的库。使用的VL支架文库及其多样化方案示于表4中。人VL支架如下：IGKV1-39*01(O12)、IGKV3-11(L6)、IGKV3-20(A27)、IGKV4-1*01(B3)，并且描述于例如美国专利公开US2012/0108795中。对于亲和力成熟淘选，先将噬菌体文库添加到Bt-huST2-ECD-Fc。温育后，将成熟文库噬菌体/Bt-hST2L-ECD-Fc复合物添加到SA涂布的磁珠。Bt-huST2-Fc浓度从R1至R3分别改变为10nM、1nM和0.1nM。在10nM未标记的huST2L-ECD-Fc存在下，在室温下过夜进行第3轮的最后洗涤以进一步促进亲和力改善。
表4.

由成熟淘选获得总共161个序列独特的Fab。将表现出与huST2L-ECD最高结合的Fab转换成IgG用于进一步表征。
选择单克隆抗体ST2M48、ST2M49、ST2M50和ST2M51用于进一步表征，并且其VH、VL和CDR序列示于表5中。单克隆抗体ST2M48、ST2M49、ST2M50和ST2M51与人ST2L结合于域III，并且与小鼠ST2L交叉反应。
表5.

实例5：抗-ST2L抗体的表征。
来源于上述各种筛选(campaign)的抗体进一步对于其阻断IL-33/ST2L相互作用的能力、其抑制如NF-κB报道基因测定所测量的IL-33诱导的信号传导、抗体抑制肥大细胞响应的能力、其对人和cyno ST2L的亲和力以 及与小鼠ST2L的交叉反应进行表征。使用如“材料与方法”中所述的人/小鼠ST2L域交换嵌合构建体完成表位作图。实验的结果示于表6、7和8中。在表7和8中，“+”指示抗体阻断IL-33/ST2L相互作用，并且“-“指示其不会阻断IL-33/ST2L相互作用。由于缺乏对人的交叉反应性，使用小鼠细胞和试剂完成CNTO3914的实验。所有其他抗体的测定中则使用人细胞和人试剂。
表征的抗体被分组为阻断IL-33/ST2L相互作用的抗体(单克隆抗体STLM15、STLM62和CNTO3914)和不会阻断IL-33/ST2L相互作用的抗体(单克隆抗体C2519、C2521、ST2M48、ST2M49、ST2M50和ST2M51)。阻断IL-33/ST2L相互作用的抗体结合于ST2L域I，而非阻断抗体结合于ST2L域III。所测试的抗体抑制ST2L下游信号传导，如通过NF-κB报道基因测定和IL-33诱导的KU812人嗜碱性粒细胞系释放细胞因子所评估，或在CNTO3914的情况下，由小鼠Th2细胞增殖所评估。如通过细胞因子与趋化因子分泌所评估，当与结合ST2L域III的抗-ST2L抗体相比时，结合于ST2L域I的抗体在较高水平抑制人肥大细胞响应。结合小鼠ST2L域I并且不会与人交叉反应的CNTO3914也能够抑制IL-33诱导的小鼠肥大细胞响应。
表6.

表7.

*受体-配体结合抑制
#报道基因测定
hD1＝人ST2L D1域
mD1＝小鼠ST2L D1域
hD3-人ST2L D3域
h/mD3＝人和小鼠ST2L D1和D3域
nt＝未测试
表8.

*受体-配体结合抑制
#报道基因测定
**骨髓源性
实例7：ST2L域I结合抗体CNTO3914会抑制鼻内IL-33诱导的气道过度响应(AHR)、气道炎症和小鼠肥大细胞响应。
向雌性BALB/c小鼠施用四天连续的2μg/小鼠“成熟”IL-33(R&D Systems)(SEQ ID NO：215的第109-266位残基)的鼻内剂量。在首次IL-33鼻内施用前24小时，抗-小鼠ST2L抗体CNTO3914以20mg/kg(或 2mg/kg或0.2mg/kg)经皮下注射预防性给予。对照小鼠则在首次IL-33经鼻内施用前24小时接受同种型对照CNTO5516或PBS。使用以Flexivent系统(Scireq，Montreal，Quebec，Canada)进行的强制操纵测量对递增乙酰甲胆碱剂量的气道过度响应(AHR)。为测量气道过度响应(AHR)，将小鼠用100mg/kg戊巴比妥与13mg/kg苯妥英麻醉并在连接至FlexiVent前切开气管。用盐水喷雾小鼠以得出基线读数，接着用两种剂量(10和20mg/mL)的乙酰甲胆碱喷雾。对于盐水和每种乙酰甲胆碱剂量，使用“快照”扰动收集阻力(R)值约2分钟。仅使用COD(决定系数)0.9以上的这些值计算阻力峰值。
处理单独组的小鼠并分析肺中细胞响应。最后mIL-33同种型或PBS施用二十四小时后，通过过量的I.P.处死小鼠。将小鼠的肺用0.7ml的含0.1％BSA的冷PBS灌洗。将产生的支气管肺泡(BAL)液体以1200rpm离心10分钟，并将无细胞上清液保存在-80℃直到分析细胞因子/趋化因子。BAL样品用于使用血球计进行总计数。对于分类BAL计数，用瑞氏吉姆萨(wright giemsa)染色后在光学显微镜下从细胞离心涂片(cytospin smear)计数约200个细胞。
收集无细胞上清液并保存在-80℃直到用于Luminex蛋白质分析。去除肺组织，接着使用5ml冷的无菌PBS经右心室灌注直到适当的灌注量。然后将肺叶置于含1ml的PBS+蛋白酶抑制剂的Fast试管中，并冻存于-80℃用于细胞因子/趋化因子表达谱。细胞因子/趋化因子多重分析按照鼠Millipore 22-plex的制造商方案进行。BAL液中的小鼠肥大细胞蛋白酶-1(mMCP-1)通过ELISA(Moredun Scientific)来分析。
气道过度响应
在通过鼻内施用IL-33所诱导的肺炎症模型中，CNTO3914显著抑制气道过度响应(图1)。在四天连续鼻内施用2μg/小鼠mIL-33之前24小时，经皮下给予CNTO3914。如通过Flexivent所测定的气道阻力峰值在20mg/kg的CNTO3914剂量时显著降低。每个误差条代表每组三(CNTO5516，同种型对照抗体)至六只小鼠的平均值±SEM。这些结果已在两个单独的研究中重复。使用双因数方差分析与Bonferroni事后检验测定显著性，CNTO3914/IL-33相对于CNTO5516/IL-33，**p＜0.05；以及相对于经IL-33处理的PBS组，***p＜0.001。
气道炎症
在使用的模型中，CNTO3914显著地抑制支气管肺泡灌洗(BAL)细胞募集(图2)。在四天连续鼻内施用2mg/小鼠mIL-33之前24小时，经皮下给予CNTO3914。BAL白细胞随IL-33施用而显著增加，并且被20mg/kg的CNTO3914显著抑制。每个误差条代表每组三(CNTO5516，同种型对照抗体)至六只小鼠的平均值±SEM。这些结果已在两个单独的研究中重复。使用双因素方差分析与Bonferroni事后检验测定显著性，***p＜0.001。
体内肥大细胞响应
肥大细胞将蛋白酶(包括类胰蛋白酶与糜酶)储存在其颗粒中，这些颗粒在肥大细胞活化后快速释放。小鼠肥大细胞蛋白酶1(mMCP-1)为一种由活化的肥大细胞所释放的β糜酶，并且已知对寄生虫感染的控制很重要(Knight等人，J Exp Med 192：1849-56，2000；Huntley等人，Parasite Immunol 12：85-95，1990)。mMCP-1的测量可用作肥大细胞活化的标记，并且已表明可在气道炎症的肥大细胞依赖性模型中被诱导：屋尘螨(Yu和Chen，J Immunol 171：3808-15，2003)。如通过ELISA(Moredun Scientific)所测定的MMCP-1在来自IL-33施用的小鼠的BAL液中显著增加，并且被CNTO3914剂量依赖性抑制(图3)。使用单因数方差分析与Tukey事后检验测定显著性，相对于IL-33处理，**p＜0.01，***p＜0.001。
实例8：抗-ST2L域I结合抗体抑制体外肥大细胞响应
通过小鼠和人肥大细胞释放的趋化因子和细胞因子以及人肥大细胞中的前列腺素D2来评估肥大细胞响应。
抗-ST2L域I结合抗体CNTO3914抑制IL-33诱导的小鼠骨髓源性肥大细胞释放细胞因子，包括GM-CSF(图4A)、IL-5(图4B)和TNFα(图4C)。
在抗体浓度2、10和50μg/ml下，抗-人ST2L域I结合单克隆抗体C2494(STLM62)抑制通过3ng/ml IL-33诱导的人脐带血源性肥大细胞的IL-33诱导的PGD2释放(图5)。
在抗体浓度50μg/ml、10μg/ml和2μg/ml下，抗-ST2L域I结合抗体C2494和C2244抑制IL-33诱导的人脐带血源性肥大细胞释放GM-CSF、IL-5、IL-8、IL-13和IL-10(图6和8A-8E)。抑制的程度取决于所测量的细胞因子/趋化因子、所测试的抗体和抗体浓度以及所使用的培养基。在抗 体浓度2μg/ml下进行的所有测定中所计算的平均抑制百分比(％)介于50.6-100％之间，并且在50μg/ml的抗体浓度下介于62-100％之间(图9)。
在抗体浓度50μg/ml和10μg/ml下，抗-ST2L域III结合抗体C2521、C2519、ST2M48、ST2M49、ST2M50和ST2M51表现出对IL-33诱导的肥大细胞释放细胞因子的轻微抑制或无抑制，或刺激IL-33诱导的肥大细胞释放细胞因子(图7A-7E和8A-8E)。抑制的程度取决于所测量的细胞因子/趋化因子、所测试的抗体以及所使用的培养基。在抗体浓度2μg/ml下进行的所有测定中所计算的平均抑制百分比(％)介于-594.4-31.9％之间，并且在50μg/ml的抗体浓度下介于-481.5-36％之间(图9)。在一些测定中，在抗体浓度10μg/ml下，抗体ST2M50抑制GM-CSF、IL-5、IL-10和IL-13分泌(图8A-8E)。
使用下式计算平均抑制％：(1-(在单克隆抗体存在下释放的细胞因子的浓度)/(在单克隆抗体不存在下响应IL-33所释放的相同细胞因子的浓度))×100。细胞因子浓度以pg/ml计。在一些情况中，抑制％为负值，表示在单克隆抗体存在下细胞因子释放实际上高于在单克隆抗体不存在下所释放的。单克隆抗体的效力可能出现细微变化，具体取决于诱导肥大细胞中细胞因子释放所用的IL-33浓度。相似地，单克隆抗体的活性可能有细微变化，具体取决于所用的测定培养基(StemPro-34与RPMI/10％FCS)。在2μg/ml、10μg/ml或50μg/ml的浓度下，所有测试的ST2L域I结合抗体使所有测量的细胞因子与趋化因子释放抑制至少50％，如平均抑制％所测量。
实例9：ST2L域I结合抗体抑制鼻内IL-33诱导的气道重塑。
在D1、D3、D5、D7和D9天，用1μg/小鼠“成熟”IL-33(或PBS)(SEQ ID NO：215的第109-266位残基)鼻内给予C57BL/6小鼠，并在第10天或第20天分析肺。在首次IL-33鼻内施用前6小时以2mg/kg皮下给予抗-小鼠ST2L抗体CNTO3914或同种型对照(CNTO5516)。对照小鼠则在首次IL-33鼻内施用前6小时接受同种型对照CNTO5516或PBS。充气的肺在10％经缓冲的福尔马林中固定用于组织学分析；用于分析的染料包括苏木素-伊红(H&E)、马森氏三色(Masson Trichrome)和PAS。
IL-33处理诱导中度至明显的细支气管上皮肥大和增生，其具有杯状细胞增生及主要与嗜酸性粒细胞混合的细支气管周围浸润。细支气管上皮肥 大和增生在接受CNTO3914的动物中不明显。马森氏三色染料用来测定存在的胶原的量；该染色法显示IL-33处理的动物中的杯状细胞肥大。在用CNTO3914处理的动物中，肺泡和细支气管周围区域中的浸润不存在。
实例10：完全人ST2L抗体的生成
基本上如实例3所述，从从头合成pIX噬菌体展示文库中选择另外的人ST2L结合Fab，不同的是该文库使用嵌合HHM-ST2L构建体(SEQ ID NO：6，表1)淘选，其中生物素酰化抗原捕获于链霉抗生物素蛋白涂布的磁珠上。将噬菌体文库在含3％脱脂奶粉的PBS-T中封闭。将竞争者蛋白质MHM-ST2L嵌合体(SEQ ID NO：7，表1)添加到封闭溶液以促使噬菌体选择朝向会特异性结合人ST2L域I氨基酸序列的Fab。进行三轮噬菌体选择，接着通过ELISA筛选出结合于hST2L-Fc蛋白质的Fab。
十九个结合于hST2L-Fc的Fab分离自这些选择，并且进一步筛选出结合于嵌合ST2L构建体(表1)以及结合于小鼠ST2L与人ST2L蛋白质以定位特异性的域，并对其阻断IL-33/hST2L相互作用的能力进行表征。Fab ST2F1、ST2F4和ST2F6阻断hIL-33/ST2L相互作用并结合ST2L的域I，并且向前发展到亲和力成熟。
表9.

实例11：人ST2L结合Fab的亲和力成熟
ST2F1、ST2F4和ST2F6使用Shi等人，j Mol Biol 397：385-396，2010和国际专利公开WO2009/085462以及实例4中所述的“同步”成熟过程进行亲和力成熟。ST2F1、ST2F4和ST2F6的亲和力成熟文库通过多样化对应的轻链文库(分别为B3、L6和L6)，并将这些文库与Fab VH区组合而 制成。用于L6和B3亲和力成熟文库的轻链残基的多样化方案示于表10中。位置编号根据Kabat。对于亲和力成熟淘选，在第1轮10nM、第2轮1nM和第3轮0.1nM的浓度下，生物素酰化huST2-ECD-Fc捕获于链霉抗生物素蛋白(SA)涂布的磁珠上。在10nM未标记的huST2L-ECD-Fc存在下，在室温下过夜进行第3轮的最后洗涤。
表10.

ST2F6轻链成熟文库选择产生改善的结合物(ST2F14、ST2F17、ST2F31和ST2F41)(图10和图11)。使用ProteOn检查作为Fab的这些选择并证实从2nM至400pM的适度亲和力改善。
为了进一步改善ST2F14、ST2F17、ST2F31和ST2F41的亲和力，ST2F14、ST2F17、ST2F31和ST2F41中常见的重链ST2H41使用表11所示的多样化方案在HCDR1和HCDR2Kabat位置31、32、33、35、50、52、53、56和58处随机化。所得的重链文库与四个亲和力改善的轻链ST2L32、ST2L35、ST2L49和ST2L59配对，并且该文库按照对于轻链成熟文库所述的方式进行淘选和筛选。分离出相对于ST2F14具有改善结合的Fab并转换成IgG用于进一步表征。所得抗体(STLM103、STLM107、STLM108、STLM123、STLM124、STLM206、STLM207、STLM208、 STLM209、STLM210、STLM211、STLM212、STLM213、STLM214、STLM215、STLM216、STLM217、STLM218、STLM219、STLM220、STLM221、STLM222)(图10和图11)具有来源于VH3-23或Vκ-L6的框架。所有抗体结合ST2L域I并阻断IL-33/ST2L相互作用。
表11.
位置氨基酸31SDNTAY32SDAY33SDAY35SN50SDNTAY52SANTKDEGR53SANEY56SANTKDEGR58SDNTAY
设计并表达STLM208VH ST2L257的另外变体以在HCDR3的开始处替换DP基序。变体的序列示于图12中。
实例11：C2494的人框架适应(HFA)
框架适应过程按照基本上在美国专利公开US2009/0118127和Fransson等人，J Mol Biol 398：214-231，2010中所述的方式完成。简而言之，将重链和轻链序列与人种系序列(自2007年10月1起仅“01”等位基因)进行比较，该比较使用对IMGT数据库(Kaas等人，Nucl.Acids.Res.32，D208-D210，2004；Lefranc等人，Nucl.Acid Res.，33，D593-D597，2005)进行的BLAST搜索。从该组人种系基因中去除冗余基因(在氨基酸水平100％相同)以及那些具有未配对半胱氨酸残基的基因。在框架和CDR区两者中选择其余最接近匹配人种系基因作为受体人框架。根据整体序列同源性与CDR长度以及CDR相似性选择总共9个VL和7个VH种系人框架。基于IGHJ/IGJK种系基因的序列相似性选择FR-4，JK2用于VL链且JH1用于VH链(Kaas等人，Nucl.Acid Res.32，D208-D210，2004；Lefranc M.-P等人，Nucl.Acid Res.，33，D593-D597，2005)且具有C2494序列)。然后，将C2494的CDR(图14中下划线处)转移至所选择的受体人框架中以生成HFA变体，除了在对应于VH的CDR-H1的区域中之外。对于该区域， CDR和HV的组合、或较短的HCDR2(称为Kabat-7，参见美国专利公开US2009/0118127)从非人抗体转移至人FR，因为尚未发现图14中以灰色突出显示的HCDR2残基与已知结构的抗原-抗体复合物接触(Almagro，J Mol Recognit.17，132，2004)。
C2494的成熟蛋白质序列(VL：SEQ ID NO：52；VH：SEQ ID NO：48)示于图14中。在该图中，CDR残基(Kabat)带有下划线，Chothia HV环在CDR下方指示，并且残基转移到所选的人框架中的残基在HV(HFA)之下指示。所有变体中均未转移以灰色突出显示的HCDR2残基。
使用MOE(CCG，Montreal)的抗体建模模块构建C2494的Fv片段的3D同源模型。该模型用于评估可展性倾向(developability liabilities)，诸如暴露的甲硫氨酸和色氨酸残基、可能的N-糖基化和脱酰胺基序。在LCDR3中，根据Fv结构模型，有一个可能暴露的Met(M94)残基。为了将其去除，生成具有M94L突变的变体(STLL280，O12b)并进行表征。对于重链，刚好在HCDR3前的CAR基序(Chothia第92-94位残基，图14)中的R残基可能对一组带负电的残基(Chothia残基D31、D32、D96和D101a，图14)造成负面影响，这些带负电的残基可能对结合很重要。生成在Chothia第94位残基(CAR→CAL)处具有精氨酸置换亮氨酸的VH并进行表征。
结合设计的重链和轻链的单克隆抗体与C2494亲本一起被表达并对其结合于人ST2L进行测定。由生成的HFA单克隆抗体中，具有带有IGHV1-24*01(SEQ ID NO：148)和IGHV1-f*01(SEQ ID NO：149)重链框架(STLH195和STLH194)的VH链的单克隆抗体在与各种HFA轻链组合时，能很好地表达抗体并结合ST2L，所述各种HFA轻链具有IGKV3-15*01(L2)(SEQ ID NO：150)、IGKV1-9*01(L8)(SEQ ID NO：151)、IGKV1-5*01(L12)(SEQ ID NO：152)、IGKV1-12*01(L5)(SEQ ID NO：153)、IGKV1-39*01(O12)(SEQ ID NO：154)、IGKV1-27*01(A20)(SEQ ID NO：155)或IGKV1-33*01(O18)(SEQ ID NO：156)框架(STLL280、STLL278、STLL277、STLL276、STLL275、STLL274、STLL273、STLL272)。
HFA VH和VL变体的序列示于表12中。转移的残基带有下划线，并且上述另外的置换以灰色突出显示。表13示出了每种HFA VH和VL的 SEQ ID NO：以及独特的pDR(质粒)和CBIS ID。被选择供进一步表征的所生成的单克隆抗体的重链和轻链组合示于表14中。
表15示出用于转移C2494CDR的人框架(组合的V和J区)。
表12.
框架适应性VL链(偶联到JK2序列)。
CDR带有下划线。
＞VL2494(亲本)(SEQ ID NO：52)
ETTVTQSPASLSVATGEKVTIRCITNTDIDDVIHWYQQKPGEPPKLLISEGNTLRP
GVPSRFSSSGYGTDFVFTIENTLSEDVADYYCLQSDNMLTFGAGTKLELK
＞VL2494-IGKV1-33*01O18(SEQ ID NO：135)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCITNTDIDDVIHWYQQKPGKAPKLLIYEGNTLRP
GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCLQSDNMLTFGQGTKLEIK
＞VL2494-IGKV1-27*01A20(SEQ ID NO：136)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCITNTDIDDVIHWYQQKPGKVPKLLIYEGNTLRP
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLQSDNMLTFGQGTKLEIK
＞VL2494-IGKV1-39*01O12(SEQ ID NO：137)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCITNTDIDDVIHWYQQKPGKAPKLLIYEGNTLRP
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQSDNMLTFGQGTKLEIK
＞VL2494-IGKV1-12*01L5(SEQ ID NO：138)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCITNTDIDDVIHWYQQKPGKAPKLLIYEGNTLRP
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQSDNMLTFGQGTKLEIK
＞VL2494-IGKV1-5*01L12(SEQ ID NO：139)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCITNTDIDDVIHWYQQKPGKAPKLLIYEGNTLRP
GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCLQSDNMLTFGQGTKLEIK
＞VL2494-IGKV1-9*01L8(SEQ ID NO：140)
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCITNTDIDDVIHWYQQKPGKAPKLLIYEGNTLRP
GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQSDNMLTFGQGTKLEIK
＞VL2494-IGKV3-15*01L2(SEQ ID NO：141)
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCITNTDIDDVIHWYQQKPGQAPRLLIYEGNTLRP
GIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCLQSDNMLTFGQGTKLEIK
＞VL2494-IGKV1-39*01O12b(SEQ ID NO：142)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCITNTDIDDVIHWYQQKPGKAPKLLIYEGNTLRP
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQSDNLLTFGQGTKLEIK
偶联到JH1的框架适应性VH链
＞VH2494(亲本)(SEQ ID NO：48)
EVQLQQSVAELVRPGASVKLSCTASAFNIKDDYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPAIGNTEYAPKFQD
KATMTADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCALGDFYAMDYWGQGTSVTVSS
＞VH2494-IGHV1-f*01(SEQ ID NO：143)
EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSAFNIKDDYMHWVQQAPGKGLEWMGRIDPAIGNTEYAEKFQG
RVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATGDFYAMDYWGQGTLVTVSS
＞VH2494-IGHV1-24*01(SEQ ID NO：144)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSAFNIKDDYMHWVRQAPGKGLEWMGRIDPAIGNTEYAPKFQD
RVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATGDFYAMDYWGQGTLVTVSS
表13.

表14.

*亲本＝C2494VH和VL
表15.

实例12：用于互补位扫描的丙氨酸和人种系突变体的设计
进行定点突变以评估单独CDR残基以及一些对其他抗体特性具有潜在影响的残基对结合的贡献。根据上述C2494Fv的分子模型，预测溶剂暴露的CDR残基的子集参与结合抗原。这些残基被突变成丙氨酸和/或对应的“类人”残基，其为最接近匹配的种系基因中对应的残基。C2494VH中的D101aA(Chothia残基)(SEQ ID NO：48中的D104A)置换使koff降低约4倍，从1.43×10-4至3.2×10-5。
当D101aA置换降低C2494Fab结合于ST2L的koff时，可预期相同突变也可改善C2494HFA变体中的解离速率。因此，D101aA(Chothia编号)被并入STLH194的VH(＞VH2494-IGHV1-f*01，SEQ ID NO：143)以生成VH STLH201(SEQ ID NO：145)。STLH201与7条轻链STLL280、STLL277、STLL276、STLL275、STLL274、STLL273和STLL272(表13和表14)配对以生成单克隆抗体STLM226、STLM227、STLM228、STLM229、STLM230、STLM231和STLM232，再对其进一步表征。单克隆抗体STLM226、STLM227、STLM228、STLM229、STLM230、STLM231和STLM232因此在与亲本C2494抗体和不同HCDR3(SEQ ID NO：146，GDFYAMAY)相比时，具有相同的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1和HCDR2序列。另外，抗体STLM266VL STLM280具有独特的LCDR3：LQSDNLLT(SEQ ID NO：147)
STLH201(SEQ ID NO：145)：
EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSAFNIKDDYMHWVQQAPGKGLEWMGRIDPAIGNTEYAEKFQG
RVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATGDFYAMAYWGQGTLVTVSS
HCDR3并入D101aA(Chothia编号)置换：
SEQ ID NO：146：GDFYAMAY
抗体STLM266VL STLM280具有独特的LCDR3：LQSDNLLT(SEQ ID NO：147)
实例13：抗-ST2L抗体的表征
由噬菌体展示、杂交瘤和人框架适应性筛选(human framework adaptation campaign)获得的抗体在各种测定中进行表征，这些测定包括结合 于huST2L-ECD、cynoST2L-ECD、亲和力测量、结合于人/小鼠嵌合体以确定域结合、受体-配体抑制测定、报道基因测定和肥大细胞响应测定。
来源于噬菌体展示筛选(phage display campaign)的抗体对人与cyno ST2L的亲和力以及其对人ST2L的结合特异性示于表16中。表16中的所有抗体结合人ST2L的域I。
表16.

来自HFA筛选(HFA campaign)的抗-ST2L抗体相对于亲本(STLM62，C2494)的亲和力示于表17中。通过ProteOn分析亲和力。使用ProteOn的PBS-T-E缓冲液(PBS、0.005％P20和3mM EDTA)作为电泳缓冲液在25℃下进行实验。为了进行实验，通过共价固定山羊抗-人Fc(约5800RU)制备GLC传感器芯片，单克隆抗体的122-146个响应单元(RU)被捕获。单克隆抗体捕获之后注射0.024至15nM(5倍稀释度)的ST2L-ECD 4分钟(以50μL/min注射200μL)。对于所有反应，监测解离30分钟。使用10mM甘氨酸(pH1.5)的两次15秒脉冲进行再生。用基线漂移模型将数据拟合到1∶1。
样品的缔合速率较快，具有质量传递模型的朗缪尔(langmuir)用于曲线拟合和亲和力的估计。所有样品具有比亲本克隆和对照单克隆抗体更快的解离速率。当与亲本抗体相比较时，解离速率的差异是HFA变体的较低亲和力的主要原因。
表17.

*STLM62＝C2494，亲本抗体
表18.

++强抑制
+一定程度抑制
-不抑制
NT未测试
*作为杂交瘤测试
RLB＝受体-配体结合抑制
RGA＝报道基因测定
测试所选抗体的肥大细胞响应，测量对3ng/ml IL-33诱导的人脐带血源性肥大细胞释放IL-5、IL-13和IL-8的抑制，如所述使用RPMI+10％FCS中的100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml或0.01μg/ml抗体。在这些测定条件中，当与用IL-33诱导的对照样品相比时，在抗体浓度100μg/ml下，所有测试的抗体使IL-33诱导的IL-5、IL-13和IL-8细胞因子释放抑制约40％-100％。
实例14：抗-ST2L抗体抑制人嗜碱性粒细胞中的下游信号传导途径
测试抗-ST2L抗体其抑制人嗜碱性粒细胞中的p38MAPK信号传导的能力。
将全血收集于肝素化的试管中，并在测定起始之前置于室温(RT)。将1mL的血液等分至50mL锥形管中，并添加稀释于PBS中的抗-ST2L抗体(STLB252)或同种型对照(CNTO 8937)至终浓度为2、20或200μg/mL。轻轻涡漩试管以混合并置于37℃培养箱中30分钟，在15分钟后轻轻涡漩。接着将血液用荧光染料标记抗体对细胞表面抗原染色(CD123-FITC、CRTH2-PCP-CY5.5和CD45-APC-C7)，并将试管在37℃下温育15分钟。将1mL的温热培养基(RPMI-1640/10％FBS/1％青霉素-链霉素)添加到各个试管，再添加稀释于温热培养基中的IL-33至终浓度为10ng/mL。将样品在37℃温育10分钟，再将20mL预温热的BD Phosflow裂解/固定缓冲液添加到各个试管，以同时裂解红细胞并固定样品。通过翻转10次将试管均匀混合，并在37℃下温育10分钟。用20mL无菌RT PBS洗涤样品，重悬于2mL的1x RT BD破膜/洗涤缓冲液中，并在室温下温育30分钟。将样品用2mL BD破膜/洗涤缓冲液洗涤一次，再重悬于400μL BD破膜/洗涤缓冲液。添加抗细胞内p38-MAPK(vCell Signaling，目录号6908S)的PE标记抗体，并将样品在室温下温育30分钟，避光处理。将样品用5mL破膜/洗涤缓冲液洗涤一次，再重悬于100μL FACS缓冲液中，并转移至96孔圆底平板。使用BD LSRII流式细胞仪利用高通量系统(HTS)对每种样品收集尽可能多的事件来分析样品。使用FloJo软件分析数据。嗜碱性粒细胞被鉴别为CD45+CRTH2+CD123+，并评估每种条件下p38MAPK阳性嗜碱性粒细胞的百分比。全血与抗-ST2L单克隆抗体(STLB252)一起预温育导致IL-33 诱导的p38-MAPK磷酸化的剂量依赖性抑制，而同种型对照(CNTO 8937)则未见效果。抗-人ST2L抗体特异性地阻断通过全血背景中重组人IL-33引起的嗜碱性粒细胞活化。结果表明抗-ST2L抗体抑制体内内源性IL-33引起的信号传导。
表19.

实例15：抗-ST2L抗体在体内对靶标的接合
BAL细胞募集的鼻内mIL-336小时体内模型
将单剂量的1.2μg/小鼠mIL-33(R&D systems#3626-ML/CF)或PBS施用给雄性Balb/c小鼠(6-8周龄，Taconic)。在首次mIL-33经鼻内施用前24小时，大鼠抗-小鼠ST2L抗体CNTO 3914或为2、0.2、0.06或0.02mg/kg。同种型对照(ITC)单克隆抗体CNTO 5516以2mg/kg经皮下给予。mIL-33(或PBS)施用后六小时，将小鼠处死并收集血液用于血清分析。通过注射两次体积为0.7mL的PBS/0.1％BSA至肺并取出流出物来进行支气管肺泡灌洗(BAL)。将BAL离心(1200rpm，10分钟)并将细胞沉淀物重悬于200μl PBS中，以使用血球计(对瑞氏吉姆萨染色的细胞离心制备物计数)进行总细胞计数和分类细胞计数。
小鼠血清中CNTO3914的测量
将MSD SA-STD平板用50μL/孔的测定缓冲液封闭5分钟。将平板倒置以去除测定缓冲液，并在纸巾上轻敲。添加50μl/孔的测定缓冲液中的1.4μg/mL生物素酰化重组小鼠ST2L/IL1R4/Fc嵌合体(R&D System)并且在冷藏机中温育过夜。将150μL的测定缓冲液添加到预涂布平板的每个孔中而不去除该涂布试剂，并温育30分钟。将平板用洗涤缓冲液在洗板机上洗涤三次。在纸巾上轻轻敲平板以去除残留的洗涤缓冲液。将50μL/孔的CNTO 3914样品添加到平板的每个孔中。将平板在环境温度下轻柔涡旋振荡温育一小时。将平板用洗涤缓冲液在洗板机上洗涤三次。将50μL/孔滴度的钌标记小鼠抗-小鼠IgG1b(BD Biosciences)添加到平板的每个孔中。将平板在环境温度下轻柔涡旋振荡温育一小时。将平板用洗涤缓冲液在洗板机上洗涤三次。将150μL的读取缓冲液添加到平板的每个孔中。立即将平板置于MSD sector imager 6000读板机上读取发光水平。
全血测定
将血液以1：4稀释于Sarstedt过滤试管中的DMEM培养基+1％青霉素+链霉素溶液+/-10ng/ml小鼠IL-33中。将试管在37℃下温育过夜，接着使用Millipore Milliplex小鼠细胞因子/趋化因子试剂盒根据制造商的说明书测量上清液的细胞因子和趋化因子水平。
结果
给予0.2或2mg/kg CNTO 3914后24小时，小鼠血清中可检测到抗-ST2L抗体(图16A)。
经鼻内施用IL-33在6小时诱导细胞募集至气道(图16B)。施用抗-ST2L单克隆抗体降低BAL细胞募集；0.2mg/kg为观察到显著抑制BAL细胞募集所需的最小剂量(图16B)。使用单因素方差分析计算统计显著性。
用小鼠IL-33刺激全血显示在24小时后，细胞因子和趋化因子的水平增加，包括IL-6(图16C)和MCP-1(图16D)。在给予20mg/kg或2mg/kg抗-ST2L单克隆抗体CNTO 3914的小鼠中，与CNTO5516(同种型对照抗-小鼠IgG1)相比，IL-6和MCP-1水平降低，表明与靶标接合。与全血测定中抑制相关的最小剂量2mg/kg，也抑制BAL细胞募集(图16B)。
综上所述，该数据证实抗-ST2L单克隆抗体到达作用位点并实现预期的药理作用(表明与靶标接合)。
实例16：抗-ST2L抗体的表位
进行表位作图和竞争研究以选择抗-ST2L抗体。
竞争结合测定
进行竞争结合测定以评估抗-ST2L单克隆抗体的不同结合表位组。将每孔5μl(10μg/ml)的ST2L-ECD蛋白质涂布在MSD HighBind平板(Meso Scale Discovery，Gaithersburg，MD)上，室温下进行2小时。将一百五十毫升的5％MSD Blocker A缓冲液(Meso Scale Discovery，Gaithersburg，MD)添加到每孔中并在室温下温育2小时。用0.1M HEPES缓冲液(pH 7.4)洗涤平板三次，接着添加MSD荧光染料(磺酸基标签，NHS酯)标记的单独抗-ST2L抗体与不同竞争者的混合物。将10或30nM标记的抗体与1nM至2或5μM递增浓度的竞争者抗体一起温育，接着以25μL混合物的体积添加到指定的孔中。在室温下轻柔振荡温育2小时后，使用0.1M HEPES缓冲液(pH 7.4)洗涤平板3次。使用蒸馏水稀释MSD读取缓冲液T(4倍)并以150μL/孔的体积分配，并以SECTOR Imager 6000进行分析。
以下抗体用于竞争测定中：ST2L域I结合中和抗体STLM208、STLM213、C2244(STLM15)和C2494(STLM62)、ST2L域III结合抗体C2539、以及结合人ST2L的域I的非中和抗-ST2L抗体C2240。图17A和17B示出了竞争实验。根据该实验，鉴别的表位仓(epitope bin)是：BinA：单克隆抗体C2244、C2494、STLM208或STLM213；BinB：单克隆抗体C2240，BinC：C2539。阻断IL33/ST2L相互作用并抑制肥大细胞响应的抗体被发现处于相同的表位仓中并且彼此交叉竞争。竞争数据的汇总示于表20中。
表20.

表位作图：H/D交换分析
对于H/D交换，用于分析抗体扰动的步骤与前述步骤类似(Hamuro，Y.等人，Journal of Biomolecular Techniques，14：171-182，2003；Horn，J.R.，等人，Biochemistry，45：8488-8498，2006)，但稍作修改。将重组ST2-ECD(由带有C端His标签的HEK293E表达)(SEQ ID NO：157的第18-328位残基)在氘化水溶液中温育预定的时间，使得氘掺入在可交换的氢原子处。氘化的ST2-ECD被捕获于包含固定抗-ST2L C2244Fab分子的柱子上，然后用缓冲水溶液洗涤。从柱子上洗脱经回向交换的ST2-ECD蛋白并通过蛋白酶消化和质谱分析来测定含氘片段的定位。
图18显示与C2244Fab复合的人ST2-ECD(可溶性ST2)的简化H/D交换图。SEQ ID NO：119的ST2-ECD的第18-31位残基(氨基酸残基RCPRQGKPSYTVDW；SEQ ID NO：210)由Fab(对应于SEQ ID NO：1的全长ST2L的第35-48位残基)保护。数据表明，C2244结合于表位RCPRQGKPSYTVDW；SEQ ID NO：210)并且与C2244(C2494、STLM208或STLM213)竞争的抗体很可能结合相同或重叠的表位。
通过诱变进行的表位作图
生成数个在ST2L域I具有对应小鼠残基的置换的ST2L突变体。所测试的抗体不会与小鼠ST2L交叉反应，因此可预期具有结合能力被破坏和/或降低的ST2L变体表示表位残基在ST2L上的置换位置。使用标准方法将变体制成具有SEQ ID NO：1的全长ST2L的第19-205位残基的构建体HH-ST2L。通过ELISA或Proteon测试抗体结合于ST2L变体。
表面等离振子共振
使用ProteOn XPR36蛋白质相互作用阵列系统(Bio-Rad)进行结合研究(Bravman T等人，Anal Biochem 358：281-288，2006)。通过胺偶联化学将抗-人/抗-小鼠Fc混合物(Jackson ImmunoResearch，目录号109-005-098/115-005-071)固定于GLC传感器芯片上。然后通过流动在含0.5％Nonidet P-40和0.5％脱氧胆酸钠的PBS中制备的(1μg/mL)抗体溶液，捕获单独的抗-ST2L单克隆抗体。表面中的信号在抗-Fc涂布的表面中达到约250共振单位(RU，1RU＝1pg蛋白质/mm2)，证实这些抗体特异性捕获抗-ST2L单克隆抗体。在液体系统旋转90°后，将ST2L-D1D2的野生型或变体蛋白质(0.5mg/mL含0.5％Nonidet P-40和0.5％脱氧胆酸钠的PBS)注射于平行的流道中。所有这些测定均在25℃下进行。表面上的ST2L-D1D2依赖性信号通过双参比、减去单独在固定抗体的表面上所观察到的响应以及单独注射媒介物所观察到的信号而获得(其允许校正结合独立性响应)。将所得的传感图通过最简单的1∶1相互作用模型(ProteOn分析软件)拟合以获得对应的缔合和解离速率常数(ka和kd)。
图19示出所制备的ST2L变体以及ST2B206和ST2B252抗-ST2L抗体对变体的亲和力。变体93NL94(置换93TF94-＞93NL94)使STLM208和STLB252的结合亲和力降低约5倍，从约10.8×10-12M至约49.5×10-12M。结合亲和力未显著降低表示在抗体与ST2L-D1D2之间的相互作用的结合能为由H/D交换分析鉴别的表位区(RCPRQGKPSYTVDW；SEQ ID NO：210)和来自该93NL94位点的另外贡献的总和。残基编号根据SEQ ID NO：1的全长人ST2L。
实例17：ST2L域I结合抗体抑制体外原代人肺肥大细胞响应
ST2L域I结合抗体以抑制肺肥大细胞响应的能力通过原代人肺肥大细胞中的趋化因子和细胞因子的释放来评估。
原代人肺肥大细胞的分离
从得自国际医药促进机构(International Institute for the Advancement of Medicine)的正常非吸烟者组织分离原代人肺肥大细胞。通过在37℃于胶原酶和透明质酸酶中切碎、洗涤和消化薄壁组织过夜使细胞从肺实质和小气道分散。收集细胞、洗涤，并使用来自MACS Miletnyi Biotec的CD117MicroBead试剂盒(人)进行富集步骤，以从该群体中阳性选择出肥大细 胞。进行实验之前，将肥大细胞在StemPro-34+200ng/ml干细胞因子中培养6周。分离后两周，使用流式细胞术对细胞进行表型表征以测定肥大细胞纯度百分比。用于后续测定的细胞对于CD117(C-kit或干细胞因子受体)和(高亲和力IgE受体)为89％双阳性。此外，它们对于ST2L为94.2％阳性；从而确认其肥大细胞表型。
原代人肺肥大细胞的细胞因子释放测定
收集已培养于StemPro-34+200ng/ml干细胞因子中大约6周的原代人肺部肥大细胞，并通过在RPMI(10％热失活的FCS)中离心来洗涤。对细胞进行计数并以65,000个细胞的密度接种于96孔板中的RPMI/10％FCS培养基中。将抗-ST2L域I结合单克隆抗体添加到原代肺肥大细胞中，并在用IL-33刺激之前使之在37℃下结合30分钟。用3ng/ml IL-33刺激细胞24小时以引发各种介质累积于培养上层清液中。收获培养上层清液并冻存直到在定制Milliplex 9-plex试剂盒中进行测定。
在抗体浓度100μg/ml、10μg/ml和1μg/ml下，抗-ST2L域I结合抗体STLM208抑制原代人肺肥大细胞中IL-33诱导的GM-CSF(图20A)、IL-5(图20B)、IL-8(图20C)和IL-13(图20D)释放。使用脐带血源性肥大细胞获得类似的结果(数据未示出)。