一种超声酶解促肝细胞生长素的高效制备方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104313100 A (43)申请公布日 2015.01.28 CN 104313100 A (21)申请号 201410586379.9 (22)申请日 2014.10.27 C12P 21/06(2006.01) C07K 1/34(2006.01) (71)申请人 合肥平光制药有限公司 地址 231131 安徽省合肥市长丰双凤经济开 发区西淝河路 008 号 (72)发明人 王康林 陈玉海 苟希霞 (74)专利代理机构 合肥市长远专利代理事务所 ( 普通合伙 ) 34119 代理人 程笃庆 黄乐瑜 (54) 发明名称 一种超声酶解促肝细胞生长素的高效制备方 法。

2、 (57) 摘要 本发明公开了一种超声酶解促肝细胞生长素 的高效制备方法， 步骤如下 ： 1) 乳猪肝预处理 ； 2) 均质 ； 3) 超声处理 ： 将乳猪肝匀浆置于超声波处 理机内利用超声波在冰浴中处理得到超声匀浆 ； 4) 胃蛋白酶的制备 ； 5) 酶解 ： 超声匀浆置于反应 容器中， 滴加盐酸溶液至 pH 值为 2.5-3.5， 再加 入胃蛋白酶搅拌后， 将反应容器及其内容物置于 水浴锅中水解得到酶解物料 ； 6) 灭活 ； 7) 离心 ； 8) 粗滤 ： 将中性离心液先后经过截留分子量为 100KD 的中空纤维超滤装置和截留分子量为 10KD 的中空纤维超滤装置进行过滤得到粗滤液 ； 。

3、9) 超 滤 ： 粗滤液经截流分子量为 6000D 的超滤膜进行 超滤得到促肝细胞生长素溶液。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书6页 (10)申请公布号 CN 104313100 A CN 104313100 A 1/2 页 2 1. 一种超声酶解促肝细胞生长素的高效制备方法， 其特征在于， 包括如下步骤 ： S1、 乳猪肝预处理 ： 取乳猪肝， 去除胆囊、 筋膜和结缔组织， 清水洗净， 沥水后再用注射 用水清洗， 然后切成宽度为3-5cm的小块或细条状， 再置于绞肉机中绞成粒径为1-。

4、3mm的乳 猪肝颗粒 ； S2、 均质 ： 将 S1 得到的乳猪肝颗粒加入胶体磨中以 3300-3500rpm 的转速研磨 1-2min 得到乳猪肝糜， 将乳猪肝糜和注射用水按重量比为 11-12:11-12 加入搅拌机中， 以 350-380rpm 的转速搅拌 10-13min 得到乳猪肝匀浆 ； S3、 超声处理 ： 将 S2 得到的乳猪肝匀浆置于超声波处理机内利用超声波在冰浴中处 理得到超声匀浆， 超声波功率为 570-600W， 超声波频率为 52-55kHz， 超声波处理时间为 50-55s ； S4、 胃蛋白酶的制备 ： 取猪胃粘膜研磨成猪胃粘膜糜后置于反应容器中， 加入 1.4-。

5、1.7wt盐酸溶液， 猪胃粘膜糜和盐酸溶液的体积比 (g/ml) 为 25-28:26-29， 将反 应容器及其内容物置于 45-48的水浴锅中浸提 70-73min 得到浸提液， 将浸提液以 6500-6800rpm 的转速离心 18-21min， 取上清液进行低温干燥得到胃蛋白酶 ； S5、 酶解 ： 将 S3 得到的超声匀浆置于反应容器中， 滴加 1-3mol/L 盐酸溶液至 pH 值为 2.5-3.5， 再加入 S4 得到的胃蛋白酶以 230-245rpm 的转速搅拌 30-33min 后， 将反应容器及 其内容物置于 37-40的水浴锅中水解 6.5-7.5h 得到酶解物料， 其中乳。

6、猪肝匀浆与胃蛋白 酶的重量比为 99-101:1-1.4 ； S6、 灭活 ： 将 S5 得到的酶解物料水浴加热至 81-82， 保温 14-17min 后， 将温度降至室 温静置得到灭活匀浆 ； S7、 离心 ： 将 S6 得到的灭活匀浆加入离心瓶中， 以 4700-5000rpm 的转速离心 8-11min 后， 将上清液取出滴加 1-3mol/L 氢氧化钠溶液至 pH 为 6.8-7.2 得到中性离心液 ； S8、 粗滤 ： 将 S7 得到的中性离心液经过截留分子量为 100KD 的中空纤维超滤装置进行 第一次过滤后， 再经过截留分子量为 10KD 的中空纤维超滤装置进行第二次过滤得到粗。

7、滤 液， 其中第一次过滤和第二次过滤的回流压力为 0.06-0.09MPa ； S9、 超滤 ： 将 S8 得到的粗滤液再经截流分子量为 6000D 的超滤膜进行超滤得到促肝细 胞生长素溶液， 其中进液压力为 0.12-0.15MPa， 回流压力为 0.06-0.09MPa。 2. 根据权利要求 1 所述超声酶解促肝细胞生长素的高效制备方法， 其特征在于， S2 中， 将 S1 得到的乳猪肝颗粒加入胶体磨中以 3350-3450rpm 的转速研磨 1.4-1.6min 得到 乳猪肝糜， 将乳猪肝糜和注射用水按重量比为 11.3-11.5:11.4-11.6 加入搅拌机中， 以 360-370r。

8、pm 的转速搅拌 11-12min 得到乳猪肝匀浆。 3.根据权利要求1或2所述超声酶解促肝细胞生长素的高效制备方法， 其特征在于， S3 中， 将 S2 得到的乳猪肝匀浆置于超声波处理机内利用超声波在冰浴中处理得到超声匀浆， 超声波功率为 580-590W， 超声波频率为 53-54kHz， 超声波处理时间为 52-54s。 4. 根据权利要求 1-3 任一项所述超声酶解促肝细胞生长素的高效制备方法， 其特征 在于， S4 中， 取猪胃粘膜研磨成猪胃粘膜糜后置于反应容器中， 加入 1.5-1.6wt盐酸溶 液， 猪胃粘膜糜和盐酸溶液的体积比 (g/ml) 为 26-27:27-28， 将反应。

9、容器及其内容物置 于 46-47的水浴锅中浸提 71-72min 得到浸提液， 将浸提液以 6600-6700rpm 的转速离心 19-20min， 取上清液进行低温干燥得到胃蛋白酶。 权 利 要 求 书 CN 104313100 A 2 2/2 页 3 5. 根据权利要求 1-4 任一项所述超声酶解促肝细胞生长素的高效制备方法， 其特征在 于， S5 中， 将 S3 得到的超声匀浆置于反应容器中， 滴加 1.6-2.3mol/L 盐酸溶液至 pH 值为 2.8-3.2， 再加入 S4 得到的胃蛋白酶以 235-240rpm 的转速搅拌 31-32min 后， 将反应容器及 其内容物置于 38。

10、-39的水浴锅中水解 6.7-7.3h 得到酶解物料， 其中乳猪肝匀浆与胃蛋白 酶的重量比为 25:0.3。 6. 根据权利要求 1-5 任一项所述超声酶解促肝细胞生长素的高效制备方法， 其特征在 于， S7 中， 将 S6 得到的灭活匀浆加入离心瓶中， 以 4800-4900rpm 的转速离心 9-10min 后， 将上清液取出滴加 1.6-2.2mol/L 氢氧化钠溶液至 pH 为 6.9-7.1 得到中性离心液。 7. 根据权利要求 1-6 任一项所述超声酶解促肝细胞生长素的高效制备方法， 其特征在 于， S9 中， 将 S8 得到的粗滤液再经截流分子量为 6000D 的超滤膜进行超滤得。

11、到促肝细胞生 长素溶液， 其中进液压力为 0.13-0.14MPa， 回流压力为 0.07-0.08MPa。 权 利 要 求 书 CN 104313100 A 3 1/6 页 4 一种超声酶解促肝细胞生长素的高效制备方法 技术领域 0001 本发明涉及促肝细胞生长素技术领域， 尤其涉及一种超声酶解促肝细胞生长素的 高效制备方法。 背景技术 0002 促肝细胞生长素是一种刺激新生的人和动物肝细胞 DNA 合成的药物， 可促进肝细 胞再生， 加速肝脏组织的修复， 恢复肝功能， 改善肝脏枯否细胞的吞噬功能， 防止来自肠道 的毒素对肝细胞的损害， 促进肝坏死后的修复， 而且对肝细胞损伤有保护作用， 对。

12、肝衰竭有 明显的提高存活力的作用。促肝细胞生长素目前已经有产品上市， 以乳牛或者乳猪的新鲜 肝脏器官为原料， 经生化加工制备得到。 但现有的制备方法产率低、 活性低、 蛋白质分子大、 安全性不高。 发明内容 0003 基本背景技术存在的技术问题， 本发明提出了一种超声酶解促肝细胞生长素的高 效制备方法， 采用超声处理、 酶解和超滤工艺， 工艺简单温和， 而且节能环保， 提取率高 ； 所 制备的促肝细胞生长素的活性较高， 并且分子量小于 6000D， 安全性高， 对人的过敏反应基 本消除。 0004 本发明提出的一种超声酶解促肝细胞生长素的高效制备方法， 包括如下步骤 ： 0005 S1、 乳猪。

13、肝预处理 ： 取乳猪肝， 去除胆囊、 筋膜和结缔组织， 清水洗净， 沥水后再用 注射用水清洗， 然后切成宽度为 3-5cm 的小块或细条状， 再置于绞肉机中绞成粒径为 1-3mm 的乳猪肝颗粒 ； 0006 S2、 均质 ： 将 S1 得到的乳猪肝颗粒加入胶体磨中以 3300-3500rpm 的转速研磨 1-2min 得到乳猪肝糜， 将乳猪肝糜和注射用水按重量比为 11-12:11-12 加入搅拌机中， 以 350-380rpm 的转速搅拌 10-13min 得到乳猪肝匀浆 ； 0007 S3、 超声处理 ： 将 S2 得到的乳猪肝匀浆置于超声波处理机内利用超声波在冰浴中 处理得到超声匀浆， 。

14、超声波功率为 570-600W， 超声波频率为 52-55kHz， 超声波处理时间为 50-55s ； 0008 S4、 胃蛋白酶的制备 ： 取猪胃粘膜研磨成猪胃粘膜糜后置于反应容器中， 加 入 1.4-1.7wt盐酸溶液， 猪胃粘膜糜和盐酸溶液的体积比 (g/ml) 为 25-28:26-29， 将 反应容器及其内容物置于 45-48的水浴锅中浸提 70-73min 得到浸提液， 将浸提液以 6500-6800rpm 的转速离心 18-21min， 取上清液进行低温干燥得到胃蛋白酶 ； 0009 S5、 酶解 ： 将S3得到的超声匀浆置于反应容器中， 滴加1-3mol/L盐酸溶液至pH值 为。

15、2.5-3.5， 再加入S4得到的胃蛋白酶以230-245rpm的转速搅拌30-33min后， 将反应容器 及其内容物置于 37-40的水浴锅中水解 6.5-7.5h 得到酶解物料， 其中乳猪肝匀浆与胃蛋 白酶的重量比为 99-101:1-1.4 ； 0010 S6、 灭活 ： 将 S5 得到的酶解物料水浴加热至 81-82， 保温 14-17min 后， 将温度降 说 明 书 CN 104313100 A 4 2/6 页 5 至室温静置得到灭活匀浆 ； 0011 S7、 离心 ： 将 S6 得到的灭活匀浆加入离心瓶中， 以 4700-5000rpm 的转速离心 8-11min 后， 将上清液。

16、取出滴加 1-3mol/L 氢氧化钠溶液至 pH 为 6.8-7.2 得到中性离心液 ； 0012 S8、 粗滤 ： 将 S7 得到的中性离心液经过截留分子量为 100KD 的中空纤维超滤装置 进行第一次过滤后， 再经过截留分子量为 10KD 的中空纤维超滤装置进行第二次过滤得到 粗滤液， 其中第一次过滤和第二次过滤的回流压力为 0.06-0.09MPa ； 0013 S9、 超滤 ： 将 S8 得到的粗滤液再经截流分子量为 6000D 的超滤膜进行超滤得到促 肝细胞生长素溶液， 其中进液压力为 0.12-0.15MPa， 回流压力为 0.06-0.09MPa。 0014 优选地， S2 中，。

17、 将 S1 得到的乳猪肝颗粒加入胶体磨中以 3350-3450rpm 的转速研 磨1.4-1.6min得到乳猪肝糜， 将乳猪肝糜和注射用水按重量比为11.3-11.5:11.4-11.6加 入搅拌机中， 以 360-370rpm 的转速搅拌 11-12min 得到乳猪肝匀浆。 0015 优选地， S3 中， 将 S2 得到的乳猪肝匀浆置于超声波处理机内利用超声波在冰浴中 处理得到超声匀浆， 超声波功率为 580-590W， 超声波频率为 53-54kHz， 超声波处理时间为 52-54s。 0016 优选地， S4 中， 取猪胃粘膜研磨成猪胃粘膜糜后置于反应容器中， 加入 1.5-1.6wt盐。

18、酸溶液， 猪胃粘膜糜和盐酸溶液的体积比 (g/ml) 为 26-27:27-28， 将反 应容器及其内容物置于 46-47的水浴锅中浸提 71-72min 得到浸提液， 将浸提液以 6600-6700rpm 的转速离心 19-20min， 取上清液进行低温干燥得到胃蛋白酶。 0017 优选地， S5 中， 将 S3 得到的超声匀浆置于反应容器中， 滴加 1.6-2.3mol/L 盐酸溶 液至 pH 值为 2.8-3.2， 再加入 S4 得到的胃蛋白酶以 235-240rpm 的转速搅拌 31-32min 后， 将反应容器及其内容物置于 38-39的水浴锅中水解 6.7-7.3h 得到酶解物料，。

19、 其中乳猪肝 匀浆与胃蛋白酶的重量比为 25:0.3。 0018 优选地， S7 中， 将 S6 得到的灭活匀浆加入离心瓶中， 以 4800-4900rpm 的转速离心 9-10min后， 将上清液取出滴加1.6-2.2mol/L氢氧化钠溶液至pH为6.9-7.1得到中性离心 液。 0019 优选地， S9 中， 将 S8 得到的粗滤液再经截流分子量为 6000D 的超滤膜进行超滤得 到促肝细胞生长素溶液， 其中进液压力为 0.13-0.14MPa， 回流压力为 0.07-0.08MPa。 0020 上文中的 KD 为千道尔顿， D 为道尔顿。 0021 本发明将乳猪肝研磨成乳猪肝糜， 促使部。

20、分肝细胞的细胞膜破碎， 再通过加水搅 拌， 使肝细胞中的蛋白质溶出 ； 将乳猪肝匀浆进行冰浴超声处理， 利用超声波的空泡效应， 进一步将肝细胞的细胞膜破碎， 更加有利于肝细胞中的蛋白质溶出， 而冰浴的低温不仅使 肝细胞的细胞膜在热胀冷缩的效应下失去弹性， 更易破碎， 还能防止微生物的生长繁殖， 避免蛋白质被消耗 ； 将猪胃粘膜研磨后， 加入 1.4-1.7wt盐酸溶液消化猪胃粘膜细胞， 再通过 45-48时的浸提、 离心封层和低温干燥得到高活性的胃蛋白酶， 而且胃蛋白酶产 率高 ； 向超声匀浆中滴加盐酸溶液一方面可以促使更多肝细胞破碎， 加速蛋白质溶出， 另 一方面还可以为下一步胃蛋白酶促进蛋。

21、白质水解营造适宜的反应环境， 接着加入胃蛋白 酶并搅拌， 促使胃蛋白酶在酸性条件下与超声匀浆充分接触， 在 37-40的水浴锅中水解 6.5-7.5h， 充分水解大分子蛋白质， 使之降解为小分子多肽链和小分子蛋白质 ； 而将酶解 物料水浴加热至 81-82， 保温 14-17min， 使胃蛋白酶和剩余的大分子蛋白质变性， 有效的 说 明 书 CN 104313100 A 5 3/6 页 6 杀死可能存在的病毒和细菌， 同时保证小分子多肽链和小分子蛋白质的生物活性 ； 将灭活 匀浆离心得到上清液使大分子蛋白质沉淀， 而小分子多肽链和小分子蛋白质仍溶于溶液 中 ； 接着将中性离心液分别通过截留分子。

22、量为 100KD 的中空纤维超滤装置和截留分子量为 10KD 的中空纤维超滤装置， 形成分级过滤， 提高中性离心液的过滤效率， 并得到分子量小 于 10KD 的多肽和蛋白质， 同时控制回流压力为 0.06-0.09MPa， 既提高了过滤效率， 又能避 免某些大分子在高压下通过中空纤维超滤装置 ； 再经截流分子量为 6000D 的超滤膜进行超 滤， 同时进液压力为 0.12-0.15MPa 和回流压力为 0.06-0.09MPa， 使本发明所制备的促肝细 胞生长素中的分子小于 6000D， 大大提高了有效组分含量浓度， 而且安全性高。 0022 本发明采用超声处理、 酶解和超滤工艺， 工艺简单温。

23、和， 而且节能环保， 提取率高 ； 所制备的促肝细胞生长素的活性较高， 并且分子量小于 6000D， 安全性高， 对人的过敏反应 基本消除。 具体实施方式 0023 下面， 通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。 0024 实施例 1 0025 本发明提出的一种超声酶解促肝细胞生长素的高效制备方法， 包括如下步骤 ： 0026 S1、 乳猪肝预处理 ： 取乳猪肝， 去除胆囊、 筋膜和结缔组织， 清水洗净， 沥水后再用 注射用水清洗， 然后切成宽度为 3-5cm 的小块或细条状， 再置于绞肉机中绞成粒径为 1-3mm 的乳猪肝颗粒 ； 0027 S2、 均质 ： 将S1得到的乳猪肝颗粒加。

24、入胶体磨中以3300rpm的转速研磨2min得到 乳猪肝糜， 将乳猪肝糜和注射用水按重量比为 11:12 加入搅拌机中， 以 350rpm 的转速搅拌 13min 得到乳猪肝匀浆 ； 0028 S3、 超声处理 ： 将 S2 得到的乳猪肝匀浆置于超声波处理机内利用超声波在冰浴中 处理得到超声匀浆， 超声波功率为 570W， 超声波频率为 55kHz， 超声波处理时间为 50s ； 0029 S4、 胃蛋白酶的制备 ： 取猪胃粘膜研磨成猪胃粘膜糜后置于反应容器中， 加入 1.7wt盐酸溶液， 猪胃粘膜糜和盐酸溶液的体积比 (g/ml) 为 25:29， 将反应容器及其内容 物置于 45的水浴锅中。

25、浸提 73min 得到浸提液， 将浸提液以 6500rpm 的转速离心 21min， 取 上清液进行低温干燥得到胃蛋白酶 ； 0030 S5、 酶解 ： 将 S3 得到的超声匀浆置于反应容器中， 滴加 1mol/L 盐酸溶液至 pH 值 为 3.5， 再加入 S4 得到的胃蛋白酶以 230rpm 的转速搅拌 33min 后， 将反应容器及其内容 物置于 37的水浴锅中水解 7.5h 得到酶解物料， 其中乳猪肝匀浆与胃蛋白酶的重量比为 99:1.4 ； 0031 S6、 灭活 ： 将 S5 得到的酶解物料水浴加热至 82， 保温 14min 后， 将温度降至室温 静置得到灭活匀浆 ； 0032 。

26、S7、 离心 ： 将S6得到的灭活匀浆加入离心瓶中， 以5000rpm的转速离心8min后， 将 上清液取出滴加 3mol/L 氢氧化钠溶液至 pH 为 6.8 得到中性离心液 ； 0033 S8、 粗滤 ： 将 S7 得到的中性离心液经过截留分子量为 100KD 的中空纤维超滤装置 进行第一次过滤后， 再经过截留分子量为 10KD 的中空纤维超滤装置进行第二次过滤得到 粗滤液， 其中第一次过滤和第二次过滤的回流压力为 0.06MPa ； 说 明 书 CN 104313100 A 6 4/6 页 7 0034 S9、 超滤 ： 将 S8 得到的粗滤液再经截流分子量为 6000D 的超滤膜进行超。

27、滤得到促 肝细胞生长素溶液， 其中进液压力为 0.15MPa， 回流压力为 0.06MPa。 0035 实施例 2 0036 本发明提出的一种超声酶解促肝细胞生长素的高效制备方法， 包括如下步骤 ： 0037 S1、 乳猪肝预处理 ： 取乳猪肝， 去除胆囊、 筋膜和结缔组织， 清水洗净， 沥水后再用 注射用水清洗， 然后切成宽度为 3-5cm 的小块或细条状， 再置于绞肉机中绞成粒径为 1-3mm 的乳猪肝颗粒 ； 0038 S2、 均质 ： 将S1得到的乳猪肝颗粒加入胶体磨中以3450rpm的转速研磨1.4min得 到乳猪肝糜， 将乳猪肝糜和注射用水按重量比为 11.5:11.4 加入搅拌机。

28、中， 以 370rpm 的转 速搅拌 11min 得到乳猪肝匀浆 ； 0039 S3、 超声处理 ： 将 S2 得到的乳猪肝匀浆置于超声波处理机内利用超声波在冰浴中 处理得到超声匀浆， 超声波功率为 590W， 超声波频率为 53kHz， 超声波处理时间为 54s ； 0040 S4、 胃蛋白酶的制备 ： 取猪胃粘膜研磨成猪胃粘膜糜后置于反应容器中， 加入 1.5wt盐酸溶液， 猪胃粘膜糜和盐酸溶液的体积比 (g/ml) 为 1:1， 将反应容器及其内容物 置于 47的水浴锅中浸提 71min 得到浸提液， 将浸提液以 6700rpm 的转速离心 19min， 取上 清液进行低温干燥得到胃蛋白。

29、酶 ； 0041 S5、 酶解 ： 将 S3 得到的超声匀浆置于反应容器中， 滴加 2.3mol/L 盐酸溶液至 pH 值为 2.8， 再加入 S4 得到的胃蛋白酶以 240rpm 的转速搅拌 31min 后， 将反应容器及其内容 物置于 38的水浴锅中水解 7.3h 得到酶解物料， 其中乳猪肝匀浆与胃蛋白酶的重量比为 25:0.3 ； 0042 S6、 灭活 ： 将 S5 得到的酶解物料水浴加热至 81， 保温 16min 后， 将温度降至室温 静置得到灭活匀浆 ； 0043 S7、 离心 ： 将 S6 得到的灭活匀浆加入离心瓶中， 以 4800rpm 的转速离心 10min 后， 将上清液。

30、取出滴加 1.6mol/L 氢氧化钠溶液至 pH 为 7.1 得到中性离心液 ； 0044 S8、 粗滤 ： 将 S7 得到的中性离心液经过截留分子量为 100KD 的中空纤维超滤装置 进行第一次过滤后， 再经过截留分子量为 10KD 的中空纤维超滤装置进行第二次过滤得到 粗滤液， 其中第一次过滤和第二次过滤的回流压力为 0.08MPa ； 0045 S9、 超滤 ： 将 S8 得到的粗滤液再经截流分子量为 6000D 的超滤膜进行超滤得到促 肝细胞生长素溶液， 其中进液压力为 0.13MPa， 回流压力为 0.08MPa。 0046 实施例 3 0047 本发明提出的一种超声酶解促肝细胞生长。

31、素的高效制备方法， 包括如下步骤 ： 0048 S1、 乳猪肝预处理 ： 取乳猪肝， 去除胆囊、 筋膜和结缔组织， 清水洗净， 沥水后再用 注射用水清洗， 然后切成宽度为 3-5cm 的小块或细条状， 再置于绞肉机中绞成粒径为 1-3mm 的乳猪肝颗粒 ； 0049 S2、 均质 ： 将S1得到的乳猪肝颗粒加入胶体磨中以3350rpm的转速研磨1.6min得 到乳猪肝糜， 将乳猪肝糜和注射用水按重量比为 11.3:11.6 加入搅拌机中， 以 360rpm 的转 速搅拌 12min 得到乳猪肝匀浆 ； 0050 S3、 超声处理 ： 将 S2 得到的乳猪肝匀浆置于超声波处理机内利用超声波在冰浴。

32、中 处理得到超声匀浆， 超声波功率为 580W， 超声波频率为 54kHz， 超声波处理时间为 52s ； 说 明 书 CN 104313100 A 7 5/6 页 8 0051 S4、 胃蛋白酶的制备 ： 取猪胃粘膜研磨成猪胃粘膜糜后置于反应容器中， 加入 1.6wt盐酸溶液， 猪胃粘膜糜和盐酸溶液的体积比 (g/ml) 为 13:14， 将反应容器及其内容 物置于 46的水浴锅中浸提 72min 得到浸提液， 将浸提液以 6600rpm 的转速离心 20min， 取 上清液进行低温干燥得到胃蛋白酶 ； 0052 S5、 酶解 ： 将 S3 得到的超声匀浆置于反应容器中， 滴加 1.6mol。

33、/L 盐酸溶液至 pH 值为 3.2， 再加入 S4 得到的胃蛋白酶以 235rpm 的转速搅拌 32min 后， 将反应容器及其内容 物置于 38的水浴锅中水解 7.3h 得到酶解物料， 其中乳猪肝匀浆与胃蛋白酶的重量比为 25:0.3 ； 0053 S6、 灭活 ： 将 S5 得到的酶解物料水浴加热至 81.2， 保温 15min 后， 将温度降至室 温静置得到灭活匀浆 ； 0054 S7、 离心 ： 将S6得到的灭活匀浆加入离心瓶中， 以4900rpm的转速离心9min后， 将 上清液取出滴加 2.2mol/L 氢氧化钠溶液至 pH 为 6.9 得到中性离心液 ； 0055 S8、 粗滤。

34、 ： 将 S7 得到的中性离心液经过截留分子量为 100KD 的中空纤维超滤装置 进行第一次过滤后， 再经过截留分子量为 10KD 的中空纤维超滤装置进行第二次过滤得到 粗滤液， 其中第一次过滤和第二次过滤的回流压力为 0.07MPa ； 0056 S9、 超滤 ： 将 S8 得到的粗滤液再经截流分子量为 6000D 的超滤膜进行超滤得到促 肝细胞生长素溶液， 其中进液压力为 0.14MPa， 回流压力为 0.07MPa。 0057 实施例 4 0058 本发明提出的一种超声酶解促肝细胞生长素的高效制备方法， 包括如下步骤 ： 0059 S1、 乳猪肝预处理 ： 取乳猪肝， 去除胆囊、 筋膜和。

35、结缔组织， 清水洗净， 沥水后再用 注射用水清洗， 然后切成宽度为 3-5cm 的小块或细条状， 再置于绞肉机中绞成粒径为 1-3mm 的乳猪肝颗粒 ； 0060 S2、 均质 ： 将S1得到的乳猪肝颗粒加入胶体磨中以3500rpm的转速研磨1min得到 乳猪肝糜， 将乳猪肝糜和注射用水按重量比为 12:11 加入搅拌机中， 以 380rpm 的转速搅拌 10min 得到乳猪肝匀浆 ； 0061 S3、 超声处理 ： 将 S2 得到的乳猪肝匀浆置于超声波处理机内利用超声波在冰浴中 处理得到超声匀浆， 超声波功率为 600W， 超声波频率为 52kHz， 超声波处理时间为 55s ； 0062 。

36、S4、 胃蛋白酶的制备 ： 取猪胃粘膜研磨成猪胃粘膜糜后置于反应容器中， 加入 1.4wt盐酸溶液， 猪胃粘膜糜和盐酸溶液的体积比 (g/ml) 为 28:26， 将反应容器及其内容 物置于 48的水浴锅中浸提 70min 得到浸提液， 将浸提液以 6800rpm 的转速离心 18min， 取 上清液进行低温干燥得到胃蛋白酶 ； 0063 S5、 酶解 ： 将 S3 得到的超声匀浆置于反应容器中， 滴加 3mol/L 盐酸溶液至 pH 值 为 2.5， 再加入 S4 得到的胃蛋白酶以 245rpm 的转速搅拌 30min 后， 将反应容器及其内容 物置于 40的水浴锅中水解 6.5h 得到酶解。

37、物料， 其中乳猪肝匀浆与胃蛋白酶的重量比为 101:1 ； 0064 S6、 灭活 ： 将 S5 得到的酶解物料水浴加热至 81.5， 保温 17min 后， 将温度降至室 温静置得到灭活匀浆 ； 0065 S7、 离心 ： 将 S6 得到的灭活匀浆加入离心瓶中， 以 4700rpm 的转速离心 11min 后， 将上清液取出滴加 1mol/L 氢氧化钠溶液至 pH 为 7.2 得到中性离心液 ； 说 明 书 CN 104313100 A 8 6/6 页 9 0066 S8、 粗滤 ： 将 S7 得到的中性离心液经过截留分子量为 100KD 的中空纤维超滤装置 进行第一次过滤后， 再经过截留分子量为 10KD 的中空纤维超滤装置进行第二次过滤得到 粗滤液， 其中第一次过滤和第二次过滤的回流压力为 0.09MPa ； 0067 S9、 超滤 ： 将 S8 得到的粗滤液再经截流分子量为 6000D 的超滤膜进行超滤得到促 肝细胞生长素溶液， 其中进液压力为 0.12MPa， 回流压力为 0.09MPa。 0068 以上所述， 仅为本发明较佳的具体实施方式， 但本发明的保护范围并不局限于此， 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内， 根据本发明的技术方案及其 发明构思加以等同替换或改变， 都应涵盖在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 104313100 A 9 。