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1、(10)申请公布号 CN 104278023 A (43)申请公布日 2015.01.14 CN 104278023 A (21)申请号 201410496556.4 (22)申请日 2014.09.25 C12N 15/10(2006.01) C40B 50/06(2006.01) (71)申请人 中国海洋大学 地址 266100 山东省青岛市崂山区松岭路 238 号 (72)发明人 刘光兴 张寰 杨菲菲 徐东晖 黄有松 衣晓燕 (74)专利代理机构 青岛联智专利商标事务所有 限公司 37101 代理人 杨秉利 (54) 发明名称 一种构建桡足类全长 cDNA 文库的方法 (57) 摘要 本。
2、发明公开了一种构建桡足类全长 cDNA 文 库的方法。本发明以少量桡足类个体为材料提取 高质量的 RNA 后， 以 Modifi ed oligo dT 为引物， 反转录获得第一链 cDNA ； 然后以桡足类的信使 RNA 反式剪接前导 Spliced leader 简称为 SL 的 序列为基础， 设计正向简并引物 Copepod SL， 以 Modifi ed oligo dT上接头Adaptor序列为反向引 物， 以第一链 cDNA 为模板， 进行 25-35 个循环的 PCR 扩增， 经过常规的连接转化克隆过程， 获得该 桡足类的全长cDNA文库。 本发明桡足类全长cDNA 文库构建方法。
3、所需样品量少， 效率高， 方法简便， 易于操作， 适用于桡足类分子生态学研究， 方便和 促进功能基因的快速、 准确筛选。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 3 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 序列表3页 附图4页 (10)申请公布号 CN 104278023 A CN 104278023 A 1/1 页 2 1. 一种构建桡足类全长 cDNA 文库的方法， 其特征在于 ： 具体步骤包括如下 ： （1） 桡足类 RNA 的提取 ： 以桡足类个体为材料提取高质量的 RNA， 所需桡足类个体少。
4、量 即可 ； （2） 反转录 ： 以 Modifi ed oligo dT 为引物反转录合成 cDNA 第一链 ； 其中所述 cDNA 第一链的合成引物 Modifi ed oligo dT: 5 -GCTGTCAACGATACGCTACGTAA CGGCATGACAGTG(T)16VN-3 ； （3） PCR 扩增 ： 利用桡足类反式剪切前导序列 SL 设计正向简并引物 Copepod SL， 与 Modifi ed oligo dT 上的 Adaptor 组成引物对， 以 cDNA 第一链为模板， PCR 扩增 25-35 个循 环 ； 其中所述桡足类反式剪切前导序列 SL 序列为 ： 5。
5、 -GTCTAAWACGACCAAGCTWAWWTTGCTTGA TTCACTTCWWYAAGAG-3 ; 其中 PCR 扩增体系引物组合包括如下 ： 所述正向简并引物 Copepod SL 序列为 : 5 -GTCTAAWACGACCAAGCTWAWWTTGCTTGATTCAC TTCWWYAAGAG-3 所述反向引物 Adaptor 序列为 : 5 -GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3 （4） cDNA 文库的构建 ： 将 PCR 反应产物回收进行常规的连接转化克隆等过程。 2. 根据权利要求 1 所述的一种构建桡足类全长 cDNA 文库的方法， 其特征在于 ： 所述步。
6、 骤 （3） 中 PCR 扩增体系的总体积为 25L， 包括如下组分 ： 10Buffer 2.5 L 25mM dNTPs 2 L 5M Copepod SL 1 L 5M Adaptor 1 L 2.5U/L Hot start Taq 0.2 L cDNA 模板 1 L 超纯水 17.5 L 10Buffer 中含 Mg2+。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的一种构建桡足类全长 cDNA 文库的方法， 其特征在于 ： 所 述步骤 （3） PCR 扩增包括如下反应程序 ： 第一阶段， 变性 95C， 2min ； 第二阶段， 95C/15s， 68C/30s， 72C/2.5min，。
7、 5 个循环 ； 第三阶段， 95C/15s， 60C/30s， 72C/2.5min， 20-30 个循环 ； 第四阶段， 72C， 10min ； 第五阶段， 15C 保温。 权 利 要 求 书 CN 104278023 A 2 1/5 页 3 一种构建桡足类全长 cDNA 文库的方法 0001 技术领域 0002 本发明涉及生物技术领域， 具体涉及一种构建桡足类全长 cDNA 文库的方法。 背景技术 0003 桡足类是广泛存在于海洋和淡水环境中的小型甲壳动物。作为次级生产力的重 要组成部分， 桡足类是水生生态系统食物网中的重要环节， 在初级生产者和更高营养级之 间起着承上启下的作用 ； 。
8、另外， 桡足类通过摄食、 呼吸和排泄等过程成为微食物环的重要环 节。对海洋学者来说， 研究及预测海洋生物个体及更大尺度上对环境变化的响应是一项极 大的挑战， 而在分子水平上深入认识个体及群体的响应是探究生物对环境变化适应机制的 关键。桡足类具有个体小， 生命周期短、 对环境变化敏感， 生活史策略多样， 分布广泛等特 点， 是研究各种重要生物过程分子机制的理想实验生物。 遗憾的是， 由于桡足类基因组的复 杂性， 其基因信息非常匮乏， 针对桡足类基因组结构及基因表达调控机制的研究很少。 0004 转录组测序研究是全基因组测序的替代手段。 桡足类不同发育阶段及应对环境变 化的转录组特征研究是认识其生。
9、活史和生理功能调控机制的关键。全长 cDNA 序列是鉴定 基因功能所必须的。 通过在线或本地的序列比对、 编码区预测、 识别功能蛋白结构域等方法 可大大提高鉴定已知或未知蛋白编码基因的几率。 当非模式生物或野外样品转录组中大量 序列与已报道的 DNA 数据库中序列无明确匹配时， 全长 cDNA 序列尤其重要。在前人的研 究中已发现眼虫、 线虫、 扁形动物、 刺胞动物、 轮虫、 海鞘、 甲藻等生物中存在信使 RNA 的剪 接前导 （Spliced leader, SL） 反式剪接现象。由于 SL 序列在成熟的 mRNA 上普遍存在， 为得到 cDNA 的全长序列提供了方便 ； 同时 SL 序列具。
10、有谱系特异性， 因此在涉及谱系特异 性的转录组研究， 尤其当目标种与其它生物共存时， SL 序列是非常有用的工具。 0005 构建全长 cDNA 文库是筛选功能基因全长 cDNA 序列的重要方法， 是进行功能基 因组学研究的基本手段。常规的构建全长 cDNA 文库的方法普遍存在材料用量多、 耗时长、 步骤繁琐的特点。由于桡足类等小型甲壳动物个体小， 单个体 RNA 含量少， 常规的全长 cDNA文库构建法通常需要几千个个体， 通过野外采样的方法难以获得足够数量。 另外， 桡足 类体表经常有寄生性纤毛虫， 真菌类， 藻类等生物附着 , 桡足类本身也摄食各种各样的饵 料生物， 常规的 cDNA 文。
11、库构建方法无法排除这些生物的存在对桡足类 cDNA 文库序列造 成的污染。 因此建立一种适用于桡足类的、 可高效构建全长cDNA 文库的方法将极大提高其 功能基因组学研究的效率。 发明内容 0006 针对上述技术领域的现状， 本发明提供了一种构建桡足类全长 cDNA 文库的方法， 以实现构建桡足类全长 cDNA 文库所需样品量少， 效率高， 方法简便， 易于操作， 适用于桡足 类分子生态学研究， 方便和促进功能基因的快速、 准确筛选。 说 明 书 CN 104278023 A 3 2/5 页 4 0007 为实现上述发明目的， 本发明通过如下技术方案予以实现 ： 一种构建桡足类全长 cDNA 。
12、文库的方法， 具体步骤包括如下 ： （1） 桡足类 RNA 的提取 ： 以桡足类个体为材料提取高质量的 RNA， 所需桡足类个体少量 即可 ； （2） 反转录 ： 以 Modifi ed oligo dT 为引物反转录合成 cDNA 第一链 ； 其中所述 cDNA 第一链的合成引物 Modifi ed oligo dT: 5 -GCTGTCAACGATACGCTACGTAA CGGCATGACAGTG(T)16VN-3 ； （3） PCR 扩增 ： 利用桡足类反式剪切前导序列 SL 设计正向引物 Copepod SL， 与 Modifi ed oligo dT 上接头序列构成的反向引物 Ada。
13、ptor 组成引物对， 以 cDNA 第一链为模板， PCR 扩 增 25-35 个循环 ； 其中所述桡足类反式剪切前导序列 SL ： 5 -GTCTAAWACGACCAAGCTWAWWTTGCTTGATTCAC TTCWWYAAGAG-3 ; 其中 PCR 扩增体系引物组合包括如下 ： 所述正向引物 Copepod SL: 5 -GTCTAAWACGACCAAGCTWAWWTTGCTTGATTCACTTCWWYAAGA G-3 所述反向引物 Adaptor:5 -GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3 （4） cDNA 文库的构建 ： 将 PCR 反应产物回收进行常规的连接转。
14、化克隆过程。 0008 进一步的， 上述构建桡足类全长 cDNA 文库的方法中， 步骤 （3） 所述 PCR 扩增体系 总体积为 25L， 包括如下组分 ： 10Buffer 2.5 L 25mM dNTPs 2 L 5M Copepod SL 1 L 5M Adaptor 1 L 2.5U/l Hot start Taq 0.2 L cDNA 模板 1 L 超纯水 17.5 L 10Buffer 中含 Mg2+， 2.5U/l Hot start Taq 酶的体积不列入扩增体系内。 0009 进一步的， 上述构建桡足类全长 cDNA 文库的方法中， 步骤 （3） 所述 PCR 扩增包括 如下。
15、反应程序 ： 第一阶段， 变性 95C， 2min ； 第二阶段， 95C/15s， 68C/30s， 72C/2.5min， 5 个循环 ； 第三阶段， 95C/15s， 60C/30s， 72C/2.5min， 20-30 个循环 ； 第四阶段， 72C， 10min ； 第五阶段， 15C 保温。 0010 本发明与现有技术相比有许多优点和积极效果 ： 1. 所需样品量少， 可构建单只桡足类的全长 cDNA 文库， 为研究桡足类个体对环境变 化的响应机制提供了重要工具 ； 方法简单， 耗时短， 合成 cDNA 第一链后， 利用本发明中的 特定引物对进行扩增， 再将 PCR 产物进行常规的。
16、连接转化克隆， 即可完成文库构建。 0011 2. 本发明中所用的 SL 序列具有谱系特异性， 当目标桡足类与环境中其它物种共 说 明 书 CN 104278023 A 4 3/5 页 5 同存在时， 构建 SL-cDNA 文库可方便的获取目标种的转录组信息。 0012 3. SL- cDNA 文库中基因种类丰富， 皆为全长序列， 通过在线或本地的序列比对， 编码区预测， 识别功能蛋白结构域等方法可大大提高识别已知或未知蛋白编码基因的几 率。 0013 结合附图阅读本发明的具体实施方式后， 本发明的其他特点和优点将变得更加清 楚。 0014 附图说明 0015 图 1 为使用本发明扩增太平洋纺。
17、锤水蚤 （ Acartia pacifi ca） 的全长 cDNA 的 PCR 产物电泳结果。 0016 图 2 为 使 用 本 发 明 获 得 的 太 平 洋 纺 锤 水 蚤 无 机 焦 磷 酸 酶 （Inorganic pyrophosphatase） 全长 cDNA 序列及 Blastx 结果。 0017 图 3 为使用本发明获得的太平洋纺锤水蚤超氧化物歧化酶 （Superoxide dismutase） 全长 cDNA 序列及 Blastx 结果。 0018 图 4 为使用本发明得到的太平洋纺锤水蚤 cDNA 文库基因功能注释分类 （分子功 能） 图。 具体实施方式 0019 下面结合。
18、附图和实施例对本发明的技术方案作进一步详细的描述。 0020 实施例 1 利用上述方法快速高效的构建了太平洋纺锤水蚤全长 cDNA 文 库， 并基于 NCBI 数据库和 Blast2Go 软件对文库进行了分析。具体步 骤如下 ： （一） 桡足类 RNA 提取 ： 提取高质量的桡足类总 RNA， 步骤简述如下 ： （1） 样品固定。桡足类样品使用 Trizol 试剂在 1.5ml 离心管 (a) 中进行固定。 0021 （2） 样品匀浆。将管 (a) 中大部分 Trizol 转移至离心管 (b) 中， 用研磨棒匀浆样 品。 将Trizol转移回管(a)中， 转移过程中润洗研磨棒， 混匀后离心， 。
19、上清液转移至管(b)。 再次研磨 1-2 次。 0022 （3） 上清液转移回管 (a) 中， 加入 200l 氯仿， 涡旋混匀 1min， 4C 10000g 离心 15min。 0023 （4） 在管 (c) 加入等体积的苯酚 / 氯仿 ( 体积比为 5:2) 的抽提液， 将管 (a) 中上 清液小心转移到抽提液中， 涡旋混匀， 4C 10000g 离心 5min。重复这一步骤 2 次， 最后一次 离心时温度调整到室温， 得到粗 RNA 溶液。 0024 （5） 在粗 RNA 溶液中加入等体积的 100% 乙醇， 混匀， 过柱子 （Zymo） 。 0025 （6） 350l 的 prewa。
20、sh buffer 清洗柱子 （Zymo） 两次。 0026 （7） 500l 的 washing buffer 清洗柱子 （Zymo） 一次。 0027 （8） 40lDEPC 水溶解 RNA。 说 明 书 CN 104278023 A 5 4/5 页 6 0028 （9） 使用 NanoDrop 2000C（Thermo Scientifi c） 分光光度计测定 RNA 溶液浓度。 0029 （二） cDNA 第一链合成 ： （1） 在管中依次加入下述组分建立反应体系 ： RNA 8L(1.5g) dNTP Mix（10mM） 1L Modifi ed oligo dT (100M) 1L。
21、 （2） 65C 温育 5 min， 冰上放置 2min ； （3） 依次加入下述组分于上述 10L 混合体系中， 并混匀， 42C 温育 1h ； 5Buffer 4L MgCl2(25mM) 4L DEPC 水 1L ImProm-II Reverse Transcriptase 1L （4） 70C， 10min 终止反应， 进行纯化或保存在 -20C。 0030 （三） 纯化 cDNA 第一链 使用 DNA Clean & ConcentratorTM-25 Kit (Zymo) 进行 cDNA 的纯化。 0031 （四） 桡足类全长 cDNA 的 PCR 扩增 PCR 体系扩增组分比。
22、例如下 ： 10Buffer(MgCl2 plus) 2.5L dNTPs(25mM) 2L 正向引物 Copepod SL（5M） 1L 反向引物 Adaptor（5M） 1L Hotstart Taq（2.5U/L） 0.2L cDNA 模板 1L 超纯水 17.5L PCR 扩增条件如下 ： 95C 变性 2 分钟 ； 95C 变性 15 秒， 68C 退火 30 秒， 72C 延伸 2.5 分钟， 共计 5 个循环 ； 95C 变性 15 秒， 60C 退火 30 秒， 72C 延伸 2.5 分钟， 共计 20 个循环 ； 72C 延伸 10 分钟 ； 15C 保温。 0032 该过程。
23、循环数与起始 RNA 含量有关 ： 若 RNA300ng， 则 20 个循环即可。 0033 （五） 琼脂糖凝胶电泳回收 PCR 产物 （1） 凝胶电泳 ： 制备浓度为 1% 的凝胶进行电泳。 0034 （2） 切胶 ： 在弱紫外光下将含有 PCR 产物的凝胶切下， 置于离心管中。 0035 （3） 在离心管中加入 3 倍体积的 6M NaI 溶液， 放入恒温金属浴中 55C 融化。 0036 （4） 使用 DNA Clean & ConcentratorTM-25 Kit （Zymo） 试剂盒进行纯化。 0037 图 1 为使用本发明扩增太平洋纺锤水蚤的全长 cDNA 的 PCR 产物电泳结。
24、果。 0038 （六） 连接、 转化与克隆培养 使用 Invitrogen TOPO cloning 试剂盒进行胶回收产物连接、 转化与克隆培养。 0039 （七） 质粒提取与测序 克隆培养后抽提质粒 DNA， 并送至基因测序公司进行测序。 说 明 书 CN 104278023 A 6 5/5 页 7 0040 （八） 序列分析 结果显示， 使用本发明获得了太平洋纺锤水蚤全长 cDNA 文库中部分基因的全长 cDNA 序列。所得到的编号 1 无机焦磷酸酶的全长 cDNA 序列具体如序列表中序列 1 所示 ； 所得到 的编号 2 超氧化物歧化酶的全长 cDNA 序列具体如序列表中序列 2 所示。。
25、 0041 图 2 为使用本发明获得的太平洋纺锤水蚤无机焦磷酸酶全长 cDNA 序列及 Blastx 结果。 0042 图 3 为使用本发明获得的太平洋纺锤水蚤超氧化物歧化酶全长 cDNA 序列及 Blastx 结果。 0043 综上所述， 本发明建立了一种构建桡足类全长 cDNA 文库的方法， 具体包括合成 cDNA 第一链的反转录引物和cDNA 第一链进行 PCR 扩增的引物组合 （Copepod SL ： 5 -GTC TAAWACGACCAAGCTWAWWTTGCTTGATTCACTTCWWYAAGAG-3 、 Adaptor ： 5 -GCTGTCAACGATACGCTAC GTAA。
26、CG-3 ） 、 PCR 扩增组分和比例、 PCR 扩增程序三个方面。 利用本技术已成功进行了包括 太平洋纺锤水蚤、 中华哲水蚤、 背针胸刺水蚤等在内的多种桡足类的全长 cDNA 文库构建， 使用的桡足类数目 1-100 只不等， 结果表明 ： 本方法所需材料少， 少量的桡足类即可完成 文库构建 ； 通过 PCR 反应， 可扩增 cDNA 中 0.3-3kb 的序列 ； 通过质粒克隆测序， 可得到上 述桡足类位于细胞中不同部位， 参与不同的分子功能和生物学过程的全长基因 cDNA 序列。 这将为研究不同桡足类在环境压力下的基因表达， 进而研究其在分子水平上的适应机制提 供了重要基础， 必将大大。
27、推动桡足类基因组学和转录组学的研究。 0044 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案， 而非对其进行限制 ； 尽管参照前述实 施例对本发明进行了详细的说明， 对于本领域的普通技术人员来说， 依然可以对前述实施 例所记载的技术方案进行修改， 或者对其中部分技术特征进行等同替换 ； 而这些修改或替 换， 并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。 说 明 书 CN 104278023 A 7 1/3 页 8 SEQUENCE LISTING 中国海洋大学 一种构建桡足类全长 cDNA 文库的方法 2 PatentIn version 3.3 1 1131 DNA 太平洋纺。
28、锤水蚤 （Acartia pacifi ca） 1 gtctaatacg accaagctaa ttttgcttga ttcacttctt caagaggata agaaaggctg 60 gctatactgc tgaggagcgg ggtgcaccca acttcctgga ctacaagctt tacatcaagg 120 atggcagcgg aaaggtggtg tcttctatgc atgacattcc catgaagcct ggtgcaggag 180 acagtgtgta taacatggtg gttgaggtgc cacgctggtc caatgccaaa attgagatcg。
29、 240 atctcaagtc cagtctcaat cctctgaagc aggacgtgaa gaagggaaag ctgaggtttg 300 ttgccaactg tttcccccac cacgggtata tctggaacta tggtgctatc cctcagacgt 360 gggaggaccc caaccacacg gacgagagca ctggctgcaa gggggacgga gatccgattg 420 acgtgtgcga gatcggtcag aagattcatt cgcgtggcag tgtcatccag gtcaaagttt 480 tgggaacctt cgct。
30、ctgatt gatgagggcg aaactgactg gaaggtgatc gctatcgacg 540 tgaaagaccc cctggccgag aacctcaacg atatccacga tgtggagaaa ctgatgcccg 600 gcttccttgc ggctactgta gagtggttca aagtttacaa gatgccggac ggaaagcccg 660 序 列 表 CN 104278023 A 8 2/3 页 9 ccaacaagtt tgcatttgat gacaaaccca aggatcgtga attcgcggag aacgtgattg 720 ttag。
31、ctgcca tgacagctgg aagaagctta tgtctggaga caccaaggat gatggtgttc 780 agttaagcaa caccaccctc tccaacacca acagcattga ggccgctgca gctgaccaag 840 ttgttgccca gaatcctgcc ctggctgagg ccatgcctct tcctgacgac gttgacaagt 900 ggcattacgt ctccctcaag taaaccagat tggacgccgg ttgttaatga tttgtatatg 960 aatttaaaac ggccaccatt tc。
32、atctgact ggaactgtgt caactaaaat caagtctatc 1020 tgcagcattc ctgtccctat atgatacgtt ttaagaataa cggcatataa agccttggtc 1080 attttaattt aagcccccgc cctaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 1131 2 1180 DNA 太平洋纺锤水蚤 （Acartia pacifi ca） 2 gtctaaaacg accaagctta ttttgcttga ttcacttctt caagaggaat gaaaacgaag 60 gctgtatgtg。
33、 tgctgaaggg cgacgccgtc aatggcactg tctactttga gcaggagggc 120 aacggccctg ttaccctgag cggtgagctg actggcctcg gcgatggcct ccatggtttc 180 catgtccatg agtttggtga caacaccaac ggttgcacat ctgccgggcc ccacttcaac 240 cctgacggct gcagccacgg tgctcccact gacgccaagg gcgagcgtca tgctggtgac 300 ctgggcaacg tgaccgctga gggcggtg。
34、tt gctaaggtgg acatcaagga cagcttcatc 360 agcctgaccg gggagaactc catcattgga cgcaccatgg tcatccacgc cgaccctgac 420 gacctgggca agggtggcca cgagcttagc aagactacag gcaatgctgg agctcgttct 480 序 列 表 CN 104278023 A 9 3/3 页 10 gcttgtggtg tcattggcat cgccaagtaa gaagcgttgc atcctccaaa ctgtagacaa 540 caacgtggtg tccagac。
35、cag ctgattgatt gattgattga ttaatcgatt gatttattga 600 ttaatcaata ttttgaacaa ttgattgagt gacaattaga tcaattgatt gattgaccat 660 tagatcaatt gattgattaa ttgatgaatt gatttagtga ctaattgatt gattaatgaa 720 ttgattagcc tctggtgcga aatgccgggt atcaaattgc tgtttcacca cgtgcgagct 780 aatgccgctc taaatgtttt attattgcac cacgt。
36、ttttg atttgatgta cactcgagtg 840 taatccccag tgttttgtta aaactacttt gttatgtcaa agttgtttct taaagataaa 900 tataaacttt ttgattattt aagtttgaac attaagaatt tatataatga aaactttttg 960 tatatgttat ctttaaataa acttaacgta acattgcagt tatatttgtg ttattatatt 1020 attgtcatac ctgtgaaggc atttttatat taaatacata ataaaaaatt gg。
37、cttcactc 1080 aatgcatcga ttttattgct tgatggtgtg agagtcgggc caattttcta tgattaatac 1140 tctcccaaca actgattaaa ttttcagaaa aaaaaaaaaa 1180 序 列 表 CN 104278023 A 10 1/4 页 11 图 1 说 明 书 附 图 CN 104278023 A 11 2/4 页 12 图 2 说 明 书 附 图 CN 104278023 A 12 3/4 页 13 图 3 说 明 书 附 图 CN 104278023 A 13 4/4 页 14 图 4 说 明 书 附 图 CN 104278023 A 14 。