《高产吲哚3乙酸的重组细胞及其构建方法与应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《高产吲哚3乙酸的重组细胞及其构建方法与应用.pdf（19页完整版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410675072.6 (22)申请日 2014.11.21 C12N 1/21(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C07K 14/00(2006.01) C12P 17/10(2006.01) (71)申请人 中国农业科学院农业资源与农业区 划研究所 地址 100081 北京市海淀区中关村南大街 12 号中国农业科学院农业资源与农业 区划研究所 (72)发明人 张瑞福 邵佳慧 张楠 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 任凤华 (54) 发明名称 高产吲哚 -3- 。
2、乙酸的重组细胞及其构建方法 与应用 (57) 摘要 本发明公开了高产吲哚 -3- 乙酸的重组细胞 及其构建方法。采用本申请的重组细胞的构建 方法构建的重组解淀粉芽孢杆菌菌株 SQR9-E 和 重组枯草芽孢杆菌菌株 168-E 均能够表达出吲 哚 -3- 乙酸合成相关蛋白 A、 吲哚 -3- 乙酸合成相 关蛋白 B 和吲哚 -3- 乙酸合成相关蛋白 C 这三种 蛋白质。重组菌株 SQR9-E 和 168-E 中吲哚 -3- 乙 酸的产量均高于每株菌株的对照。本发明的高产 吲哚 -3- 乙酸的重组细胞及其构建方法可以有效 提高重组菌株中吲哚 -3- 乙酸的产量， 可广泛应 用于农业生产领域。 (5。
3、1)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书8页 序列表7页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104388369 A (43)申请公布日 2015.03.04 CN 104388369 A 1/2 页 2 1. 重组细胞的构建方法， 包括向受体细胞中导入用于制备吲哚 -3- 乙酸的 DNA 得到高 产吲哚 -3- 乙酸的重组细胞 ； 所述用于制备吲哚 -3- 乙酸的 DNA 编码吲哚 -3- 乙酸合成相 关蛋白 A、 吲哚 -3- 乙酸合成相关蛋白 B 和吲哚 -3- 乙酸合成相关蛋白 C 这三种蛋白质 ； 所述吲哚 -3- 乙酸合。
4、成相关蛋白 A 为下述 A1) 或 A2) 的蛋白质 ： A1) 氨基酸序列如 SEQ ID No.3 所示的蛋白质 ； A2) 在 A1) 的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和 / 或缺失和 / 或添加一个或几个氨基 酸残基得到的具有相同功能的由 A1) 衍生的蛋白质 ； 所述吲哚 -3- 乙酸合成相关蛋白 B 为下述 B1) 或 B2) 的蛋白质 ： B1) 氨基酸序列如 SEQ ID No.4 所示的蛋白质 ； B2) 在 B1) 的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和 / 或缺失和 / 或添加一个或几个氨基 酸残基得到的具有相同功能的由 B1) 衍生的蛋白质 ； 所述吲哚 -3- 乙酸合成相关蛋。
5、白 C 为下述 C1) 或 C2) 的蛋白质 ： C1) 氨基酸序列如 SEQ ID No.5 所示的蛋白质 ； C2) 在 C1) 的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和 / 或缺失和 / 或添加一个或几个氨基 酸残基得到的具有相同功能的由 C1) 衍生的蛋白质 ； 所述受体细胞为微生物细胞、 非人动物细胞或植物细胞。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 所述用于制备吲哚 -3- 乙酸的 DNA， 由吲 哚 -3- 乙酸合成相关基因 1、 吲哚 -3- 乙酸合成相关基因 2 和吲哚 -3- 乙酸合成相关基因 3 连接而成 ； 所述吲哚 -3- 乙酸合成相关基因 1 编码权利要求 。
6、1 所述吲哚 -3- 乙酸合成相关 蛋白A ； 所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2编码权利要求1所述吲哚-3-乙酸合成相关蛋白 B ； 所述吲哚 -3- 乙酸合成相关基因 3 编码权利要求 1 所述吲哚 -3- 乙酸合成相关蛋白 C。 3.根据权利要求1或2所述的方法， 其特征在于 ： 所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1为 如下 A11) 或 A12) 或 A13) 所示的核酸分子 ： A11) 其编码序列是 SEQ ID No.1 的第 1-1164 位核苷酸所示的 DNA 分子或 cDNA 分子 ； A12) 与 A11) 限定的核苷酸序列具有 75或 75以上同一性， 且编码所述吲哚 -3-。
7、 乙 酸合成相关蛋白 A 的 cDNA 分子或基因组 DNA 分子 ； A13)在严格条件下与A11)限定的核苷酸序列杂交， 且编码所述吲哚-3-乙酸合成相关 蛋白 A 的 cDNA 分子或基因组 DNA 分子 ； 所述吲哚 -3- 乙酸合成相关基因 2 为如下 B11) 或 B12) 或 B13) 所示的核酸分子 ： B11) 其编码序列是 SEQ ID No.1 的第 1165-2586 位核苷酸所示的 DNA 分子或 cDNA 分 子 ； B12) 与 B11) 限定的核苷酸序列具有 75或 75以上同一性， 且编码所述吲哚 -3- 乙 酸合成相关蛋白 B 的 cDNA 分子或基因组 D。
8、NA 分子 ； B13)在严格条件下与B11)限定的核苷酸序列杂交， 且编码所述吲哚-3-乙酸合成相关 蛋白 B 的 cDNA 分子或基因组 DNA 分子 ； 所述吲哚 -3- 乙酸合成相关基因 3 为如下 C11) 或 C12) 或 C13) 所示的核酸分子 ： C11) 其编码序列是 SEQ ID No.1 的第 2587-4074 位核苷酸所示的 DNA 分子或 cDNA 分 子 ； C12) 与 C11) 限定的核苷酸序列具有 75或 75以上同一性， 且编码所述吲哚 -3- 乙 权 利 要 求 书 CN 104388369 A 2 2/2 页 3 酸合成相关蛋白 C 的 cDNA 分。
9、子或基因组 DNA 分子 ； C13)在严格条件下与C11)限定的核苷酸序列杂交， 且编码所述吲哚-3-乙酸合成相关 蛋白 C 的 cDNA 分子或基因组 DNA 分子。 4. 根据权利要求 1 或 2 或 3 所述的方法， 其特征在于 ： 所述用于制备吲哚 -3- 乙酸的 DNA 为如下 D1) 或 D2) 或 D3) 所示的核酸分子 ： D1) 核苷酸序列是 SEQ ID No.1 的 DNA 分子或 cDNA 分子 ； D2) 与 D1) 限定的核苷酸序列具有 75或 75以上同一性， 且编码权利要求 1 所述的 吲哚-3-乙酸合成相关蛋白A、 权利要求1所述的吲哚-3-乙酸合成相关蛋白。
10、B和权利要求 1 所述的吲哚 -3- 乙酸合成相关蛋白 C 这三种蛋白质的 cDNA 分子或基因组 DNA 分子 ； D3)在严格条件下与D1)限定的核苷酸序列杂交， 且编码权利要求1所述的吲哚-3-乙 酸合成相关蛋白A、 权利要求1所述的吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B和权利要求1所述的吲 哚 -3- 乙酸合成相关蛋白 C 这三种蛋白质的 cDNA 分子或基因组 DNA 分子。 5. 重组细胞的构建方法， 包括对受体细胞进行 S1)、 S2) 和 S3) 的改造得到产吲 哚 -3- 乙酸的重组细胞的步骤 ： S1) 向所述受体细胞中导入权利要求 2 或 3 所述的吲哚 -3- 乙酸合成相关基因 。
11、1 ； S2) 向所述受体细胞中导入权利要求 2 或 3 所述的吲哚 -3- 乙酸合成相关基因 2 ； S3) 向所述受体细胞中导入权利要求 2 或 3 所述的吲哚 -3- 乙酸合成相关基因 3。 6. 根据权利要求 1 至 5 中任一所述的方法， 其特征在于 ： 所述微生物细胞为细菌。 7. 根据权利要求 6 所述的方法， 其特征在于 ： 所述细菌为革兰氏阳性细菌或革兰氏阴 性细菌。 8. 根据权利要求 7 所述的方法， 其特征在于 ： 所述革兰氏阳性细菌为芽孢杆菌属细菌 ； 进一步所述芽孢杆菌属细菌为解淀粉芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌 ； 所述革兰氏阴性细菌为埃 希氏菌属细菌 ； 进一步所述埃希。
12、氏菌属细菌为大肠杆菌。 9. 由权利要求 1 至 8 中任一所述的方法构建的重组细胞。 10.权利要求1至8中任一所述的方法在制备吲哚-3-乙酸中的应用， 或权利要求9所 述的重组细胞在制备吲哚 -3- 乙酸中的应用。 权 利 要 求 书 CN 104388369 A 3 1/8 页 4 高产吲哚 -3- 乙酸的重组细胞及其构建方法与应用 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域中高产吲哚 -3- 乙酸的重组细胞及其构建方法与应用。 背景技术 0002 吲哚 -3- 乙酸 (Indole-3-acetic acid， 简称 IAA) 是一类含有一个不饱和芳香族 环和一个乙酸侧链的内源激素， 。
13、属吲哚类化合物， 又名茁长素、 生长素、 异生长素。现已证 实， 吲哚 -3- 乙酸存在于细菌、 真菌、 藻类和许多高等植物中。在高等植物中 , 它主要存在 于生长旺盛的部位 , 如胚芽鞘、 根尖、 受精后的子房和幼嫩的种子等。虽然在植物体内含量 甚微 , 但参与了许多生理生化过程的调节与控制 , 具有十分广泛的生理作用。从细胞水平 看,它可以影响细胞的伸长、 分裂和分化 ； 从器官水平看,它可以影响营养器官和生殖器官 的生长、 成熟和衰老。吲哚 -3- 乙酸的基本作用在于调节植物的生长， 不仅能促进生长， 而 且具有抑制生长和器官建成的作用。吲哚 -3- 乙酸在农业生产领域具有广泛的用途， 。
14、它能 促进植物生根， 提高农作物产量 ； 用于木本和草本植物的扦插 ( 插枝 ) 生根， 以加速根的形 成和提高植株生根的百分率。 0003 微生物具有体积小、 结构简单、 生长繁殖快、 代谢旺盛等特征， 如能得到高效合成 吲哚 -3- 乙酸的微生物， 将为吲哚 -3- 乙酸的生产提供新的途径。 发明内容 0004 本发明所要解决的技术问题是如何利用微生物生物合成吲哚 -3- 乙酸。 0005 为解决上述技术问题， 本发明首先提供了一种重组细胞的构建方法。 0006 本发明所提供的重组细胞的构建方法， 包括向受体细胞中导入用于生物合成吲 哚-3-乙酸的DNA得到产吲哚-3-乙酸的重组细胞 ； 。
15、所述用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA 编码吲哚-3-乙酸合成相关蛋白A、 吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B和吲哚-3-乙酸合成相关 蛋白 C 这三种蛋白质 ； 0007 所述吲哚 -3- 乙酸合成相关蛋白 A 为下述 A1) 或 A2) 的蛋白质 ： 0008 A1) 氨基酸序列如 SEQ ID No.3 所示的蛋白质 ； 0009 A2) 在 A1) 的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和 / 或缺失和 / 或添加一个或几个 氨基酸残基得到的具有相同功能的由 A1) 衍生的蛋白质 ； 0010 所述吲哚 -3- 乙酸合成相关蛋白 B 为下述 B1) 或 B2) 的蛋白质 ： 0011 B1) 氨基酸。
16、序列如 SEQ ID No.4 所示的蛋白质 ； 0012 B2) 在 B1) 的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和 / 或缺失和 / 或添加一个或几个 氨基酸残基得到的具有相同功能的由 B1) 衍生的蛋白质 ； 0013 所述吲哚 -3- 乙酸合成相关蛋白 C 为下述 C1) 或 C2) 的蛋白质 ： 0014 C1) 氨基酸序列如 SEQ ID No.5 所示的蛋白质 ； 0015 C2) 在 C1) 的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和 / 或缺失和 / 或添加一个或几个 氨基酸残基得到的具有相同功能的由 C1) 衍生的蛋白质 ； 说 明 书 CN 104388369 A 4 2/8 页 5 0。
17、016 所述受体细胞为微生物细胞、 非人动物细胞或植物细胞。 0017 所述用于生物合成吲哚 -3- 乙酸的 DNA， 由吲哚 -3- 乙酸合成相关基因 1、 吲 哚 -3- 乙酸合成相关基因 2 和吲哚 -3- 乙酸合成相关基因 3 连接而成 ； 所述吲哚 -3- 乙酸 合成相关基因 1 编码所述吲哚 -3- 乙酸合成相关蛋白 A ； 所述吲哚 -3- 乙酸合成相关基因 2 编码所述吲哚 -3- 乙酸合成相关蛋白 B ； 所述吲哚 -3- 乙酸合成相关基因 3 编码所述吲 哚 -3- 乙酸合成相关蛋白 C。 0018 所述吲哚 -3- 乙酸合成相关基因 1 为如下 A11) 或 A12) 或。
18、 A13) 所示的核酸分子 ： 0019 A11)其编码序列是SEQ ID No.1的第1-1164位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分 子 ； 0020 A12) 与 A11) 限定的核苷酸序列具有 75或 75以上同一性， 且编码所述吲 哚 -3- 乙酸合成相关蛋白 A 的 cDNA 分子或基因组 DNA 分子 ； 0021 A13)在严格条件下与A11)限定的核苷酸序列杂交， 且编码所述吲哚-3-乙酸合成 相关蛋白 A 的 cDNA 分子或基因组 DNA 分子 ； 0022 所述吲哚 -3- 乙酸合成相关基因 2 为如下 B11) 或 B12) 或 B13) 所示的核酸分子 ： 0023。
19、 B11)其编码序列是SEQ ID No.1的第1165-2586位核苷酸所示的DNA分子或cDNA 分子 ； 0024 B12) 与 B11) 限定的核苷酸序列具有 75或 75以上同一性， 且编码所述吲 哚 -3- 乙酸合成相关蛋白 B 的 cDNA 分子或基因组 DNA 分子 ； 0025 B13)在严格条件下与B11)限定的核苷酸序列杂交， 且编码所述吲哚-3-乙酸合成 相关蛋白 B 的 cDNA 分子或基因组 DNA 分子 ； 0026 所述吲哚 -3- 乙酸合成相关基因 3 为如下 C11) 或 C12) 或 C13) 所示的核酸分子 ： 0027 C11)其编码序列是SEQ ID。
20、 No.1的第2587-4074位核苷酸所示的DNA分子或cDNA 分子 ； 0028 C12) 与 C11) 限定的核苷酸序列具有 75或 75以上同一性， 且编码所述吲 哚 -3- 乙酸合成相关蛋白 C 的 cDNA 分子或基因组 DNA 分子 ； 0029 C13)在严格条件下与C11)限定的核苷酸序列杂交， 且编码所述吲哚-3-乙酸合成 相关蛋白 C 的 cDNA 分子或基因组 DNA 分子。 0030 所述用于生物合成吲哚 -3- 乙酸的 DNA 为如下 D1) 或 D2) 或 D3) 所示的核酸分 子 ： 0031 D1) 核苷酸序列是 SEQ ID No.1 的 DNA 分子或 。
21、cDNA 分子 ； 0032 D2) 与 D1) 限定的核苷酸序列具有 75或 75以上同一性， 且编码所述的吲 哚-3-乙酸合成相关蛋白A、 所述的吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B和所述的吲哚-3-乙酸合 成相关蛋白 C 这三种蛋白质的 cDNA 分子或基因组 DNA 分子 ； 0033 D3) 在严格条件下与 D1) 限定的核苷酸序列杂交， 且编码所述的吲哚 -3- 乙酸合 成相关蛋白 A、 所述的吲哚 -3- 乙酸合成相关蛋白 B 和所述的吲哚 -3- 乙酸合成相关蛋白 C 这三种蛋白质的 cDNA 分子或基因组 DNA 分子。 0034 上述用于生物合成吲哚 -3- 乙酸的 DNA， 本领。
22、域普通技术人员可以很容易地采 用已知的方法， 例如定向进化和点突变的方法， 对本发明的用于生物合成吲哚 -3- 乙酸的 DNA 的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的， 与本发明分离得到的用于生物合成吲 说 明 书 CN 104388369 A 5 3/8 页 6 哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列具有75或者更高同一性且编码所述吲哚-3-乙酸合成相 关蛋白A、 所述吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B和所述吲哚-3-乙酸合成相关蛋白C这三种蛋 白质， 均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。 0035 这里使用的术语 “同一性” 指与天然核酸序列的序列相似性。 “同一性” 包括与本 发明。
23、的 SEQ ID No.1 具有 75或更高， 或 85或更高， 或 90或更高， 或 95或更高同一 性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件， 两个或多 个序列之间的同一性可以用百分比 ( ) 表示， 其可以用来评价相关序列之间的同一性。 0036 上述用于生物合成吲哚 -3- 乙酸的 DNA， 所述严格条件是在 2SSC， 0.1 SDS 的 溶液中， 在 68下杂交并洗膜 2 次， 每次 5min， 又于 0.5SSC， 0.1 SDS 的溶液中， 在 68 下杂交并洗膜 2 次， 每次 15min。 0037 上述 75或 75以上同一性， 可为 80、 。
24、85、 90或 95以上的同一性。 0038 为解决上述技术问题， 本发明还提供了一种重组细胞的构建方法。 0039 本发明所提供的重组细胞的构建方法， 包括对受体细胞进行 S1)、 S2) 和 S3) 的改 造得到高产吲哚 -3- 乙酸的重组细胞的步骤 ： 0040 S1) 向所述受体细胞中导入所述的吲哚 -3- 乙酸合成相关基因 1 ； 0041 S2) 向所述受体细胞中导入所述的吲哚 -3- 乙酸合成相关基因 2 ； 0042 S3) 向所述受体细胞中导入所述的吲哚 -3- 乙酸合成相关基因 3。 0043 本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法， 例如定向进化和点突变的方 法， 。
25、对本发明的吲哚-3-乙酸合成相关基因1或吲哚-3-乙酸合成相关基因2或吲哚-3-乙 酸合成相关基因 3 的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的， 与本发明分离得到的 吲哚 -3- 乙酸合成相关基因 1 的核苷酸序列具有 75或者更高同一性且编码所述的吲 哚 -3- 乙酸合成相关蛋白 A， 或与吲哚 -3- 乙酸合成相关基因 2 的核苷酸序列具有 75或 者更高同一性且编码所述的吲哚 -3- 乙酸合成相关蛋白 B， 或与吲哚 -3- 乙酸合成相关基 因 3 的核苷酸序列具有 75或者更高同一性且编码所述的吲哚 -3- 乙酸合成相关蛋白 C， 均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。。
26、 0044 这里使用的术语 “同一性” 指与天然核酸序列的序列相似性。 “同一性” 包括与本发 明的 SEQ ID No.1 的第 1-1164 位核苷酸所示的 DNA 分子或 cDNA 分子具有 75或更高， 或 85或更高， 或 90或更高， 或 95或更高同一性的核苷酸序列 ； 与本发明的 SEQID No.1 的第 1165-2586 位核苷酸所示的 DNA 分子或 cDNA 分子具有 75或更高， 或 85或更高， 或 90或更高， 或95或更高同一性的核苷酸序列 ； 与本发明的SEQ ID No.1的第2587-4074 位核苷酸所示的 DNA 分子或 cDNA 分子具有 75或更。
27、高， 或 85或更高， 或 90或更高， 或 95或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机 软件， 两个或多个序列之间的同一性可以用百分比 ( ) 表示， 其可以用来评价相关序列之 间的同一性。 0045 所述严格条件是在 2SSC， 0.1 SDS 的溶液中， 在 68下杂交并洗膜 2 次， 每次 5min， 又于 0.5SSC， 0.1 SDS 的溶液中， 在 68下杂交并洗膜 2 次， 每次 15min。 0046 上述 75或 75以上同一性， 可为 80、 85、 90或 95以上的同一性。 0047 上文中， 所述微生物可为细菌。所述细菌可为革兰氏。
28、阳性细菌或革兰氏阴性细 菌。所述革兰氏阳性细菌可为芽孢杆菌属细菌。所述革兰氏阴性细菌可为埃希氏菌属细 说 明 书 CN 104388369 A 6 4/8 页 7 菌。进一步所述芽孢杆菌属细菌为解淀粉芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌。所述埃希氏菌属细菌 可为大肠杆菌 (Escherichia coli)。所述解淀粉芽孢杆菌可为解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens)SQR9、 枯 草 芽 孢 杆 菌 (Bacillus subtilis)168 和 所 述 大 肠 杆 菌 (Escherichia coli) 可为大肠杆菌 (Escherichia coli)BL21。 。
29、0048 由上述重组细胞的构建方法构建的重组细胞也属于本发明保护的范围。 0049 上述重组细胞的构建方法和上述重组细胞在生物合成吲哚 -3- 乙酸中的应用也 属于本发明的保护范围。 0050 所述应用中， 所述重组细胞以色氨酸为底物生产吲哚 -3- 乙酸。 0051 实验证明， 采用本申请的重组细胞的构建方法构建的重组解淀粉芽孢杆菌菌 株 SQR9-E 和重组枯草芽孢杆菌菌株 168-E 均能够表达吲哚 -3- 乙酸合成相关蛋白 A、 吲 哚 -3- 乙酸合成相关蛋白 B 和吲哚 -3- 乙酸合成相关蛋白 C 这三种蛋白质。SQR9-E 菌株的 吲哚 -3- 乙酸的产量是其受体菌株 SQR9。
30、 菌株的 4.2 倍， 是空载体对照菌株 SQR9-CK 菌株的 4 倍 (SQR9-E 菌株的吲哚 -3- 乙酸产量为 422.41mg/L 发酵液 ,SQR9 菌株的吲哚 -3- 乙 酸产量为 9.81.31mg/L 发酵液， SQR9-CK 菌株的吲哚 -3- 乙酸产量为 10.51.08mg/L 发 酵液 ) ； 168-E 菌株的吲哚 -3- 乙酸的产量是其受体菌株 168 菌株的 10 倍， 是空载体对照 菌株 168-CK 菌株的 10 倍 (168-E 菌株的吲哚 -3- 乙酸产量为 222.32mg/L 发酵液 ,168 菌株的吲哚 -3- 乙酸产量为 2.20.30mg/L。
31、 发酵液， 168-CK 菌株的吲哚 -3- 乙酸产量为 2.20.26mg/L 发酵液 )。本发明的高产吲哚 -3- 乙酸的重组细胞及其构建方法可以有效 提高重组菌株中吲哚 -3- 乙酸的产量， 可广泛应用于农业生产领域。 附图说明 0052 图 1 为重组载体 pUBC19-P43-E 示意图。 0053 图 2 为重组菌株蛋白差异分析的变性聚丙烯酰胺凝胶。泳道 1 和泳道 8 为蛋白分 子量标准 15-170KDa 的 Ladder， 泳道 2 为 168-CK 菌株蛋白条带， 泳道 3 为 168-E 菌株蛋白 条带， 泳道 4 为 BL21-CK 菌株蛋白条带， 泳道 5 为 BL2。
32、1-E 菌株蛋白条带， 泳道 6 为 SQR9-CK 菌株蛋白条带， 泳道 7 为 SQR9-E 菌株蛋白条带。 具体实施方式 0054 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述， 给出的实施例仅为了阐 明本发明， 而不是为了限制本发明的范围。 0055 下述实施例中的实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 0056 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0057 下述实施例中的解淀粉芽孢杆菌 SQR9(Bacillus amyloliquefaciens SQR9)(Xu Z,Shao J,Li B,Yan X,Shen Q,Zhang R.2。
33、013.Contribution of Baci llomycin D in Bacillus amyloliquefaciens SQR9 to Antifungal Activity and Biofi lm Formation. Appl.Environ.Microbiol.79:808815.) 公众可从中国农业科学院农业资源与农业区划 研究所获得， 该生物材料只为重复本发明的相关实验所用， 不可作为其它用途使用。 解淀粉 芽孢杆菌 SQR9(Bacillus amyloliquefaciens SQR9) 在下文中简称 SQR9。 0058 下 述 实 施 例 中 的 枯 草 芽 孢。
34、 杆 菌 168(Bacillus subtilis 168)(Kunst 说 明 书 CN 104388369 A 7 5/8 页 8 F,Ogasawara N,Moszer I,etal.1997.The complete genome sequence of the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis.Nature 390:249256.) 公众可从中国农 业科学院农业资源与农业区划研究所获得， 该生物材料只为重复本发明的相关实验所用， 不可作为其它用途使用。枯草芽孢杆菌 168(Bacillus subtilis 168) 在下文中简称。
35、 168。 0059 下述实施例中的 pUBC19(Zhang X-Z,Cui Z-L,Hong Q,Li S-P.2005.High-Level Expression and Secretion of Methyl Parathion Hydrolase in Bacillus subtilis WB800.Appl.Environ.Microbiol.71:41014103.) 公众可从中国农业科学院农业资源与 农业区划研究所获得， 该生物材料只为重复本发明的相关实验所用， 不可作为其它用途使 用。 0060 实施例 1、 生物合成吲哚 -3- 乙酸 0061 一、 高产吲哚 -3- 乙酸。
36、的重组菌体细胞的制备 0062 高产吲哚 -3- 乙酸的重组菌体细胞的构建方法， 包括向受体细胞中导入用于生物 合成吲哚 -3- 乙酸的 DNA， 得到产吲哚 -3- 乙酸的重组菌体细胞的步骤。其中， 用于生物合 成吲哚 -3- 乙酸的 DNA， 由吲哚 -3- 乙酸合成相关基因 1、 吲哚 -3- 乙酸合成相关基因 2 和 吲哚 -3- 乙酸合成相关基因 3 连接而成 ； 用于生物合成吲哚 -3- 乙酸的 DNA 的核苷酸序列 为序列表中 SEQ ID No.1。具体方法如下 ： 0063 将 pUBC19 载体的 BamHI 和 PstI 识别位点间的序列替换为 SEQ ID No.2 所。
37、示的 P43 启动子的核苷酸序列保持其它序列不变， 得到重组载体 pUBC19-P43。 0064 将重组载体 pUBC19-P43 的 KpnI 和 PstI 识别位点间的序列替换为 SEQ ID No.1 所示的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列， 保持其它序列不变， 得到重组载体 pUBC19-P43-E( 图 1)。pUBC19-P43-E 可表达 SEQ ID No.3 所示的吲哚 -3- 乙酸合成相关蛋 白 A、 SEQ ID No.4 所示的吲哚 -3- 乙酸合成相关蛋白 B 和 SEQ ID No.5 所示的吲哚 -3- 乙 酸合成相关蛋白 C 这三种蛋白质。SEQ。
38、 ID No.1 所示的用于生物合成吲哚 -3- 乙酸的 DNA 编码 SEQ ID No.3 所示的吲哚 -3- 乙酸合成相关蛋白 A、 SEQ ID No.4 所示的吲哚 -3- 乙酸 合成相关蛋白 B 和 SEQ ID No.5 所示的吲哚 -3- 乙酸合成相关蛋白 C 这三种蛋白质。SEQ ID No.1 中， 第 1-1164 位为吲哚 -3- 乙酸合成相关蛋白 A 的编码序列， 第 1165-2586 位为 吲哚 -3- 乙酸合成相关蛋白 B 的编码序列， 第 2587-4074 位为吲哚 -3- 乙酸合成相关蛋白 C 的编码序列。 0065 采用化学方法将 pUBC19-P43-。
39、E 导入解淀粉芽孢杆菌 SQR9 菌株中， 得到含有 SEQ ID No.1所示的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列的重组菌株， 将该菌株命名 为重组解淀粉芽孢杆菌 SQR9-E( 下文中简称 SQR9-E 菌株 ) ； 将 pUBC19-P43-E 导入枯草芽 孢杆菌 168 菌株中， 得到含有 SEQ ID No.1 所示的用于生物合成吲哚 -3- 乙酸的 DNA 的核 苷酸序列的重组菌株， 将该菌株命名为重组枯草芽孢杆菌168-E(下文中简称168-E菌株) ； 将pUBC19-P43-E导入大肠杆菌BL21菌株中， 得到含有SEQ ID No.1所示的用于生物合成吲 哚 -。
40、3- 乙酸的 DNA 的核苷酸序列的重组菌株， 将该菌株命名为重组大肠杆菌 BL21-E( 下文 中简称BL21-E菌株) ； 将pUBC19-P43导入解淀粉芽孢杆菌SQR9菌株中， 得到不含有SEQ ID No.1 所示的用于生物合成吲哚 -3- 乙酸的 DNA 的核苷酸序列的重组菌株， 将该菌株命名为 重组解淀粉芽孢杆菌SQR9-CK(下文中简称SQR9-CK菌株)， 该菌株是SQR9-E的空载体对照 菌株 ； 将pUBC19-P43导入枯草芽孢杆菌168菌株中， 得到不含有SEQ ID No.1所示的用于生 说 明 书 CN 104388369 A 8 6/8 页 9 物合成吲哚 -3。
41、- 乙酸的 DNA 的核苷酸序列的重组菌株， 将该菌株命名为重组枯草芽孢杆菌 168-CK(下文中简称168-CK菌株)， 该菌株是168-E的空载体对照菌株 ； 将pUBC19-P43导入 大肠杆菌 BL21 菌株中， 得到不含有 SEQ ID No.1 所示的用于生物合成吲哚 -3- 乙酸的 DNA 的核苷酸序列的重组菌株， 将该菌株命名为重组大肠杆菌BL21-CK(下文中简称BL21-CK菌 株 )， 该菌株是 BL21-CK 的空载体对照菌株。 0066 二、 用于生物合成吲哚 -3- 乙酸的成套蛋白质的提取及分析 0067 1、 不同处理的菌体细胞收集 0068 将步骤一的BL21-。
42、CK、 BL21-E、 168-CK、 168-E、 SQR9-CK和SQR-E菌株分别接种于含 有 3mL 液体 LB 培养基的试管 ( 卡那霉素的浓度为 20g/mL) 中， 过夜培养作为种子液， 分 别得到 BL21-CK、 BL21-E、 168-CK、 168-E、 SQR9-CK 和 SQR-E 菌株的种子液。将上述种子液 分别以 1体积比的接种量接种于 100mL 含 3mM 色氨酸的 Landy 培养基 ( 在 Landy 培养基 中加入色氨酸， 使色氨酸的含量为 3mM 得到的液体即为含 3mM 色氨酸的 Landy 培养基 ) 中 (Landy M,Warren GH,Ro。
43、senmanM SB,Colio LG.1948.Bacillomycin:an antibiotic from Bacillus subtilis active against pathogenic Fungi.Exp.Biol.Med.67:539-541.)， 22， 90rpm 避光培养 72 小时后在 4， 8000g 离心收集菌体， 分别得到 BL21-CK、 BL21-E、 168-CK、 168-E、 SQR9-CK 和 SQR-E 菌株的菌体。 0069 2、 用于生物合成吲哚 -3- 乙酸的成套蛋白质的提取 0070 将收集到的菌体用 0.2M pH 6.8 磷酸缓冲液洗涤。
44、， 4， 8000g 离心 10min 收集菌 体， 共进行上述操作三次。将收集到的菌体采用Bacteria Protein Extraction Reagent(Thermo Scientifi c)试剂盒提取菌体蛋白。 具体流程如下 ： 离心沉淀的菌体用10mL B-PER Reagent 重悬， 并且加入 2L 100mg/mL 溶菌酶 ； 其中 BL21-CK 和 BL21-E 菌体置于 室温反应 10-15min， 得到 BL21-CK 菌体裂解液和 BL21-E 菌体裂解液 ； SQR9-CK、 SQR9-E、 168-CK 和 168-E 菌株置于室温反应 45min， 得到 S。
45、QR9-CK 菌体裂解液、 SQR9-E 菌体裂解液、 168-CK 菌体裂解液和 168-E 菌体裂解液， 将各裂解液 15000g 离心 5min， 所获上清液即为 菌株的蛋白粗提液， 获得 BL21-CK 蛋白粗提液、 BL21-E 蛋白粗提液、 SQR9-CK 蛋白粗提液、 SQR9-E 蛋白粗提液、 168-CK 蛋白粗提液和 168-E 蛋白粗提液。将各菌株的蛋白粗提液置 于 -70冰箱中保存。 0071 3、 BCA 法测定蛋白总量 0072 蛋白定量采用BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京鼎国生物技术有限责任公司)， 具体 流程如下 ： 根据标准品和样品的数量， 将试剂 A(BCA 。
46、碱性溶液 ) 和试剂 B( 硫酸铜溶液 ) 以 50 ： 1(V/V)的比例混合配制BCA工作液 ； 将0、 1、 2、 4、 6、 8、 10L的标准BSA蛋白溶液(1mg/ mL) 分别加入 96 孔板的不同孔中， 并加 ddH2O 使得每孔的体积为 10L， 每个浓度设置 3 个 复孔。 分别取10L稀释的待测蛋白样品加入96孔板的不同孔中， 每个样品设置3个复孔。 向 BSA 蛋白标准品孔和待测样品孔中每孔分别加入 200L 配置好的 BCA 工作液， 充分混匀 后于 37反应 30min， 反应结束后将 96 孔板冷却至室温， 采用酶标仪测定各样品的吸光度 OD562。以 BSA 蛋。
47、白标准品浓度作为横坐标， 吸光度值作为纵坐标制作标准曲线。根据标准 曲线， 计算各样品的蛋白质含量。 0073 4、 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 0074 SDS-PAGE 凝胶制备 ： 先灌制浓度为 10的分离胶， 浓度为 10的分离胶包含 说 明 书 CN 104388369 A 9 7/8 页 10 5.3mL30 Acr/Bis(29:1) 贮存液、 4.0mL 下层缓冲液、 0.8mL 10 APS、 0.008mL TEMED 和 6.7mL 去离子水， 分离胶灌好后置于 37凝固 30min ； 待分离胶凝固后灌制浓度为 5 的浓缩胶， 浓度为 5的浓缩胶包含 。
48、0.75mL 30 Acr/Bis(29:1) 贮存液、 1.25mL 上层缓 冲液、 0.015mL 10 APS、 0.005mL TEMED 和 3.0mL 去离子水， 浓缩胶灌好后置于室温凝结 15-20min。 0075 在电泳槽内加入新鲜配置的 1 电极缓冲液。根据待测蛋白浓度取适量的待测蛋 白样品， 加入 10L 样品缓冲液混合均匀， 然后去离子水补齐至 30L， 各个样品的蛋白质 质量浓度均相同， 将样品进行沸水浴 5min， 14000rpm 离心 5min 后上样， 每个泳道的上样体 积均相同。首先采用 80V 的电压使样品先从浓缩胶迁移至分离胶， 随后采用 100V 的电。
49、压使 得样品跑至分离胶底部。 0076 凝胶的染色及脱色 ： 电泳结束后， 将凝胶从玻璃板上轻轻拨下， 放入已加入适量固 定液的干净玻璃皿内， 固定 30min， 固定结束后倒出固定液加入适量考马氏亮蓝 R-250 染色 液， 震荡染色 1h， 然后倒出染色液加入脱色液进行震荡脱色， 每隔 10min 更换脱色液， 重复 脱色洗脱四次， 之后加脱色液连续脱色 4-8h， 期间更换脱色液 3-4 次， 脱色完全后进行扫描 拍照。 0077 吲哚-3-乙酸合成相关蛋白A的分子量为43KDa， 吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B的 分子量为 53KDa 和吲哚 -3- 乙酸合成相关蛋白 C 的分子量为 54KDa， 图 2 中显示含有用于 生物合成吲哚 -3- 乙酸的 DNA 的核苷酸序列的。