利用白蛋白-葡聚糖制备的阿霉素纳米制剂及其应用 【技术领域】
本发明属于医药技术领域，具体为一种阿霉素纳米制剂，以及该制剂在治疗恶性肿瘤方面的应用。
背景技术
肿瘤是直接威胁人类健康的重大疾病。许多有效的化疗药物因为对癌细胞、癌组织缺乏选择性或靶向性，容易损害正常的组织和细胞，因而严重限制了这些药物在肿瘤治疗中的应用。阿霉素是一个广谱抗肿瘤药物，但是在有效剂量下显示了严重的不良反应[J.M.Llovet，Journal of Gastroenterology 40(2005)225-235]，其毒害效应主要产生在心脏、骨髓和肠道[G.Mazue et al.，International Journal of Oncology 7(1995)713-726]。研究表明肿瘤组织有直径在100nm到1000nm的微孔，而在绝大多数正常的健康组织中，细胞间的连接缝隙小于10nm。因此，通过制备介于这两种尺寸之间的载药纳米粒子，就可能把治疗药物选择性地输送到肿瘤组织中，纳米药物在肿瘤组织中的这种增强的渗透和滞留效应被称为EPR效应[H.Maeda et al.，Journal of Controlled Release 65(2000)271-284]。通常，利用大分子制备的纳米粒子具有体内稳定，药物不容易渗漏，易于修饰，化学组成易于调控等优点。而在纳米粒子的表面修饰多糖，如茁霉多糖(pullulan)、壳聚糖、葡聚糖等可以增加纳米粒子在体内的循环时间，使纳米药物避免被巨噬细胞吞噬而成功地输送到靶向病灶[Z.Liu et al.，Journal of Biomedical Materials Research Part A，2007，83，806-812；C.Lemarchand et al.，European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 58(2004)327-341；C.Passirani et al.，Pharmaceutical Research 1998，15，1046-1050]。利用白蛋白制备的纳米粒子除了利用EPR效应以外，还利用细胞膜上的白蛋白受体Gp60及细胞膜穴样内凹(caveolae)，以及肿瘤组织中富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(SPARC)的作用，促进药物进入肿瘤细胞内，增加化疗疗效[M.J.Hawkins et al.，Advanced Drug Delivery Reviews 60(2008)876-885]。
目前已经有一些关于白蛋白和阿霉素纳米粒子的专利申请。在这些有关的专利中，有的是通过水包油或者油包水的方法制备白蛋白-阿霉素纳米粒子[中国专利申请号：02114356.0]；有的是通过共价键连接阿霉素到白蛋白上[中国专利申请号：200680034375.3]；也有的是通过超声波、微流化以及高压均质技术将白蛋白结合到阿霉素脂质囊泡上[中国专利申请号：200810147342.0]，或者将白蛋白水溶液和阿霉素有机溶液进行乳化制备的[200810147344.X]。另外，还有利用白蛋白和小分子糖-半乳糖复合物制备阿霉素纳米粒子的专利[中国专利申请号：200410046650.6，200410046676.0，200680034375.3]。这种纳米粒子具有较好的肿瘤靶向作用，但是不具有在体内长循环的性质。到目前为止，我们还没有发现关于利用白蛋白-多糖复合物制备以多糖为壳，白蛋白和阿霉素为核的纳米粒子的报道。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种毒副作用小，肿瘤靶向作用优良的阿霉素纳米制剂及其制备方法和在抗肿瘤方面的应用。
本发明提供的阿霉素纳米制剂是一种以葡聚糖为壳，白蛋白和阿霉素为核的纳米粒子溶液。其制备方法如下：
在酸性条件下，将白蛋白-葡聚糖共价复合物和阿霉素水溶液混合，混合溶液中的白蛋白浓度为0.5～50mg/mL，阿霉素与白蛋白的质量比在10∶1～1∶10之间，调节混合溶液的pH到6.8～8.8范围内，利用阿霉素自身的疏水性变化以及阿霉素与白蛋白之间的静电和疏水作用形成以白蛋白和阿霉素为核的纳米复合物。然后将溶液加热至60～100℃，维持1～1000分钟，优选10～100分钟，使白蛋白变性并发生分子间交联而将阿霉素固定在纳米粒子的内部。加热温度和加热时间的增加将使白蛋白的交联程度增加因而导致阿霉素的释放速率降低。最后，将溶液冷却，即可得到阿霉素纳米粒子。共价连接到白蛋白上的葡聚糖组成了纳米粒子的外壳，使得纳米粒子在水溶液中保持稳定。
本发明中，白蛋白-葡聚糖共价复合物可通过Maillard反应制备(中国专利申请号：2007100400288)获得。白蛋白可以是人血清白蛋白，也可以是动物白蛋白，如牛血清白蛋白。
本发明可以高效地将阿霉素负载在白蛋白纳米粒子中，包埋量和包埋效率分别可以达到30％和90％以上。动态光散射结果表明纳米粒子的水合半径在40～250nm之间并保持长期稳定(附图1)。透射电镜结果表明纳米粒子具有球形外貌(附图2)。ζ-电位的结果表明阿霉素与白蛋白之间有相互作用，葡聚糖组成纳米粒子的外壳(附图3)。
与自由阿霉素相比，包埋在纳米粒子内部的阿霉素具有明显的缓释性质。纳米粒子在pH 7.4条件下释放阿霉素的速率很小，而降低pH值可以显著增加阿霉素的释放速率。由于肿瘤细胞的pH值低于正常细胞，纳米粒子的这个性质有利于其进入肿瘤细胞以后释放阿霉素。此外，白蛋白的肿瘤靶向性质可以提高阿霉素的疗效并降低阿霉素的毒副作用，纳米粒子表面的葡聚糖可以使纳米粒子避免被巨噬细胞快速清除而增加其到达肿瘤的机会。本发明制备的纳米制剂可以显著地降低阿霉素的毒副作用，延长荷瘤小鼠的生命达55.7％。
在本发明中，除了pH调节所使用的酸和碱以外，不使用其他地化学试剂，因而是一种绿色的阿霉素纳米制剂的制备方法。
【附图说明】
图1.新鲜制备和存放35天以后的阿霉素-白蛋白-葡聚糖纳米粒子溶液的水合半径分布。
图2.阿霉素-白蛋白-葡聚糖纳米粒子电子显微镜照片。
图3.白蛋白(BSA)、白蛋白和阿霉素(DOX)混合物、阿霉素-白蛋白-葡聚糖(DOX-BSA-Dex)纳米粒子在不同pH条件下的ζ-电位。
图4.在体外释放阿霉素的累计释放曲线。(a)自由阿霉素在0.1mol/L pH 5.0醋酸缓冲液中，(b)阿霉素-白蛋白-葡聚糖纳米粒子在0.1mol/L pH 5.0醋酸缓冲液中，(c)阿霉素-白蛋白-葡聚糖纳米粒子在水中，(d)阿霉素-白蛋白-葡聚糖纳米粒子在0.01mol/L pH 7.4磷酸缓冲液中的释放。
图5.通过不同加热时间得到的阿霉素-白蛋白-葡聚糖纳米粒子在体外释放阿霉素的累计释放曲线，释放介质是0.1mol/LpH 5.0醋酸缓冲液。
【具体实施方式】
实施例1.
将牛血清白蛋白(BSA)用去离子水溶解，配制成10mg/mL的白蛋白溶液。然后将分子量为62kDa的葡聚糖加入到白蛋白溶液中，葡聚糖与白蛋白的摩尔投料比为1∶2。溶液混合均匀以后调节其pH值到8.0，然后将溶液冷冻干燥。将冻干后的固体粉末称重，然后放入烧杯中置于装有KBr饱和溶液的密闭容器中(容器内相对湿度为79％)，在60℃下进行Maillard反应不同时间后得到白蛋白-葡聚糖共价复合物。
将白蛋白-葡聚糖共价复合物用去离子水溶解，然后加入盐酸阿霉素水溶液，阿霉素与白蛋白的质量比为1∶4，白蛋白的最终浓度是5mg/mL，溶液的pH值约为5～6之间。待溶液混合均匀后，用NaOH调节混合溶液的pH到7.4形成阿霉素-白蛋白-葡聚糖纳米复合物，然后将此纳米复合物溶液置于80℃水浴中加热60分钟，就可以得到阿霉素-白蛋白-葡聚糖纳米粒子水溶液。
纳米粒子的水合半径(Rh)和多分散系数(PDI)通过动态光散射分析得到，测量时溶液被稀释到白蛋白浓度为0.1mg/mL。在纳米粒子溶液中的自由阿霉素通过超滤与纳米粒子分离(超滤截留分子量50kDa)，超滤液中的阿霉素浓度利用紫外-可见光谱在480nm的吸收测定。阿霉素在纳米粒子中的包埋效率(LE)和包埋量(LA)通过以下公式计算：
表1.经过不同Maillard反应时间得到的共价复合物对阿霉素-白蛋白-葡聚糖纳米粒子的半径及包埋量和包埋效率的影响。
表1的结果表明白蛋白/葡聚糖混合物和阿霉素作用形成了沉淀，而通过Maillard反应得到的白蛋白-葡聚糖共价复合物可以与阿霉素形成稳定的纳米粒子。纳米粒子的水合半径约为100纳米(水合直径约为200纳米)，阿霉素的包埋效率达到90％以上。
纳米粒子在体外释放阿霉素按照以下方法测定：取一定量的阿霉素-白蛋白-葡聚糖纳米粒子溶液置于透析袋中(截留分子量为14kDa)，然后将透析袋浸入不同释放介质溶液中，在37℃下以100rpm的速度磁力搅拌，每隔一定时间从介质溶液中取出5mL样品，同时加入相同体积的新鲜释放介质。样品中阿霉素的含量通过紫外-可见光谱在480nm的吸收测定。体外释放的结果见附图4。
附图4的结果表明，阿霉素-白蛋白-葡聚糖纳米粒子与自由阿霉素相比表现出明显的缓释性质，并且其在pH 5.0条件下的释放速率明显大于在pH 7.4条件下的释放速率，这个性质将有利于纳米粒子进入肿瘤细胞以后释放阿霉素而达到有效降低阿霉素毒副作用的目的。
实施例2.
将进行了48小时Maillard反应后得到的牛血清白蛋白-葡聚糖共价复合物用去离子水溶解，然后加入盐酸阿霉素水溶液，阿霉素与白蛋白的质量比为1∶2，白蛋白的最终浓度是5mg/mL，溶液的pH值约为5～6之间。待溶液混合均匀后，用NaOH调节混合溶液的pH到7.4形成阿霉素-白蛋白-葡聚糖纳米复合物，然后将此纳米复合物溶液置于80℃水浴中加热不同时间得到阿霉素-白蛋白-葡聚糖纳米粒子水溶液。表2的结果表明加热不同的时间对水合半径没有明显的影响，包埋效率和包埋量随着加热时间的增加而有所增加。附图5的结果表明增加加热时间导致白蛋白的交联程度增加，因而导致纳米粒子在体外释放阿霉素的速率降低。
表2.通过不同加热时间得到的阿霉素-白蛋白-葡聚糖纳米粒子的半径以及对阿霉素的包埋量和包埋效率的影响。
加热时间(min) Rh(nm) PDI LE(％) LA(％) 30 78±3 0.15±0.01 62.2±1.9 21.2±0.6 45 80±1 0.14±0.02 65.2±0.8 22.2±0.3 60 79±3 0.16±0.01 72.8±1.1 24.8±0.4 90 80±2 0.17±0.03 75.2±2.6 25.6±0.9
实施例3.
将进行了48小时Maillard反应后得到的牛血清白蛋白-葡聚糖共价复合物用去离子水溶解，然后加入盐酸阿霉素水溶液，阿霉素与白蛋白的质量比为1∶4，白蛋白的最终浓度是5mg/mL，溶液的pH值约为5～6之间。待溶液混合均匀后，用NaOH调节溶液到不同pH值形成阿霉素-白蛋白-葡聚糖纳米复合物，然后将此纳米复合物溶液置于80℃水浴中加热60分钟得到阿霉素-白蛋白-葡聚糖纳米粒子水溶液。表3的结果表明，在接近中性的pH范围内加热复合物溶液都可以得到稳定的纳米粒子。
表3.在不同pH条件下加热得到的阿霉素-白蛋白-葡聚糖纳米粒子的半径以及对阿霉素的包埋量和包埋效率的影响。
pH Rh(nm) PDI LE(％) LA(％) 6.8 101±1 0.16±0.01 74.4±0.0 12.6±0.0 7.4 91±4 0.15±0.02 90.6±2.5 15.4±0.4 7.8 74±4 0.16±0.01 97.2±2.1 16.6±0.4
实施例4.
将进行了48小时Maillard反应后得到的牛血清白蛋白-葡聚糖共价复合物用去离子水溶解，然后加入盐酸阿霉素水溶液，阿霉素与白蛋白的质量比为1∶4～2∶1，白蛋白的最终浓度是5～20mg/mL，溶液的pH值约为5～6之间。待溶液混合均匀后，用NaOH调节溶液到pH 7.4形成阿霉素-白蛋白-葡聚糖纳米复合物，然后将此纳米复合物溶液置于80℃水浴中加热60分钟得到阿霉素-白蛋白-葡聚糖纳米粒子水溶液。表4的结果表明在很宽的质量比和浓度范围内都可以得到稳定的纳米粒子，阿霉素的最高包埋量和包埋效率分别可以达到30％和90％以上。所制备的阿霉素-白蛋白-葡聚糖纳米粒子溶液可以通过0.2μm的滤膜而达到除菌的目的。
表4.在不同牛血清白蛋白最终浓度和不同阿霉素与白蛋白质量比条件下制备的阿霉素-白蛋白-葡聚糖纳米粒子的半径以及对阿霉素的包埋量和包埋效率的影响。
a数据仅供参考。
实施例5.
将人血清白蛋白(HSA)用去离子水溶解，配制成10mg/mL的白蛋白溶液。然后将分子量为62kDa的葡聚糖加入到白蛋白溶液中，葡聚糖与白蛋白的摩尔投料比为1∶2。溶液混合均匀以后调节其pH值到8.0，然后将溶液冷冻干燥。将冻干后的固体粉末称重，然后放入烧杯中置于装有KBr饱和溶液的密闭容器中(容器内相对湿度为79％)，在60℃下进行Maillard反应48小时以后得到白蛋白-葡聚糖共价复合物。
将得到的人血清白蛋白-葡聚糖共价复合物用去离子水溶解，然后加入盐酸阿霉素水溶液，阿霉素与白蛋白的质量比为1∶2～1∶4，人血清白蛋白的最终浓度是5～20mg/mL，溶液的pH值约为5～6之间。待溶液混合均匀后，用NaOH调节溶液到pH 7.4形成阿霉素-白蛋白-葡聚糖纳米复合物，然后将此纳米复合物溶液置于80℃水浴中加热60分钟得到阿霉素-白蛋白-葡聚糖纳米粒子水溶液。表5的结果表明在很宽的质量比和浓度范围内都可以得到稳定的纳米粒子，阿霉素的最高包埋量和包埋效率分别可以达到30％和90％以上。所制备的阿霉素-白蛋白-葡聚糖纳米粒子溶液可以通过0.2μm的滤膜而达到除菌的目的。
表5.在不同人血清白蛋白最终浓度和不同阿霉素与白蛋白质量比条件下制备的阿霉素-白蛋白-葡聚糖纳米粒子的半径以及对阿霉素的包埋量和包埋效率的影响。
阿霉素与 白蛋白质 量比 白蛋白浓度 (mg/mL) Rh(nm) PDI LE(％) LA(％) 1∶2 10 69±1 0.12±0.02 87.0±0.3 29.6±0.1 1∶2 20 69±7 0.24±0.05 94.2±6.2 32.0±2.1 1∶4 5 92±1 0.11±0.01 96.2±1.5 16.4±0.2 1∶4 10 94±1 0.14±0.05 97.0±0.3 16.5±0.1 1∶4 20 91±3 0.17±0.01 93.6±0.0 15.9±0.1
实施例6.
取生长良好的小鼠肝癌H22腹水，用生理盐水以1∶4稀释(细胞浓度约为1～2×107个/mL)，每只小鼠右腋皮下接种0.2mL，随机分组，每组10只，设计空白对照组，阿霉素原料(5mg/kg)组，阿霉素-白蛋白-葡聚糖纳米粒子(阿霉素8mg/kg)组，阿霉素-白蛋白-葡聚糖纳米粒子(阿霉素12mg/kg)组。
接种后第3日开始尾静脉注射给药，每次给药前称量体重，按实际体重给药，共给药5次。接种后第10日称体重后脱臼处死小鼠，解剖取瘤块，称瘤重，计算各组平均瘤重。对照组的平均瘤重应在1g以上。实体瘤的疗效评价以瘤重抑制百分率(inhibition rate，IR)表示，将给药组的平均瘤重与对照组的平均瘤重按下列公式计算抑瘤率：
抑瘤率IR(％)＝(1-WT/WC)×100％
其中WT为给药组的平均瘤重，WC为生理盐水对照组的平均瘤重。按公式计算求出肿瘤抑制率并进行t检验。经统计学检验P＜0.05为有效。
表6.阿霉素-白蛋白-葡聚糖纳米粒子对荷H22瘤小鼠瘤重抑制结果。
组别 动物数(始/终) 平均体重(始/终) 瘤重(g) 抑瘤率(％) 空白对照组 10/10 21.2g/23.0g 2.77±0.61 阿霉素原料组 (5mg/kg) 10/10 21.7g/16.2g 1.01±0.34a 63.54％ 纳米粒子样品组 (阿霉素8mg/kg) 10/8 20.8g/20.0g 1.79±0.41b 35.38％ 纳米粒子样品组 (阿霉素12mg/kg) 10/9 20.7g/15.8g 1.13±0.34c 59.20％
与对照组比较：aP＜0.001，bP＜0.01，cP＜0.001。
实施例7.
取生长良好的小鼠肝癌H22腹水，用生理盐水以1∶3(生理盐水∶H22细胞液)稀释，每只小鼠腹腔接种0.2mL，随机分组，每组10只，设空白对照1组，空白对照2组，阿霉素原料(5mg/kg)组，阿霉素-白蛋白-葡聚糖纳米粒子(阿霉素8mg/kg)组。
接种后第5日开始尾静脉注射给药，每次给药前称量体重，按实际体重给药，共给药5次。试验期间逐日记录动物死亡的情况。分别记录对照组和给药组的平均生存时间，按照下列公式计算生命延长率：
生命延长率(％)＝(给药组平均存活天数/对照组平均存活天数-1)×100％
表7.使用阿霉素-白蛋白-葡聚糖纳米粒子治疗荷H22瘤小鼠以后的生命延长效果。
组别 平均存活天数 生命延长率(％) 空白对照1组 14.7±1.6 空白对照2组 14.3±0.8 阿霉素原料组(5mg/kg) 13.7±1.4a - 纳米粒子样品组 (阿霉素8mg/kg) 22.6±4.1b 55.7
与空白2组相比较：aP＞0.05，bP＜0.001。
表7的结果表明，阿霉素原料(5mg/kg)由于毒性太大，其小鼠的存活时间反而低于空白对照组，阿霉素-白蛋白-葡聚糖纳米粒子(阿霉素8mg/kg)组明显提高了小鼠的存活时间，证明了阿霉素-白蛋白-葡聚糖纳米粒子能有效地降低阿霉素的毒副作用和提高阿霉素的疗效。