一种产壳聚糖酶菌株的筛选方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104342371 A (43)申请公布日 2015.02.11 CN 104342371 A (21)申请号 201410523683.9 (22)申请日 2014.10.08 C12N 1/00(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) (71)申请人广西壮族自治区农业科学院葡萄与葡萄酒研究所地址 530007 广西壮族自治区南宁市大学东路 174 号 (72)发明人李玮张瑛周咏梅韦荣福时晓芳林玲曹雄军 (74)专利代理机构深圳市科吉华烽知识产权事务所 ( 普通合伙 ) 44248 代理人胡吉科 (54) 发明名称一种产。

2、壳聚糖酶菌株的筛选方法 (57) 摘要本发明提供一种产壳聚糖酶菌株的筛选方法，包括以下步骤： 1）筛选平板的制备； 2）单菌落的培养； 3）平板染色； 4）菌株筛选。本发明通过碘升华染色的方法，能够在 pH 5.0 的酸性条件下通过平板培养法快速检测到壳聚糖酶对壳聚糖的水解反应（即透明圈的出现），进而根据透明圈的大小筛选出高产壳聚糖酶的菌株，筛选的得到的菌株能在酸性条件下良好生长并高效产生壳聚糖酶。本筛选方法为从自然界中筛选优良的酸性壳聚糖酶产生菌新菌株提供了技术保证，同时也可应用于已有酸性壳聚糖酶工业生产菌株的进一步选育增产，对工业化生。

3、产壳聚糖酶技术水平的提高具有重要意义。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书4页 (10)申请公布号 CN 104342371 A CN 104342371 A 1/1 页 2 1. 一种产壳聚糖酶菌株的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤： 1）筛选平板的制备：将含胶体壳聚糖的培养基灭菌后倒制成筛选平板； 2）单菌落的培养：将微生物样品接种到筛选平板上培养，使平板上的微生物单菌落数为 30-100CFU/ 板； 3）平板染色：取可密封的容器，按 0.05。

4、-1g/L 的量向容器中散入纯度达到化学纯以上的固体碘，并将培养结束后的平板置于容器内，密封容器，于 28-40使碘升华对平板进行染色 30-60min，观察平板培养基主体被染成深红色后即染色完成； 4）菌株筛选：选择透明圈较大的菌株，即为希望得到的高产壳聚糖酶菌株。 2. 如权利要求 1 所述的筛选方法，其特征在于，步骤 1）所述胶体壳聚糖的浓度为 10g/ L-100g/L，其添加量为 1g/L-20g/L。 3. 如权利要求 1 或 2 所述的筛选方法，其特征在于，所述的胶体壳聚糖由乙酰度达到 75%以上的壳聚糖粉与12mol/L浓盐酸或冰乙酸按质量体积。

5、比5 ： 1-5 ： 3混合搅拌酸化后加水稀释获得。 4. 如权利要求 1 所述的筛选方法，其特征在于，步骤 1）所述的培养基为将其中的碳源物质替换成胶体壳聚糖的普通牛肉膏蛋白胨培养基或高氏一号培养基或查氏培养基。 5.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤1）所述培养基的灭菌方式为121 湿热灭菌 20min。 6. 如权利要求 1 所述的筛选方法，其特征在于，步骤 2）所述微生物样品为土壤、堆肥、垃圾、水体或微生物纯培养物样品。 7. 如权利要求 1 所述的筛选方法，其特征在于，步骤 2）所述微生物样品接种到筛选平板上的方法为悬浮后稀释涂布或直接稀。

6、释涂布。 8.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤2）所述的单菌落的培养时间为3-7 天。 9. 如权利要求 1 所述的筛选方法，其特征在于，步骤 3）所述固体碘为碘粉或碘颗粒。权利要求书 CN 104342371 A 2 1/4 页 3 一种产壳聚糖酶菌株的筛选方法技术领域 0001 本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种产壳聚糖酶菌株的筛选方法。背景技术 0002 壳聚糖酶是催化壳聚糖水解生产壳寡糖和氨基葡萄糖的关键酶，在生物农药、生物制药、精细化工等领域具有广阔的应用价值。现有壳聚糖酶的来源主要是通过微生物菌株发酵生产，因此，如何有效快速的筛。

7、选或选育高产壳聚糖酶的微生物菌株，对于壳聚糖酶的工业生产至关重要。目前，研究人员对于壳聚糖酶的筛选均采用如下方法：将普通牛肉膏蛋白胨培养基（筛选细菌）、高氏一号培养基（筛选放线菌）、查氏培养基（筛选霉菌）以及其它微生物培养基中的碳源物质（如糖类）替换成胶体壳聚糖，并调节培养基的 pH 5.0，使溶于水的胶体壳聚糖从溶液中析出形成不溶性壳聚糖沉淀，再将培养基灭菌倒制筛选平板，最后将待筛选的微生物样品稀释涂布于筛选平板上，通过培养，具有产壳聚糖酶能力的菌株会将壳聚糖酶分泌到单菌落周围，壳聚糖酶水解平板培养基中的壳聚糖沉淀，从而在筛选平板上形成。

8、透明圈，通过比较透明圈大小可以判断菌株产酶的能力。 0003 由于其所用培养基必需 pH 5.0，使得现有筛选方法存在一些缺陷：首先，壳聚糖在 pH 5.0 的环境中处于不溶于水的沉淀状态，这极易造成培养基中壳聚糖分布不均一，从而影响筛选结果的准确性。再者，在 pH 5.0 的环境中筛选得到的菌株所产壳聚糖酶多为中性酶或碱性酶，更适合于中性或碱性条件下水解壳聚糖。而壳聚糖只有在酸性条件下才能形成可溶于水的胶体状态，因而在工业生产中壳聚糖酶催化壳聚糖水解的反应基本都在酸性条件下进行。因此，工业应用中更需要在 pH 5.0 的酸性条件下具有高活力和高稳定性的酸性壳聚。

9、糖酶，而现有的筛选方法无法实现在 pH 5.0 的条件下在筛选平板上呈现壳聚糖酶水解可溶性胶体壳聚糖的反应情况，因而无法高效筛选高产酸性壳聚糖酶的菌株。发明内容 0004 本发明的目的是开发一种新型的产壳聚糖酶菌株的筛选方法，该方法能在 pH 5.0 的偏酸性培养环境下对产壳聚糖酶菌株进行快速筛选，针对性的获得高产酸性壳聚糖酶的优良菌株。 0005 本发明的技术方案：一种产壳聚糖酶菌株的筛选方法，包括以下步骤： 1）筛选平板的制备：将含胶体壳聚糖的培养基灭菌后倒制成筛选平板； 2）单菌落的培养：将微生物样品接种到筛选平板上培养，使平板上微生物单菌落的数。

10、为 30-100CFU/ 板； 3）平板染色：取可密封的容器，按 0.05-1g/L 的量向容器中散入纯度达到化学纯以上的固体碘，并将培养结束后的平板置于容器内，密封容器，于 28-40使碘升华对平板进行染色 30-60min，观察平板培养基主体被染成深红色后即染色完成；说明书 CN 104342371 A 3 2/4 页 4 4）菌株筛选：观察平板上各单菌落，选择透明圈较大的高产壳聚糖酶的菌株，以便后续生产或研究使用。 0006 优选的，所述胶体壳聚糖的浓度为 10g/L-100g/L，其添加量为 1g/L-20g/L。 0007 优选的，所述。

11、的胶体壳聚糖由乙酰度达到 75% 以上的壳聚糖粉与 12mol/L 浓盐酸或冰乙酸按质量体积比 5 ： 1-5 ： 3 混合，充分搅拌酸化后加水稀释获得。 0008 优选的，步骤 1）所述的培养基为将其中的碳源物质（如糖类）替换成胶体壳聚糖的普通牛肉膏蛋白胨培养基（筛选细菌）、高氏一号培养基（筛选放线菌）、查氏培养基（筛选霉菌）或将其中的碳源物质（如糖类）替换成胶体壳聚糖的其它微生物培养基。 0009 优选的，步骤 1）所述培养基的灭菌方式为 121湿热灭菌 20min。 0010 优选的，所述微生物样品为土壤、堆肥、垃圾、水体或微生物纯培养物等。

12、含有微生物活体细胞的样品。 0011 优选的，步骤 2）所述微生物样品接种到筛选平板上的方法为悬浮后稀释涂布或直接稀释涂布。 0012 优选的，步骤 2）所述单菌落的培养时间为 3-7 天。 0013 优选的，步骤 3）所述固体碘为碘粉或碘颗粒，更快捷、更均匀地对筛选平板进行染色。 0014 本发明优点：本方法操作简单、方便快捷，能够在 pH 5.0 的酸性条件下实现对产壳聚糖酶菌株的快速筛选，从而得到在酸性条件下具有高活力和高稳定性的酸性壳聚糖酶，为从自然界中筛选优良的酸性壳聚糖酶产生菌新菌株提供了技术保证，同时也可应用于已有产酸性壳聚糖酶菌株的进一。

13、步选育增产，对工业化生产壳聚糖酶技术水平的提高具有重要意义。 0015 具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种修改或改动，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 0016 实施例 1 产壳聚糖酶的筛选方法 1）筛选平板的制备： A、胶体壳聚糖的制备：采用市售脱乙酰度达到 75% 以上的壳聚糖粉，按质量体积比 5 ： 3加入12mol/L浓盐酸，充分搅拌酸化，加水溶解使壳聚糖浓度为10g/L，。

14、即得到相应浓度的胶体壳聚糖； B、筛选平板培养基的制备：选择普通牛肉膏蛋白胨培养基（筛选细菌），将所述培养基中的碳源（葡萄糖）替换为胶体壳聚糖，胶体壳聚糖的添加量为每升培养基中添加 1g ； C、筛选平板的制备：配制好的筛选平板培养基经 121湿热灭菌 20min 后，按微生物学基本操作中平板倒制的方法倒制成筛选平板。 0017 2）单菌落的培养：按微生物学基本操作中微生物样品的分离方法，将土壤样品制备成土壤悬浮液，逐级稀释后选取适合的浓度涂布于筛选平板上，确保平板上微生物单菌落数为 100CFU/ 板；培养 3 天，至平板上均匀长出达到。

15、要求数量的单菌落数，即可进行平板染色筛选。说明书 CN 104342371 A 4 3/4 页 5 0018 3）平板染色：取玻璃干燥器，容器容积要求为 20L，按 0.05g/L 的量向容器中均匀散入市售纯度达到化学纯以上的碘粉，将培养结束后的平板置于容器内，密封容器，于 40 使碘升华对平板进行染色 30min 后，观察平板培养基主体被染成深红色后即染色完成。 0019 4）菌株筛选：取出平板，观察平板上各单菌落，落周围如出现未被染上深红色的透明圈，即说明该菌落为产壳聚糖酶的菌株，产酶量与透明圈直径大小成正比，选择透明圈大的高产壳聚糖酶的菌。

16、株进行保藏，以便后续研究或生产使用。 0020 实施例 2 产壳聚糖酶的筛选方法 1）筛选平板的制备： A、胶体壳聚糖的制备：采用市售脱乙酰度达到75%以上的壳聚糖粉，按质量体积比5 ： 1 加入冰乙酸，充分搅拌酸化，加水溶解于壳聚糖浓度为 100g/L，即得到相应浓度的胶体壳聚糖； B、筛选平板培养基的制备：选择查氏培养基（筛选霉菌），将其中的碳源物质（葡萄糖）替换成胶体壳聚糖，其添加量为 20g/L ； C、筛选平板的制备：配制好的筛选平板培养基经 121湿热灭菌 20min 后，按微生物学基本操作中平板倒制的方法倒制成筛选平板。 002。

17、1 2）单菌落的培养：按微生物学基本操作中微生物样品的分离方法，将霉菌孢子样品制备成孢子悬浮液，逐级稀释后选取适合的浓度涂布于筛选平板上，确保平板上微生物单菌落数为30CFU/板；培养4天，至平板上均匀长出达到要求数量的单菌落数，即可进行平板染色筛选。 0022 3）平板染色：取密封储物盒，容器容积要求为 2L，按 1g/L 的量向容器中均匀散入市售纯度达到化学纯以上的碘颗粒，将培养结束后的平板置于容器内，密封容器，于 28使碘升华对平板进行染色 60min 后，观察平板培养基主体被染成深红色后即染色完成。 0023 4）菌株筛选：取出平板。

18、，观察平板上各单菌落，落周围如出现未被染上深红色的透明圈，即说明该菌落为产壳聚糖酶的菌株，产酶量与透明圈直径大小成正比，选择透明圈大的高产壳聚糖酶的菌株进行保藏，以便后续研究或生产使用。 0024 实施例 3 产壳聚糖酶的筛选方法 1）筛选平板的制备： A、胶体壳聚糖的制备：采用市售脱乙酰度达到75%以上的壳聚糖粉，按质量体积比5 ： 2 加入 12mol/L 盐酸，充分搅拌酸化，加水溶解于壳聚糖浓度为 80g/L, 即得到相应浓度的胶体壳聚糖； B、筛选平板培养基的制备：选择高氏一号培养基，将其中的碳源（可溶性淀粉）替换为胶体壳聚糖，其添加。

19、量为 5g/L ； C、筛选平板的制备：配制好的筛选平板培养基经 121湿热灭菌 20min 后，按微生物学基本操作中平板倒制的方法倒制成筛选平板。 0025 2）单菌落的培养：按微生物学基本操作中微生物样品的分离方法，将有机堆肥制备成悬浮液，逐级稀释后选取适合的浓度涂布于筛选平板上，确保平板上微生物单菌落数为50CFU/板；培养7天，至平板上均匀长出达到要求数量的单菌落数，即可进行平板染色筛选。 0026 3）平板染色：取玻璃干燥器，容器容积要求为 5L，按 0.075g/L 的量向容器中均匀说明书 CN 104342371 A 5 4/4。

20、页 6 散入市售纯度达到化学纯以上的碘粉，将培养结束后的平板置于容器内，密封容器，于 30 使碘升华对平板进行染色 55min 后，观察平板培养基主体被染成深红色后即染色完成。 0027 4）菌株筛选：取出平板，观察平板上各单菌落，落周围如出现未被染上深红色的透明圈，即说明该菌落为产壳聚糖酶的菌株，产酶量与透明圈直径大小成正比，选择透明圈大的高产壳聚糖酶的菌株进行保藏，以便后续研究或生产使用。 0028 实施例 4 产壳聚糖酶的筛选方法实施例 4 与实施例 2 的方法相似，其区别在于：壳聚糖与冰乙酸的质量体积比为 5:1.5，胶体壳聚糖的浓度为 55 。

21、g/L，培养基选用马丁氏培养基，将所述培养基中的碳源（葡萄糖）替换为胶体壳聚糖，其添加量为 10 g/L，微生物样品由海水稀释涂布获得，微生物单菌落数为45CFU/板，单菌落的培养时间为5天，染色用的容器容积为10L，所述碘为碘粉，用量为 0.06g/L，碘粉升华温度为 35，染色时间为 45 min。 0029 实施例 5 产壳聚糖酶的筛选方法实施例 5 与实施例 1 的方法相似，其区别在于：壳聚糖与盐酸的质量体积比为 2:1，胶体壳聚糖的浓度为20 g/L，培养基选用YPD培养基，将所述培养基中的碳源（葡萄糖）替换为胶体壳聚糖，胶体壳聚糖的添加量为 15 g/L，微生物样品由糖蜜酒精发酵液溶释涂布获得，微生物单菌落数为95CFU/板，培养时间为6天，染色用的容器容积为15L，所述碘为碘颗粒，用量为 0.08g/L，碘粉升华温度为 37，染色时间为 35 min。 0030 上述实施例的相关数据如下表所示说明书 CN 104342371 A 6 。

摘要
申请专利号：	CN201410523683.9	申请日：	2014.10.08
公开号：	CN104342371A	公开日：	2015.02.11
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C12N 1/00申请日:20141008\|\|\|公开
IPC分类号：	C12N1/00; C12Q1/04	主分类号：	C12N1/00
申请人：	广西壮族自治区农业科学院葡萄与葡萄酒研究所
发明人：	李玮; 张瑛; 周咏梅; 韦荣福; 时晓芳; 林玲; 曹雄军
地址：	530007广西壮族自治区南宁市大学东路174号
优先权：
专利代理机构：	深圳市科吉华烽知识产权事务所(普通合伙)44248	代理人：	胡吉科
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内容摘要

本发明提供一种产壳聚糖酶菌株的筛选方法，包括以下步骤：1）筛选平板的制备；2）单菌落的培养；3）平板染色；4）菌株筛选。本发明通过碘升华染色的方法，能够在pH≤5.0的酸性条件下通过平板培养法快速检测到壳聚糖酶对壳聚糖的水解反应（即透明圈的出现），进而根据透明圈的大小筛选出高产壳聚糖酶的菌株，筛选的得到的菌株能在酸性条件下良好生长并高效产生壳聚糖酶。本筛选方法为从自然界中筛选优良的酸性壳聚糖酶产生菌新菌株提供了技术保证，同时也可应用于已有酸性壳聚糖酶工业生产菌株的进一步选育增产，对工业化生产壳聚糖酶技术水平的提高具有重要意义。

权利要求书

权利要求书
1.  一种产壳聚糖酶菌株的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）筛选平板的制备：将含胶体壳聚糖的培养基灭菌后倒制成筛选平板；
2）单菌落的培养：将微生物样品接种到筛选平板上培养，使平板上的微生物单菌落数为30-100CFU/板；
3）平板染色：取可密封的容器，按0.05-1g/L的量向容器中散入纯度达到化学纯以上的固体碘，并将培养结束后的平板置于容器内，密封容器，于28-40℃使碘升华对平板进行染色30-60min，观察平板培养基主体被染成深红色后即染色完成；
4）菌株筛选：选择透明圈较大的菌株，即为希望得到的高产壳聚糖酶菌株。

2.  如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤1）所述胶体壳聚糖的浓度为10g/L-100g/L，其添加量为1g/L-20g/L。

3.  如权利要求1或2所述的筛选方法，其特征在于，所述的胶体壳聚糖由乙酰度达到75%以上的壳聚糖粉与12mol/L浓盐酸或冰乙酸按质量体积比5：1-5：3混合搅拌酸化后加水稀释获得。

4.  如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤1）所述的培养基为将其中的碳源物质替换成胶体壳聚糖的普通牛肉膏－蛋白胨培养基或高氏一号培养基或查氏培养基。

5.  如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤1）所述培养基的灭菌方式为121℃湿热灭菌20min。

6.  如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤2）所述微生物样品为土壤、堆肥、垃圾、水体或微生物纯培养物样品。

7.  如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤2）所述微生物样品接种到筛选平板上的方法为悬浮后稀释涂布或直接稀释涂布。

8.  如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤2）所述的单菌落的培养时间为3-7天。

9.  如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤3）所述固体碘为碘粉或碘颗粒。

说明书

说明书一种产壳聚糖酶菌株的筛选方法
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种产壳聚糖酶菌株的筛选方法。
背景技术
壳聚糖酶是催化壳聚糖水解生产壳寡糖和氨基葡萄糖的关键酶，在生物农药、生物制药、精细化工等领域具有广阔的应用价值。现有壳聚糖酶的来源主要是通过微生物菌株发酵生产，因此，如何有效快速的筛选或选育高产壳聚糖酶的微生物菌株，对于壳聚糖酶的工业生产至关重要。目前，研究人员对于壳聚糖酶的筛选均采用如下方法：将普通牛肉膏－蛋白胨培养基（筛选细菌）、高氏一号培养基（筛选放线菌）、查氏培养基（筛选霉菌）以及其它微生物培养基中的碳源物质（如糖类）替换成胶体壳聚糖，并调节培养基的pH≥5.0，使溶于水的胶体壳聚糖从溶液中析出形成不溶性壳聚糖沉淀，再将培养基灭菌倒制筛选平板，最后将待筛选的微生物样品稀释涂布于筛选平板上，通过培养，具有产壳聚糖酶能力的菌株会将壳聚糖酶分泌到单菌落周围，壳聚糖酶水解平板培养基中的壳聚糖沉淀，从而在筛选平板上形成透明圈，通过比较透明圈大小可以判断菌株产酶的能力。
由于其所用培养基必需pH≥5.0，使得现有筛选方法存在一些缺陷：首先，壳聚糖在pH≥5.0的环境中处于不溶于水的沉淀状态，这极易造成培养基中壳聚糖分布不均一，从而影响筛选结果的准确性。再者，在pH≥5.0的环境中筛选得到的菌株所产壳聚糖酶多为中性酶或碱性酶，更适合于中性或碱性条件下水解壳聚糖。而壳聚糖只有在酸性条件下才能形成可溶于水的胶体状态，因而在工业生产中壳聚糖酶催化壳聚糖水解的反应基本都在酸性条件下进行。因此，工业应用中更需要在pH＜5.0的酸性条件下具有高活力和高稳定性的酸性壳聚糖酶，而现有的筛选方法无法实现在pH＜5.0的条件下在筛选平板上呈现壳聚糖酶水解可溶性胶体壳聚糖的反应情况，因而无法高效筛选高产酸性壳聚糖酶的菌株。
发明内容
本发明的目的是开发一种新型的产壳聚糖酶菌株的筛选方法，该方法能在pH≤5.0的偏酸性培养环境下对产壳聚糖酶菌株进行快速筛选，针对性的获得高产酸性壳聚糖酶的优良菌株。
本发明的技术方案：一种产壳聚糖酶菌株的筛选方法，包括以下步骤：
1）筛选平板的制备：
将含胶体壳聚糖的培养基灭菌后倒制成筛选平板；
2）单菌落的培养：将微生物样品接种到筛选平板上培养，使平板上微生物单菌落的数为30-100CFU/板；
3）平板染色：取可密封的容器，按0.05-1g/L的量向容器中散入纯度达到化学纯以上的固体碘，并将培养结束后的平板置于容器内，密封容器，于28-40℃使碘升华对平板进行染色30-60min，观察平板培养基主体被染成深红色后即染色完成；
4）菌株筛选：观察平板上各单菌落，选择透明圈较大的高产壳聚糖酶的菌株，以便后续生产或研究使用。
优选的，所述胶体壳聚糖的浓度为10g/L-100g/L，其添加量为1g/L-20g/L。
优选的，所述的胶体壳聚糖由乙酰度达到75%以上的壳聚糖粉与12mol/L浓盐酸或冰乙酸按质量体积比5：1-5：3混合，充分搅拌酸化后加水稀释获得。
优选的，步骤1）所述的培养基为将其中的碳源物质（如糖类）替换成胶体壳聚糖的普通牛肉膏－蛋白胨培养基（筛选细菌）、高氏一号培养基（筛选放线菌）、查氏培养基（筛选霉菌）或将其中的碳源物质（如糖类）替换成胶体壳聚糖的其它微生物培养基。
优选的，步骤1）所述培养基的灭菌方式为121℃湿热灭菌20min。
优选的，所述微生物样品为土壤、堆肥、垃圾、水体或微生物纯培养物等含有微生物活体细胞的样品。
优选的，步骤2）所述微生物样品接种到筛选平板上的方法为悬浮后稀释涂布或直接稀释涂布。
优选的，步骤2）所述单菌落的培养时间为3-7天。
优选的，步骤3）所述固体碘为碘粉或碘颗粒，更快捷、更均匀地对筛选平板进行染色。
本发明优点：本方法操作简单、方便快捷，能够在pH≤5.0的酸性条件下实现对产壳聚糖酶菌株的快速筛选，从而得到在酸性条件下具有高活力和高稳定性的酸性壳聚糖酶，为从自然界中筛选优良的酸性壳聚糖酶产生菌新菌株提供了技术保证，同时也可应用于已有产酸性壳聚糖酶菌株的进一步选育增产，对工业化生产壳聚糖酶技术水平的提高具有重要意义。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种修改或改动，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1  产壳聚糖酶的筛选方法
1）筛选平板的制备：
A、胶体壳聚糖的制备：采用市售脱乙酰度达到75%以上的壳聚糖粉，按质量体积比5：3加入12mol/L浓盐酸，充分搅拌酸化，加水溶解使壳聚糖浓度为10g/L，即得到相应浓度的胶体壳聚糖；
B、筛选平板培养基的制备：选择普通牛肉膏－蛋白胨培养基（筛选细菌），将所述培养基中的碳源（葡萄糖）替换为胶体壳聚糖，胶体壳聚糖的添加量为每升培养基中添加1g；
C、筛选平板的制备：配制好的筛选平板培养基经121℃湿热灭菌20min后，按微生物学基本操作中平板倒制的方法倒制成筛选平板。
2）单菌落的培养：按微生物学基本操作中微生物样品的分离方法，将土壤样品制备成土壤悬浮液，逐级稀释后选取适合的浓度涂布于筛选平板上，确保平板上微生物单菌落数为100CFU/板；培养3天，至平板上均匀长出达到要求数量的单菌落数，即可进行平板染色筛选。
3）平板染色：取玻璃干燥器，容器容积要求为20L，按0.05g/L的量向容器中均匀散入市售纯度达到化学纯以上的碘粉，将培养结束后的平板置于容器内，密封容器，于40℃使碘升华对平板进行染色30min后，观察平板培养基主体被染成深红色后即染色完成。
4）菌株筛选：取出平板，观察平板上各单菌落，落周围如出现未被染上深红色的透明圈，即说明该菌落为产壳聚糖酶的菌株，产酶量与透明圈直径大小成正比，选择透明圈大的高产壳聚糖酶的菌株进行保藏，以便后续研究或生产使用。
实施例2  产壳聚糖酶的筛选方法
1）筛选平板的制备：
A、胶体壳聚糖的制备：采用市售脱乙酰度达到75%以上的壳聚糖粉，按质量体积比5：1加入冰乙酸，充分搅拌酸化，加水溶解于壳聚糖浓度为100g/L，即得到相应浓度的胶体壳聚糖；
B、筛选平板培养基的制备：选择查氏培养基（筛选霉菌），将其中的碳源物质（葡萄糖）替换成胶体壳聚糖，其添加量为20g/L；
C、筛选平板的制备：配制好的筛选平板培养基经121℃湿热灭菌20min后，按微生物学基本操作中平板倒制的方法倒制成筛选平板。
2）单菌落的培养：按微生物学基本操作中微生物样品的分离方法，将霉菌孢子样品制备成孢子悬浮液，逐级稀释后选取适合的浓度涂布于筛选平板上，确保平板上微生物单菌落数为30CFU/板；培养4天，至平板上均匀长出达到要求数量的单菌落数，即可进行平板染色筛选。
3）平板染色：取密封储物盒，容器容积要求为2L，按1g/L的量向容器中均匀散入市售纯度达到化学纯以上的碘颗粒，将培养结束后的平板置于容器内，密封容器，于28℃使碘升华对平板进行染色60min后，观察平板培养基主体被染成深红色后即染色完成。
4）菌株筛选：取出平板，观察平板上各单菌落，落周围如出现未被染上深红色的透明圈，即说明该菌落为产壳聚糖酶的菌株，产酶量与透明圈直径大小成正比，选择透明圈大的高产壳聚糖酶的菌株进行保藏，以便后续研究或生产使用。
实施例3  产壳聚糖酶的筛选方法
1）筛选平板的制备：
A、胶体壳聚糖的制备：采用市售脱乙酰度达到75%以上的壳聚糖粉，按质量体积比5：2加入12mol/L盐酸，充分搅拌酸化，加水溶解于壳聚糖浓度为80g/L,即得到相应浓度的胶体壳聚糖；
B、筛选平板培养基的制备：选择高氏一号培养基，将其中的碳源（可溶性淀粉）替换为胶体壳聚糖，其添加量为5g/L；
C、筛选平板的制备：配制好的筛选平板培养基经121℃湿热灭菌20min后，按微生物学基本操作中平板倒制的方法倒制成筛选平板。
2）单菌落的培养：按微生物学基本操作中微生物样品的分离方法，将有机堆肥制备成悬浮液，逐级稀释后选取适合的浓度涂布于筛选平板上，确保平板上微生物单菌落数为50CFU/板；培养7天，至平板上均匀长出达到要求数量的单菌落数，即可进行平板染色筛选。
3）平板染色：取玻璃干燥器，容器容积要求为5L，按0.075g/L的量向容器中均匀散入市售纯度达到化学纯以上的碘粉，将培养结束后的平板置于容器内，密封容器，于30℃使碘升华对平板进行染色55min后，观察平板培养基主体被染成深红色后即染色完成。
4）菌株筛选：取出平板，观察平板上各单菌落，落周围如出现未被染上深红色的透明圈，即说明该菌落为产壳聚糖酶的菌株，产酶量与透明圈直径大小成正比，选择透明圈大的高产壳聚糖酶的菌株进行保藏，以便后续研究或生产使用。
实施例4  产壳聚糖酶的筛选方法
实施例4与实施例2的方法相似，其区别在于：壳聚糖与冰乙酸的质量体积比为5:1.5，胶体壳聚糖的浓度为55 g/L，培养基选用马丁氏培养基，将所述培养基中的碳源（葡萄糖）替换为胶体壳聚糖，其添加量为10 g/L，微生物样品由海水稀释涂布获得，微生物单菌落数为45CFU/板，单菌落的培养时间为5天，染色用的容器容积为10L，所述碘为碘粉，用量为0.06g/L，碘粉升华温度为35℃，染色时间为45 min。
实施例5  产壳聚糖酶的筛选方法
实施例5与实施例1的方法相似，其区别在于：壳聚糖与盐酸的质量体积比为2:1，胶体壳聚糖的浓度为20 g/L，培养基选用YPD培养基，将所述培养基中的碳源（葡萄糖）替换为胶体壳聚糖，胶体壳聚糖的添加量为15 g/L，微生物样品由糖蜜酒精发酵液溶释涂布获得，微生物单菌落数为95CFU/板，培养时间为6天，染色用的容器容积为15L，所述碘为碘颗粒，用量为0.08g/L，碘粉升华温度为37℃，染色时间为35 min。
上述实施例的相关数据如下表所示