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1、(10)申请公布号 CN 104327185 A (43)申请公布日 2015.02.04 CN 104327185 A (21)申请号 201410562674.0 (22)申请日 2014.10.21 CCTCC C2014173 2014.09.28 C07K 16/18(2006.01) C12N 5/20(2006.01) A61K 39/395(2006.01) A61P 25/28(2006.01) (71)申请人 中山大学 地址 510080 广东省广州市中山二路 74 号 (72)发明人 姚志彬 (74)专利代理机构 广州三环专利代理有限公司 44202 代理人 程跃华 (5。
2、4) 发明名称 4A1-15 衍生的单克隆抗体及其应用 (57) 摘要 本 发 明 公 开 了 一 种 4A1-15 衍 生 的 单 克隆抗体， 所述单克隆抗体由保藏号为 CCTCC C2014173 的杂交瘤细胞株产生。本发明的单克隆 抗体能清除 A 沉积， 而不引起微出血负担， 同时 实现较少的小胶质细胞激活以避免炎症因子和 T 细胞被进一步过度激活， 因而可用于预防和治疗 阿尔茨海默病的治疗。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 17 页 附图 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书17页 附图6页。
3、 (10)申请公布号 CN 104327185 A CN 104327185 A 1/1 页 2 1. 一种 4A1-15 衍生的单克隆抗体， 其特征在于 ： 所述单克隆抗体由保藏号为 CCTCC C2014173 的杂交瘤细胞株产生。 2. 如权利要求 1 所述的 4A1-15 衍生的单克隆抗体， 其特征在于 ： 由以下方法制备获 得 ： 在小鼠体内接种杂交瘤细胞株 CCTCC C2014173， 生产腹水抗体， 取出腹水进行纯化， 获 得所述 4A1-15 衍生的单克隆抗体 ； 或者 体外培养杂交瘤细胞株 CCTCC C2014173， 分离纯化培养液， 获得所述 4A1-15 衍生的 单。
4、克隆抗体。 3. 一种杂交瘤细胞株， 其特征在于 ： 以保藏号 CCTCC C2014173 保藏于中国典型培养物 保藏中心。 4. 如权利要求 3 所述的杂交瘤细胞株， 其特征在于， 由以下方法制备获得 ： 1)4A1-15 蛋白免疫 BALB/C 小鼠 ； 2)取所述BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0细胞， 按细胞数量5:110:1混合， 然后在聚乙 二醇作用下进行融合 ； 3) 融合后进行 HAT 培养， 第 7 天时用 HT 完全培养基换出 HAT 完全培养基， 继续培养 ； 4) 待上清颜色变黄时， 吸取杂交瘤细胞培养上清液进行 ELISA 检测， 筛选出阳性杂交 瘤细胞 ； 5) 。
5、用有限稀释法克隆至能稳定高效分泌 4A1-15 单克隆抗体的细胞株， 即获得所述 杂交瘤细胞株。 5.如权利要求4所述的杂交瘤细胞株， 其特征在于， 所述4A1-15蛋白免疫BALB/C小 鼠的步骤为 ： 1) 用弗氏完全佐剂乳化抗原进行第一次免疫， 免疫剂量为 50g/ 只 ； 2) 与第一次免疫间隔两周后， 以弗氏不完全佐剂乳化抗原， 进行第二次免疫， 免疫剂量 为 50g/ 只 ； 3) 与第二次免疫间隔两周后， 以弗氏不完全佐剂乳化抗原， 进行第三次免疫， 免疫剂量 为 50g/ 只 ； 4) 与第三次免疫间隔两周后， 用 ELISA 法测抗体效价， 取抗体效价最高的小鼠进行加 强免疫。
6、， 免疫剂量为 100g/ 只。 6. 一种组合物， 其特征在于 ： 包括权利要求 1 所述的单克隆抗体和药学上可接受的载 体。 7. 一种试剂盒， 其特征在于 ： 包括权利要求 1 所述的单克隆抗体和能够产生可检测信 号的标记物。 8. 如权利要求 1 所述的 4A1-15 衍生的单克隆抗体在制备预防或治疗阿尔茨海默病 的药物中的应用。 9. 如权利要求 8 所述应用， 其特征在于 ： 所述药物的剂型是注射液或冻干制剂。 10. 如权利要求 6 所述的组合物在制备预防或治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 104327185 A 2 1/17 页 3 4A1-15 衍生。
7、的单克隆抗体及其应用 技术领域 0001 本发明涉及免疫学领域， 尤其涉及一种 4A1-15 衍生的单克隆抗体、 产生该单克 隆抗体的杂交瘤、 包含该单克隆抗体的药物组合物、 包含该单克隆抗体的试剂盒， 以及该单 克隆抗体的应用。 背景技术 0002 阿尔茨海默病 (AD) 是一种最常见的痴呆和神经退行性疾病的形式， 导致老年人 逐渐丧失记忆和认知功能。 众所周知， AD的神经病理学特征是脑内细胞外蛋白的斑块沉积。 家族性和散在的案例都认为 A 斑块是其常见的病理特征， 提示我们治疗的方法应该从抑 制其生成， 促进其降解以及增强其从脑内清除三方面入手。 0003 现在， 刺激 AD 患者脑内的。
8、 A 清除成为治疗 AD 最具革新性的药理学手段， 免 疫疗法通过注射 A 抗原 ( 主动免疫 ) 或抗 A 抗体 ( 被动免疫 )， 已经被证实是治疗 AD 最先进和最可能成功的手段 ( 可参见 ： H.J.Fu,B.Liu,J.L.Frost,C.A.Lemere(2010) Amyloid-beta immunotherapy for Alzheimers disease.CNS&neurological disorders drug targets 9,197. ； N.A.Castello et al.(2014)7,8-Dihydroxyflavone,a small molecu。
9、le TrkB agonist,improves spatial memory and increases thin spine density in a mouse model of Alzheimer disease-like neuronal loss.PloS one 9,e91453.)。 首例人类临床试验研究了一种聚合的 A1-42 肽段， 名为 AN1792， 发现在小鼠模型中可 以安全有效地诱导出有利抗体， 但在二期临床被终止， 因为人免疫试验导致了副反应 6试验患者产生了脑膜脑炎。已经证实主动免疫产生的严重副反应显然是由于丰富的 T 细胞反应， 而可以被大多数抗 A 抗体识别。
10、的位点位于 A 蛋白的氨基末端 (A1-15 区 域 )( 可 参 见 ： X.Guan,J.Zou,H.Gu,Z.Yao(2012)Short amyloid-beta immunogens with spacer-enhanced immunogenicity without junctional epitopes for Alzheimers disease immunotherapy.Neuroreport 23,879.)。 0004 由于严重的副反应， 主动免疫疗法逐渐减少使用， 而直接注射抗 A 单克隆 抗体 ( 被动免疫 ) 作为一种新的方式进行试验 ( 可参见 ： R.Rob。
11、ert,K.L.Wark(2012) Engineered antibody approaches for Alzheimers disease immunotherapy.Archives of biochemistry and biophysics 526,132.)。与主动免疫的免疫反应性诱导 T 细胞产 生并伴随严重的副反应相比， 被动免疫疗法在 APP/PS1 转基因小鼠中引起免疫反应不需要 生成 T 细胞， 被认为具备适用于人类临床的一些特别的优势 ( 可参见 ： K.Gasiorowski,J. Leszek(1997)A proposed new strategy of imm。
12、unotherapy for Alzheimers disease. Medical hypotheses 49,319.)。理论上， 抗 A 的被动免疫疗法被认为拥有更快更安 全的免疫应答， 并且与主动免疫相比潜伏期更短， 成为一种更加直接可控的针对 A 免疫 反应的选择 ( 可参见 ： F.Panza et al.(2011)Anti-beta-amyloid immunotherapy for Alzheimers disease:focus on bapineuzumab.Current Alzheimer research 8,808. ； B.Solomon,R.Koppel,E.。
13、Hanan,T.Katzav(1996)Monoclonal antibodies inhibit in 说 明 书 CN 104327185 A 3 2/17 页 4 vitro fi brillar aggregation of the Alzheimer beta-amyloid peptide.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93,452. ； G.A.Jicha(2009)Is passive immunization for Alzheimers dise。
14、asealive and wellordead and buried ？ Expert opinion on biological therapy 9,481.)。 0005 之前的研究表明大多数在人类和动物体内产生的抗 A 抗体识别的位点位于 A 蛋白的氮端 (A1-15)， 而 T 细胞位点已经被证实在 A15-42( 可参见 ： X.Guan,J. Yang,H.Gu,J.Zou,Z.Yao(2013)Immunotherapeutic efficiency of a tetravalent Abeta1-15vaccine in APP/PS1transgenic mice as mo。
15、use model for Alzheimers disease.Human vaccines&immunotherapeutics 9,1643. ； M.Lee et al.(2005) Abeta42immunization in Alzheimers disease generates Abeta N-terminal antibodies.Annals of neurology 58,430.)。 在 发 明 人 的 实 验 室，已 经 制 备 了 4A1-15( 由 肽 段 GPGPG 连 接 的 四 段 A1-15 重 复 序 列 )， 用 4A1-15 蛋 白 主 动 免 疫后。
16、， 在 AD 转基因模型鼠 APP/PS1 中可以显著减少 A 病理变化并且改善认知功能 ( 可 参 见 ： X.Guan, J.Zou,H.Gu,Z.Yao(2012)Short amyloid-beta immunogens with spacer-enhanced immunogenicity without junctional epitopes for Alzheimers disease immunotherapy.Neuroreport 23,879. ； X.Guan,J.Yang,H.Gu,J.Zou,Z. Yao(2013)Immunotherapeutic efficie。
17、ncy of a tetravalent Abeta1-15vaccine in APP/PS1transgenic mice as mouse model for Alzheimers disease.Human vaccines&immunotherapeutics 9,1643.)。但主动免疫仍可能存在着副反应， 如 T 细胞增 殖引起的炎症反应， 可能会对其进一步应用产生影响。 0006 虽然过去已经产生出抗 A1-42 的多克隆和单克隆抗体， 但无一被证实能在动物 和 / 或人中产生所需的疗效而又不产生严重的副作用。例如， 对高龄 APP23 小鼠接受的持 续 5 个月每周一次的 N。
18、 末端定向性抗 A1-42 抗体的临床前研究所得的被动免疫结果显示 治疗相关性副作用。 特别是这些小鼠比用盐水处理的小鼠显示出微出血量和严重程度加剧 (Pfeifer et al.,Science2002298:1379)。 也有文章描述高龄(24个月)Tg2576和PDAPP 小鼠有类似的出血增加情况(Wilcock et al.,J Neuroscience2005,25:629-636)。 在这两 种小鼠品系中， 注射抗体 A1-42 都导致微出血的显著增加。 0007 单克隆抗体技术是抗体制备的经典方法， 该技术比较成熟， 应用广泛。 本发明人旨 在利用单克隆抗体与 A 特异性结合， 。
19、达到清除 A 沉积， 而不引起微出血负担， 同时实现 较少的小胶质细胞激活以避免炎症因子和 T 细胞被进一步过度激活， 从而实现对老年性痴 呆的预防和治疗。 发明内容 0008 本发明的目的在于提供能清除 A 沉积， 而不引起微出血负担， 同时实现较少的 小胶质细胞激活以避免炎症因子和 T 细胞被进一步过度激活的单克隆抗体。 0009 本发明的技术方案如下 ： 一种 4A1-15 衍生的单克隆抗体， 所述单克隆抗体由 于 2014 年 9 月 28 日保藏于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏号为 CCTCC C2014173 的杂交瘤细胞株 5C8H5 产生。 0010 在上述技术方案。
20、中， 4A1-15 是由 GPGPG 连接的四段 A1-15 重复序列， 其中， 说 明 书 CN 104327185 A 4 3/17 页 5 A1-15 氨基酸序列为 ： DAEFRHDSGYEVHHQ。4A1-15 去除了 A 的 T 细胞抗原表位保留了 A的B细胞抗原表位， 并用多个重复B细胞抗原表位增强抗 原的免疫原性， 避免了细胞免 疫反应保证了强的体液免疫反应。在发明人的实验室中， 已经证明用 4A1-15 蛋白主动免 疫后， 在阿尔茨海默病 (AD) 转基因模型鼠 APP/PS1 中可以显著减少 A 病理变化并且改善 认知功能， 但考虑到主动免疫可能存在的副反应， 发明人采用杂。
21、交瘤细胞株技术， 通过大量 实验以及丰富技术经验， 用 4A1-15 抗原制备了一种全新的单克隆抗体， 命名为 5C8H5， 接 种了 AD 转基因模型鼠 APP/PS1。发明人检测了 5C8H5 接种和 4A1-15 接种的小鼠血清和 脑内的抗 A 抗体， 可溶性 / 不可溶性的 A40/42， A 斑块， 神经发生， 胶质细胞激活和行 为学。 这些结果揭示在AD转基因模型鼠APP/PS1中， 4A1-15衍生的单克隆抗体与其相应 的抗原免疫组相比， 拥有更好的免疫治疗效果， 能够诱导更多的 A 消除和行为学的改善 同时伴随较少的小胶质细胞激活。5C8H5 杂交瘤细胞株已被保藏于中国典型培养。
22、物保藏中 心， 保藏号为 CCTCC C2014173， 本发明的单克隆抗体被鉴定为 IgG1 型， 效价较高。 0011 作为对上述技术方案的进一步改进， 所述单克隆抗体由以下方法制备获得 ： 0012 在小鼠体内接种杂交瘤细胞株 CCTCC C2014173， 生产腹水抗体， 取出腹水进行纯 化， 得到 4A1-15 衍生的单克隆抗体 ； 或者 0013 体外培养杂交瘤细胞株 CCTCC C2014173， 分离纯化培养液， 获得 4A1-15 衍生的 单克隆抗体。 0014 在上述技术方案中， 前一种方法适于大量获取抗体， 后一种方法适于获得高纯度 的抗体， 通过上述方法获得的抗体， 可。
23、以用常规方法纯化， 如盐析、 凝胶过滤、 亲合色谱层析 等方法。 0015 本发明还提供了一种杂交瘤细胞株， 以保藏号CCTCC C2014173保藏于中国典型培 养物保藏中心。 0016 在上述技术方案中， 本发明的杂交瘤细胞系具有较强的分泌单克隆抗体的能力 ( 例如， C8H5 单抗的细胞培养上清液可进行 1:1000 倍稀释后进行 ELISA 试验其滴度未明显 下降 )， 能稳定、 大量分泌本发明的单克隆抗体。 0017 作为对上述技术方案的进一步改进， 所述的杂交瘤由以下方法制备获得 ： 0018 4A1-15 蛋白免疫 BALB/C 小鼠， 然后取 BALB/C 小鼠脾细胞与 SP2。
24、/0 细胞按细 胞数量 5:1 至 10:1 混合， 然后在聚乙二醇作用下进行融合， 融合后进行 HAT 培养， 第 7 天 用 HT 完全培养基换出 HAT 完全培养基， 继续培养， 待上清颜色变黄时， 吸取杂交瘤细胞培 养上清液进行 ELISA 检测， 筛选出阳性杂交瘤细胞， 用有限稀释法克隆至能稳定高效分泌 4A1-15 单克隆抗体， 即获得所述杂交瘤。 0019 作为对上述技术方案的更进一步改进， 所述 4A1-15 蛋白免疫 BALB/C 小鼠的步 骤为 ： 0020 用弗氏完全佐剂乳化抗原进行第一次免疫， 免疫剂量为 50g/ 只 ； 与第一次免疫 间隔两周后， 以弗氏不完全佐剂乳。
25、化抗原， 进行第二次免疫， 免疫剂量为 50g/ 只 ； 与第二 次免疫间隔两周后， 以弗氏不完全佐剂乳化抗原， 进行第三次免疫， 免疫剂量为 50g/ 只 ； 与第三次免疫间隔两周后， 进行加强免疫， 免疫剂量为 100g/ 只 ； 加强免疫前， 第三次免 疫后， 用 ELISA 法测抗体效价， 取抗体效价最高的小鼠进行加强免疫。 0021 本发明还提供了一种组合物， 包括所述的单克隆抗体和药学上可接受的载体。 说 明 书 CN 104327185 A 5 4/17 页 6 0022 在上述技术方案中， 本发明的组合物可以为多种形式。 这些形式包括例如液体、 半 固体和固体剂型， 如液体溶液。
26、剂 ( 例如可注射和可输注溶液剂 )、 分散剂或混悬剂、 片剂、 丸 剂、 散剂、 脂质体和栓剂。优选的形式取决于预定的给药方式和治疗应用。典型的优选组合 物为可注射或可输注溶液剂形式。优选的给药方式是胃肠外 ( 例如静脉内、 皮下、 腹膜内、 肌肉内 ) 给药。在一个优选的实施方案中， 抗体通过静脉内输注或注射给予。在另一个优 选的实施方案中， 抗体通过肌肉内或皮下注射给予。还可将辅助性活性化合物掺入到组合 物中， 在某些实施方案中， 可将本发明的抗体或抗体部分与一种或多种可用于治疗阿尔茨 海默病或相关疾病或病症的另外治疗药剂一起共配制和 / 或共给予。例如， 可将一种本发 明抗体或其抗体部。
27、分与一种或多种能结合其它靶标的另外抗体一起共配制和 / 或共给予。 0023 在上述技术方案中，“药学上可接受的载体” 包括任何和所有生理上相容的容积、 分散介质、 包衣料、 抗细菌和抗真菌剂、 等渗和吸收延缓剂等。药学上可接受的载体的实例 包括水、 盐水、 磷酸缓冲盐水、 右旋糖酐、 甘油、 乙醇等中的一个或多个以及它们的组合。在 很多情况下， 优选的是将等渗剂例如糖、 多元醇或氯化钠包括在组合物中。 药学上可接受的 载体还可包含少量的能提高抗体或抗体部分的货架期或有效性的辅助物质， 如湿润剂或乳 化剂、 防腐剂或缓冲液。 0024 本发明还提供了一种试剂盒， 包括所述的单克隆抗体和能够产生。
28、可检测信 号的 标记物。 0025 本发明提供的单克隆抗体具有高亲和力， 能与阿尔茨海默病病人脑组织特异性结 合， 而不结合正常脑组织。 因此， 含有单克隆抗体的试剂盒， 可用于诊断阿尔茨海默病， 特别 是阿尔茨海默病的早期诊断。 其中， 能够产生可检测信号的标记物包括但不限于以下 ： 放射 性同位素或放射性核素 ； 荧光标记， 如 FITC、 罗丹明 ； 酶标记， 如辣根过氧化物酶、 荧光素酶 或碱性磷酸酶 ； 化学发光标志 ； 生物素酰基基团 ； 磁性物质。 0026 本发明还提供了所述的 4A1-15 衍生的单克隆抗体在制备预防或治疗阿尔茨海 默病的药物中的用途。由于 4A1-15 衍生。
29、的单克隆抗体 5C8H5 对阿尔茨海默病拥有较好 的免疫治疗效果， 能够诱导更多的 A 消除和行为学的改善同时伴随较少的小胶质细胞激 活， 因而可用于预防或治疗阿尔茨海默病的药物的制备中。 0027 作为对上述技术方案的更进一步改进， 所述药物的剂型是注射液或冻干制剂。注 射液可通过皮下注射、 静脉注射或输注的方式直接进行给药。 冻干制剂使用时， 先用葡萄糖 注射液或灭菌注射用水溶解， 加液量可根据临床需要酌定。对于冻干制剂， 还可包括抗冻 剂， 如 0-10蔗糖 ( 最好 0.5-1.0 )。其它合适的抗冻剂还有海藻糖和乳糖。在注射液和 冻干剂型中都可使用稳定剂， 如 1-50mM L- 甲。
30、硫氨酸 ( 最好 5-10mM)。 0028 本发明还提供了所述组合物在制备预防或治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。 优 选地， 所述药物的剂型是注射液或冻干制剂。 0029 相对于现有技术， 本发明的有益效果为 ： 0030 通过杂交瘤技术， 发明人用 4A1-15 免疫小鼠， 生产出一种全新的单克隆抗体， 筛选出最好的杂交瘤细胞株 5C8H5， 并鉴定为 IgG1 型， 杂交瘤细胞株的保藏号为 CCTCC C2014173。发明人通过试验比较了相同的免疫程序下， 分别利用 4A1-15 进行主动免疫的 小鼠和利用 5C8H5 进行被动免疫的小鼠后两组小鼠的 AD 治疗表现效果。结果表明， 通。
31、过免 疫治疗的手段， 有效诱导了激活的小胶质细胞吞噬清除 A 沉积， 改变了微环境， 进一步促 说 明 书 CN 104327185 A 6 5/17 页 7 使新增殖细胞向神经元分化， 有利于行为学的改善。在相同的免疫程序下， 5C8H5 接种的被 动免疫比 4A1-15 接种的主动免疫表现出了更好更安全的疗效， 突出了持续接种特异性 抗体可能成为治疗 AD 的更好的方法， 而小胶质细胞的激活被控制在一个机体适合的范围 可能成为治疗的关键。具体地 ： 0031 1) 与 4A1-15 组相比， 5C8H5 需要较少次数的接种， 使 A 抗体达到更高滴度， 而 且被动免疫不需要潜伏期而直接作用。
32、于机体。同时， 外周免疫抗 A 抗体可以穿透血脑屏 障进入中枢神经系统。 0032 2)5C8H5 显著改善 APP/PS1 转基因小鼠的活动度， 空间学习能力和记忆任务的能 力。特别是 5C8H5 组的小鼠比 4A1-15 组表现出更多的提高， 被动免疫对 APP/PS1 的改善 作用较优于主动免疫。 0033 3) 通过脑片的免疫组织化学和定量图像分析， 显示出 5C8H5 的 A 沉积明显少于 4A1-15 组。 0034 4) 组织切片结果显示， 5C8H5 在引起 APP/PS1 小鼠 A 斑块清除的同时， 没有诱发 微出血的增加或其他一些病理变化。 0035 5) 主动免疫与被动免。
33、疫之间 A 斑块相关的小胶质细胞的激活没有统计学差异， 但 5C8H5 组总的小胶质细胞数显著少于 4A1-15 组。在与 A 不相关的区域中， 5C8H5 组 比 4A1-15 组含有显著较少的小胶质细胞。 0036 6) 神经发生的结果显示， 5C8H5 组诱导了比 4A1-15 组更多的神经发生， 是最接 近正常组的。同时， 分化成早期神经元的新增殖细胞 (BrdU+/DCX+) 和分化成成熟神经元的 新增殖细胞 (BrdU+/NeuN+) 也有类似的结果。 附图说明 0037 图 1 为四组小鼠血清和脑内抗 A 抗体浓度的变化趋势图， 其中， A 为血清中抗 A 抗体的变化趋势图 ； 。
34、B 为脑中抗 A 抗体的变化图 ； 0038 图2为四组小鼠的旷场实验和水迷宫实验结果图， 其中， A为水平运动结果图， B为 直立运动结果图， C 为理毛行为结果图， D 为定位航行结果图， E、 F 为空间探索结果图 ； 0039 图 3 为四组小鼠的血清和脑中的 A40 和 A42 水平变化图， 其中， A 为血清中 A40 的变化趋势图， B 为血清中 A42 的变化趋势图， C 为海马中不可溶性 A40 和 A42 的水平图， D为海马中可溶性A40和A42的水平图， E为皮质中不可溶性A40和A42 的水平图， F 为皮质中可溶性 A40 和 A42 的水平图 ； 0040 图4为。
35、三组小鼠海马和皮质中A沉积的共聚焦激光显微图像和定量图像分析结 果图， 其中， A、 B、 C 分别为 IgG 组、 5C8H5 组、 4A1-15 组小鼠海马中的 A 沉积共聚焦激光 显微图像， D 为三组小鼠海马中的 A 沉积的定量图像分析结果图， E、 F、 G 分别为 IgG 组、 5C8H5 组、 4A1-15 组小鼠皮质中的 A 沉积共聚焦激光显微图像， H 为三组小鼠皮质中的 A 沉积的定量图像分析结果图 ； 0041 图 5 为 5C8H5 免疫小鼠第三天和第 35 天的 A 沉积共聚焦激光显微图像和定量 图像分析结果图， 其中， A、 B 分别为第 3 天和第 35 天小鼠海。
36、马中的 A 沉积共聚激光焦显 微图像， C 为海马中 A 沉积的定量图像分析结果图， D、 E 分别为第 3 天和第 35 天小鼠皮 质中的 A 沉积共聚焦激光显微图像， F 为皮质中 A 沉积的定量图像分析结果图 ； 说 明 书 CN 104327185 A 7 6/17 页 8 0042 图6为四组小鼠的海马和皮质中A斑块和胶质细胞激活的免疫染色共聚焦激光 显微图像以及 A 斑块和胶质细胞激活的定量图像分析结果图， 其中， A-D 分别为 C57 组、 IgG 组、 5C8H5 组、 4A1-15 组小鼠海马中 A 斑块和胶质细胞激活的免疫染色共聚焦激光 显微图像， E-F 别为 C57 。
37、组、 IgG 组、 5C8H5 组、 4A1-15 组小鼠皮质中 A 斑块和胶质细胞 激活的免疫染色共聚焦激光显微图像， I-L为C57组、 IgG组、 5C8H5组、 4A1-15组小鼠A 斑块和胶质细胞激活的免疫染色高倍共聚焦激光显微图像 (63 油镜 )， M、 N 为 A 斑块和 胶质细胞激活的定量图像分析结果图 ； 0043 图 7 为四组小鼠脑组织免疫组织化学染色共聚焦激光显微图像， 其中， A-D 分别为 C57 组、 IgG 组、 5C8H5 组、 4A1-15 组小鼠脑组织经 BrdU 染色后的共聚焦激光显微图像， E 为四组小鼠齿状回 BrdU+ 细胞的定量图像分析结果图，。
38、 F-I 分别为 C57 组、 IgG 组、 5C8H5 组、 4A1-15 组小鼠脑组织经 BrdU+/DCX+ 染色后的共聚焦激光显微图像， 箭头所指部分为 BrdU+/DCX+ 细胞， J 为四组小鼠齿状回 BrdU+/DCX+ 细胞的定量图像分析结果图， K-N 为 C57 组、 IgG 组、 5C8H5 组、 4A1-15 组小鼠脑组织经 BrdU+/NeuN+ 染色后的共聚焦激光显微图 像， 箭头所指部分为 BrdU+/NeuN+ 细胞， O 为四组小鼠齿状回 BrdU+/NeuN+ 细胞的定量图像 分析结果图。 具体实施方式 0044 本申请中， 如无特别说明， 本发明的实施都使。
39、用分子生物学、 微生物学、 重组 DNA 和免疫学的常规技术， 这些技术都是本领域技术人员所掌握的。这些技术在本领域技术人 员常用文献中有详细第描述， 如 Sambrook 等人编著的 Molecular Cloning ： A Laboratory Manual， 第三版等。 0045 在本发明中， 以编号提及的抗体与从相同编号的杂交瘤获得的单克隆抗体相同。 例如， 单克隆抗体 5C8H5 是与从杂交瘤细胞株 5C8H5 或其亚克隆或后代细胞获得的抗体相 同的抗体。 0046 在本发明中， 术语 “表位” 是指， 抗原上被免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。 “表位” 在本领域内也称为 “抗原。
40、决定簇” 。表位或抗原决定簇通常由分子的化学活性表面 基团如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成并且通常具有特定的三维结果特征以及特定的 电荷特征。 0047 在本发明中， 术语 “杂交瘤” 和 “杂交瘤细胞株” 可互换使用， 并且当提及术语 “杂 交瘤” 和 “杂交瘤细胞株” 时， 其还包括杂交瘤的亚克隆和后代细胞。例如， 当提及杂交瘤细 胞株 5C8H5 时， 其还指杂交瘤细胞株 5C8H5 的亚克隆和后代细胞。 0048 在本发明中， 术语 “主动免疫” 是利用抗原刺激， 使机体产生抗体的方法。免疫须 经几天， 几个星期或更长时间才出现， 但能长久甚至终生保持。 0049 在本发明中， 术语 。
41、“被动免疫” 是机体被动接受抗体、 致敏淋巴细胞或其产物所获 得的特异性免疫能力。它与主动产生的自动免疫不同， 其特点是效应快， 不需经过潜伏期， 一经输入， 立即可获得免疫力。 0050 在本发明中， 术语 “单克隆抗体” ， 简称 “单抗” ， 是由 B 淋巴细胞转化而来的浆细胞 分泌的， 每个 B 淋巴细胞株只能产生一种它专有的、 针对一种特异性抗原决定簇的抗体， 这 种从一株单一细胞株产生的抗体就是单克隆抗体。 说 明 书 CN 104327185 A 8 7/17 页 9 0051 实施例 1 4A1-15 肽的合成 0052 4A1-15 肽的制备方法可参考专利号为 “ZL 201。
42、010163165.2” ， 名称为 “重组 4A15在毕赤氏酵母中的高效分泌表达及纯化方法” 的发明专利， 其中， 4A15即本发明的 4A1-15。本发明使用的 4A1-15 多肽抗原由丽珠制药公司提供， 蛋白纯度 95。 0053 此外， 还可根据 4A1-15 的序列人工合成全长的 4A1-15 肽， 其中 ： 0054 A1-15 肽氨基酸序列为 ： DAEFRHDSGYEVHHQ ； 0055 4A1-15 肽氨基酸序列为 ： 4 段重复的 DAEFRHDSGYEVHHQ 序列， 中间以肽段 GPGPG 连接， 共 75 个氨基酸。 0056 实施例 2 杂交瘤的产生和单抗的制备 。
43、0057 动物免疫 0058 将经过纯化的 4A1-15 抗原 ( 蛋白纯度 95 ) 免疫了 6 周龄的 Balb/c 小鼠。 免疫方式为皮下或腹腔注射。第一次免疫时， 用弗氏完全佐剂 (FCA ； Sigma) 乳化抗原， 免 疫剂量为 50g/ 只。间隔两周后， 以弗氏不完全佐剂 (FIA ； Sigma) 乳化抗原， 进行第二次 免疫， 免疫剂量为 50g/ 只。第二次免疫两周后， 以弗氏不完全佐剂 (FIA ； Sigma) 乳化抗 原， 进行第三次免疫， 免疫剂量为 50g/ 只。第三次免疫两周后， 进行加强免疫， 免疫剂量 为 100g/ 只。其中， 多肽抗原以 1mg/ml 溶。
44、于 PBS， 与佐剂按体积比 1:1 进行免疫。加强免 疫前， 第三次免疫后， 用 ELISA 法测抗体效价， 取抗体效价最高的小鼠进行加强免疫， 制备 单克隆抗体。 0059 ELISA 最佳抗原包被浓度与最佳阳性血清稀释浓度的确定 0060 阴性对照 ： 取 4 只 8 周龄 SPF 级的 Balb/C 雌性小鼠， 在免疫前对所有小鼠进行断 尾采血， 置于室温 1-2h， 待血清充分析出时离心分离血清， 4保存备用。 0061 阳性对照 ： 第三次免疫后 10d， 再次使用相同的方法采血， 4保存备用 ( 同时检测 血清中抗体效价 ) 0062 采用方阵试验确定最佳抗原包被浓度和最佳对照血。
45、清浓度 ： 0063 (1) 包被 ： 以合成多肽为抗原， 按倍比稀释从第一列为 15g/ml， 每孔 100l/ 孔 一直稀释到 96 孔板中第 11 列， 最后一列只加包被液作为空白对照。振动平板以使抗原分 布均匀， 4过夜。 0064 (2) 封闭 ： 第二天， 倒掉 ELISA 板中液体， 用吸水纸拍干后， 使用多道移液器加入洗 涤液200g/孔， 置于摇床中快速洗涤5min， 倒掉洗涤液， 然后使用吸水纸排干， 重复洗涤3 次 ； 用 0.1名叫封闭液 200g/ 孔， 37封闭 30min， 洗涤 3 次， 吸水纸拍干。 0065 (3) 加一抗 ： 阴、 阳性血清用稀释液作 1:。
46、500、 1:1000、 1:2000、 1:4000、 1:8000、 1:16000、 1:32000稀释， 加入相应孔中， 100g/孔， 设空白对照， 37孵育60min， 洗涤3次， 吸水纸拍干。 0066 (4) 加二抗 ： 加入 HRP 标记羊抗小鼠 IgG(1:5000 稀释 )， 100g/ 孔， 37孵育 60min， 孵育后洗涤液洗涤 3 次， 吸水纸拍干。 0067 (5)显色 ： 加底物溶液OPD， 100g/孔， 室温避光孵育15min， 用2M H2SO4终止液终 止反应， 100g/ 孔， 因为是使用 OPD 作为显色液， 随着时间的推移， 颜色会发生变化， 所。
47、以 在加入终止液后应迅速使用酶标仪读取实验结果。在酶标仪中选用 450nm 的波长， 测定实 验结果的 OD 吸光值。 说 明 书 CN 104327185 A 9 8/17 页 10 0068 把阳性血清孔的 OD 值接近 1.0， 阳性血清孔与阴性血清孔的比值大于 2.1 的抗原 血清最大稀释度作为抗原及对照血清的最适工作浓度， 在保证 OD 值灵敏度的情况下， 以最 小抗原包被浓度为最佳实验浓度。 0069 细胞融合 0070 1)SP2/0 细胞 ( 骨髓瘤细胞 ) 的制备 0071 培养基 ： RPMI1640 完全培养基 (1双抗 +10胎牛血清 )+20g/ml 8-AG ； 细。
48、胞 浓度以 104 5105/ml 为宜， 最大浓度不得超过 106/ml。 0072 细胞处于对数生长的中期时， 按 1 ： 3 1 ： 10 的比例传代， 每 3 5 天传代一次。 0073 将细胞吹匀， 取出细胞悬液， 置于一洁净的离心管中， 水平离心机 1000r/min 离心 5min， 弃上清， 加入 1640 培养液， 使细胞混匀， 将细胞悬液移入一洁净的细胞培养瓶中， 补 加1640至10ml， 再将细胞混匀， 移出5ml， 置于另一洁净的细胞培养瓶中， 混匀， 置于37培 养箱培养。 0074 融合当天， 将细胞从培养皿中轻轻吹下， 使用 50ml 离心管收集吹下来的细胞， 水 平离心机1000r/min离心5min， 弃上清， 加入10ml不完全培养基， 离心洗涤， 重复洗涤三次， 将细胞重悬于10ml不完全培养基内混匀， 取SP2/0细胞悬液， 加入质量体积比为0.4台盼 蓝染液， 做活细胞计数， 等体积 SP2/0 细胞悬液和 0.4台盼蓝染液混匀后， 加入血球计数 板计数， 细胞浓度稀释至 106 个 /ml， 置于 37水浴中备用。 0075 2) 免疫脾细胞的制备 ( 融合当天 ) 0076 加强免疫的 Balb/c 雌性小鼠摘眼球静脉放血， 分离血清， -80保。