一种细胞催化生产氟吡啶乙酮的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104293856 A (43)申请公布日 2015.01.21 CN 104293856 A (21)申请号 201410594936.1 (22)申请日 2014.10.30 C12P 17/18(2006.01) C12R 1/80(2006.01) (71)申请人 青岛科技大学 地址 266061 山东省青岛市崂山区松岭路 99 号 (72)发明人 刘均洪 高鑫 (54) 发明名称 一种细胞催化生产氟吡啶乙酮的方法 (57) 摘要 一种细胞催化生产光活性苯乙醇的方法， 即 用青霉菌细胞生物催化制备光活性 (S)-5- （1- 羟 乙基） 氟 2,3-c 吡啶，。

2、 反应罐中加入磷酸盐缓冲 液， 加入苎麻纱布调控底物、 产物浓度。用青霉菌 细胞进行生物催化反应， 产品收率高， 对映体过量 率 （ee%） 高， 具有很好的应用前景。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 (10)申请公布号 CN 104293856 A CN 104293856 A 1/1 页 2 1. 一种青霉菌细胞生物催化制备 (S)-5-（1- 羟乙基） 氟 2,3-c 吡啶的方法， 其特征 在于反应罐中加入磷酸盐缓冲液， pH 为 5.2， 加入吸附了底物 1-（5-（氟 。

3、2， 3-c 吡啶基） ） 乙酮的苎麻纱布， 使底物 1-（5-（氟 2， 3-c 吡啶基） ） 乙酮添加量为 80-90 g/L， 玉米浆 ( 以干物质计 ) 含量为 11-13g/L， 葡萄糖含量为 15-17g/L， 木糖 16-18g/L， 吐温 80 含量为 11-13g/L， 121高压灭菌30分钟 ； 冷却至26-27时， 加入湿青霉菌细胞使浓度为40-44g/ L， 通气比为 0.15-0.16V/（V 分钟） ， 进行生物催化反应， 反应时间为 65-69 小时 ； 反应结 束后， 分别滤出细胞、 苎麻纱布， 用乙酸乙酯萃取反应液、 萃取苎麻纱布， 合并乙酸乙酯萃取 液， 蒸。

4、出乙酸乙酯， 得到产物 (S)-5-（1- 羟乙基） 氟 2,3-c 吡啶， 反应转化率 96-98， 产 品收率 94-96， 对映体过量率 （ee%） 98-99。 2. 权利要求 1 所述的方法， 其特征在于所述吸附了底物的苎麻纱布制作方法为， 将 底物 1-（5-（氟 2， 3-c 吡啶基） ） 乙酮用尺寸为 0.5cmX0.5cm 的苎麻纱布吸收， 即得到 吸附了底物的苎麻纱布， 调节底物与苎麻纱布用量， 使得底物与苎麻纱布的质量比率为 0.24-0.26。 权 利 要 求 书 CN 104293856 A 2 1/4 页 3 一种细胞催化生产氟吡啶乙酮的方法 技术领域 0001 本。

5、发明属于制药工程技术领域， 特别涉及到青霉菌细胞生物催化制备手性医药中 间体 (S)-5-（1- 羟乙基） 氟 2,3-c 吡啶的技术。 背景技术 0002 手性 (S)-5-（1- 羟乙基） 氟 2,3-c 吡啶是合成手性药物、 精细化学品、 农药品和 其他特殊材料的重要中间体。 生物催化不对称反应具有环境友好、 条件温和、 选择性高等优 点,作为绿色高效制备羟基手性化合物的优先途径,被越来越多地应用于生产一些高附加 值的手性化合物。生物催化制备手性 (S)-5-（1- 羟乙基） 氟 2,3-c 吡啶具有很好的应用 前景。 0003 生物催化具有催化效率高、 选择性强、 条件温和、 环境友好。

6、等突出优点 , 是可持续 发展过程中替代和拓展传统有机化学合成的重要方法。 其中手性拆分和不对称合成是生物 催化最具吸引力的应用领域。在作为生物催化剂的六大类酶中 , 水解酶能够催化动力学拆 分外消旋体得到手性产品 , 在工业生物催化中一直扮演着重要角色。近几年来 , 氧化还原 酶在工业上的应用得到了迅速增长。目前 , 采用水解酶动力学拆分法、 生物催化法和生物 氧化法工业制备光学活性手性化合物的比例为 4:2:1。生物细胞还原法相对于动力学拆分 法而言 , 最大的优势在于理论收率可达 100%, 原子经济性好。然而生物还原反应需要辅酶 或辅因子的参与 , 一定程度上限制了其应用。由于辅酶依赖。

7、性的缘故 , 生物还原反应中多 釆用整细胞作为催化剂 , 实现体内辅酶循环再生的同时免去了酶的分离纯化步骤。 0004 (S)-5-（1- 羟乙基） 氟 2,3-c 吡啶是合成手性药物、 精细化学品、 农药品的重要 手性砌块， 由于有 2 个手性中心， 使得化学合成较为困难， 成本高。本发明将采用生物催化 制备 (S)-5-（1- 羟乙基） 氟 2,3-c 吡啶。 发明内容 0005 本发明采用青霉菌细胞催化制备 (S)-5-（1- 羟乙基） 氟 2,3-c 吡啶， 反应式如 下 ： 底物 1- （5- （氟 2， 3-c 吡啶基） ） 乙酮 （1） 经青霉菌催化反应， 得到产物 (S)-5-。

8、 （1- 羟 乙基） 氟 2,3-c 吡啶 （2） 。有多种微生物可以催化此反应， 经过大量实验筛选， 最终确定 采用青霉菌作为催化剂， 因为其催化 1 反应的效果最好， 反应收率、 对映体过量率 （ee%） 均 很高。 0006 许多青霉菌都可以进行生物催化本反应， 然而， 其效果不同， 相差很大， 经实验， 本 说 明 书 CN 104293856 A 3 2/4 页 4 发明选用青霉菌菌株为 ATCC 204054， 其催化本反应效果最佳。 0007 培养介质 ： 1、 培养液成份 ： 玉米浆 ( 以干物质计 ) 含量为 35-45g/L， 酵母浸膏 8-10 g/L， 葡 萄糖 18-。

9、22 g/L， 麦芽浸膏 25-30 g， 硫酸铵 0.5-0.7g/L， 硫酸镁 0.3-0.4g/L， 磷酸二氧钾 1.8-2.3g/L， 碳酸钙 0.7 g/L, 硫酸亚铁 0.18 g/L, 硫酸锰 0.025 g/L;pH 4.7-4.9。 0008 2、 固体培养基成份 ： 在液体培养基中加入 1.5-2% 的琼脂粉。 0009 青霉菌细胞制备。青霉菌经斜面、 摇瓶、 种子罐培养得到种子液 ； 发酵罐加入培养 液， 装料系数为 0.6-0.7， 121高压灭菌 30 分钟， 冷却至 25-26， 将青霉菌 ATCC 204054 种子液接种至发酵罐， 接种比例为 10-15， 通气。

10、比为 0.5-1V/ （V 分钟） ， 即每分钟通气量为 0.5-1 倍发酵液体积， 25-26培养 32-40 小时， 用过滤式离心机离心得到湿青霉菌细胞， 用 作生物催化反应催化剂。湿细胞制取技术为成熟技术。 0010 由于底物、 产物均对青霉菌细胞有抑制作用， 为了减少底物、 产物对细胞的抑制， 本发明采用苎麻纱布吸附底物， 反应中， 当底物被细胞催化反应， 浓度降低时， 底物从苎麻 纱布溶出， 补充反应消耗的底物。同时， 产物被苎麻纱布吸附， 减少了其在水中的浓度， 从 而大幅度降低了底物、 产物对细胞的抑制。底物与苎麻纱布的比率， 决定了反应液中底物、 产物的浓度， 而且， 浓度还与。

11、反应温度、 反应液成份有关。不同细胞对底物、 产物的敏感度 不同， 所以， 要进行大量实验， 才能确定最佳的底物与苎麻纱布的比率。 实验表明， 对于本发 明的菌株、 反应液成份、 反应温度， 最佳的底物与苎麻纱布的比率为 0.24-0.26。具体吸附 时， 将底物 1-（5-（氟 2， 3-c 吡啶基） ） 乙酮用尺寸为 0.5cmX0.5cm 的苎麻纱布吸收， 即 得到吸附了底物的苎麻纱布。调节底物与苎麻纱布用量， 使得底物与苎麻纱布的质量比率 为0.24-0.26。 所用苎麻纱布为普通苎麻纱布， 从市场上购买后， 切成0.5cmX0.5cm小块， 灭 菌， 无菌保存待用。 0011 底部通。

12、气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液， pH 为 5.2， 加入吸附了底物 1-（5-（氟 2， 3-c 吡啶基） ） 乙酮的苎麻纱布， 使底物 1- （5- （氟 2， 3-c 吡啶基） ） 乙酮添加量为 80-90 g/L， 玉米浆 ( 以干物质计 ) 含量为 11-13g/L， 葡萄糖含量为 15-17g/L， 木糖 16-18g/L， 吐温 80 含量为 11-13g/L， 121高压灭菌 30 分钟 ； 冷却至 26-27时， 加入湿青霉菌细胞 使浓度为 40-44g/L， 通气比为 0.15-0.16V/（V 分钟） ， 即每分钟通气量为 0.15-0.16 倍反 应液体积， 进行生物催。

13、化反应， 反应时间为 65-69 小时 ； 反应结束后， 分别滤出细胞、 苎麻纱 布， 用乙酸乙酯萃取反应液、 萃取苎麻纱布， 合并乙酸乙酯萃取液， 蒸出乙酸乙酯， 得到产物 (S)-5-（1- 羟乙基） 氟 2,3-c 吡啶， 反应转化率 96-98， 产品收率 94-96， 对映体过量 率 （ee%） 98-99。 0012 本发明所开展工作包括菌株选择 （从近百个菌株中选择） 、 催化反应条件优化 （反 应温度、 通气量、 pH） 、 反应介质选择和浓度优化 （底物浓度、 葡萄糖含量、 木糖含量、 表面活 性剂种类 （20 多种选 1） 及浓度、 其它多种成份选择排除） ， 采用固体吸附。

14、控制底物产物浓 度， 从而减少对细胞的抑制， 试验了白土、 硅藻土、 棉纱布、 苎麻纱布、 大孔树酯等多种固体 材料， 还曾进行了水 - 有机溶剂 2 相体系试验。由于试验量很大， 尽管采用了响应面优化设 计试验， 大幅度减少了试验量， 试验量仍然很大， 全部试验进行 2 年多才完成， 达成目前的 技术方案。对于光活性产物而言， 当反应转化率 96-98， 产品收率 94-96时， 对映体过量 率 （ee%） 仍然高达 98-99， 是非常不易的， 我们的工作取得了显著进步。 说 明 书 CN 104293856 A 4 3/4 页 5 0013 实施例 1 用常规方法制取湿青霉菌 ATCC 。

15、204054 细胞， 用作生物催化反应催化剂。 0014 吸附了底物的苎麻纱布制作方法为， 将底物 1-（5-（氟 2， 3-c 吡啶基） ） 乙酮用 尺寸为 0.5cmX0.5cm 的苎麻纱布吸收， 即得到吸附了底物的苎麻纱布， 调节底物与苎麻纱 布用量， 使得底物与苎麻纱布的质量比率为0.24。 所用苎麻纱布为普通苎麻纱布， 从市场上 购买后， 切成 0.5cmX0.5cm 小块， 灭菌， 无菌保存待用， 其它实施例苎麻纱布处理相同。 0015 15L 底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液， pH 为 5.2， 加入吸附了底物 1-（5-（氟 2， 3-c 吡啶基） ） 乙酮的苎麻纱布， 。

16、使底物 1-（5-（氟 2， 3-c 吡啶基） ） 乙酮 添加量为 80 g/L， 玉米浆 ( 以干物质计 ) 含量为 11g/L， 葡萄糖含量为 15g/L， 木糖 16g/L， 吐温80含量为11g/L， 121高压灭菌30分钟 ； 冷却至26时， 加入湿青霉菌细胞使浓度为 40g/L， 通气比为 0.15V/（V 分钟） ， 即每分钟通气量为 0.15 倍反应液体积， 进行生物催化反 应， 反应时间为 65 小时 ； 反应结束后， 分别滤出细胞、 苎麻纱布， 用乙酸乙酯萃取反应液、 萃 取苎麻纱布， 合并乙酸乙酯萃取液， 蒸出乙酸乙酯， 得到产物 (S)-5- （1- 羟乙基） 氟 2,。

17、3-c 吡啶， 反应转化率 96， 产品收率 94， 对映体过量率 （ee%） 99。 0016 实施例 2 用常规方法制取湿青霉菌 ATCC 204054 细胞， 用作生物催化反应催化剂。 0017 吸附了底物的苎麻纱布制作方法为， 将底物 1-（5-（氟 2， 3-c 吡啶基） ） 乙酮用 尺寸为 0.5cmX0.5cm 的苎麻纱布吸收， 即得到吸附了底物的苎麻纱布， 调节底物与苎麻纱 布用量， 使得底物与苎麻纱布的质量比率为 0.24-0.26。 0018 100L 底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液， pH 为 5.2， 加入吸附了底物 1-（5-（氟 2， 3-c 吡啶基） ） 乙。

18、酮的苎麻纱布， 使底物 1-（5-（氟 2， 3-c 吡啶基） ） 乙酮 添加量为 90 g/L， 玉米浆 ( 以干物质计 ) 含量为 13g/L， 葡萄糖含量为 17g/L， 木糖 18g/L， 吐温80含量为13g/L， 121高压灭菌30分钟 ； 冷却至27时， 加入湿青霉菌细胞使浓度为 44g/L， 通气比为 0.16V/（V 分钟） ， 即每分钟通气量为 0.16 倍反应液体积， 进行生物催化反 应， 反应时间为 69 小时 ； 反应结束后， 分别滤出细胞、 苎麻纱布， 用乙酸乙酯萃取反应液、 萃 取苎麻纱布， 合并乙酸乙酯萃取液， 蒸出乙酸乙酯， 得到产物 (S)-5- （1- 羟。

19、乙基） 氟 2,3-c 吡啶， 反应转化率 98， 产品收率 96， 对映体过量率 （ee%） 98。 0019 实施例 3 用常规方法制取湿青霉菌 ATCC 204054 细胞， 用作生物催化反应催化剂。 0020 吸附了底物的苎麻纱布制作方法为， 将底物 1-（5-（氟 2， 3-c 吡啶基） ） 乙酮用 尺寸为 0.5cmX0.5cm 的苎麻纱布吸收， 即得到吸附了底物的苎麻纱布， 调节底物与苎麻纱 布用量， 使得底物与苎麻纱布的质量比率为 0.25。 0021 500L 底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液， pH 为 5.2， 加入吸附了底物 1-（5-（氟 2， 3-c 吡啶基） 。

20、） 乙酮的苎麻纱布， 使底物 1-（5-（氟 2， 3-c 吡啶基） ） 乙酮 添加量为 85 g/L， 玉米浆 ( 以干物质计 ) 含量为 12g/L， 葡萄糖含量为 16g/L， 木糖 17g/L， 吐温 80 含量为 12g/L， 121高压灭菌 30 分钟 ； 冷却至 26-27时， 加入湿青霉菌细胞使浓 度为 42g/L， 通气比为 0.155V/ （V 分钟） ， 即每分钟通气量为 0.155 倍反应液体积， 进行生物 催化反应， 反应时间为 67 小时 ； 反应结束后， 分别滤出细胞、 苎麻纱布， 用乙酸乙酯萃取反 应液、 萃取苎麻纱布， 合并乙酸乙酯萃取液， 蒸出乙酸乙酯， 得。

21、到产物 (S)-5-（1- 羟乙基） 氟 说 明 书 CN 104293856 A 5 4/4 页 6 2,3-c 吡啶， 反应转化率 97.2， 产品收率 95.1， 对映体过量率 （ee%） 98.4。 0022 实施例 4 用常规方法制取湿青霉菌 ATCC 204054 细胞， 用作生物催化反应催化剂。 0023 吸附了底物的苎麻纱布制作方法为， 将底物 1-（5-（氟 2， 3-c 吡啶基） ） 乙酮用 尺寸为 0.5cmX0.5cm 的苎麻纱布吸收， 即得到吸附了底物的苎麻纱布， 调节底物与苎麻纱 布用量， 使得底物与苎麻纱布的质量比率为 0.26。 0024 1000L 底部通气搅。

22、拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液， pH 为 5.2， 加入吸附了底物 1-（5-（氟 2， 3-c 吡啶基） ） 乙酮的苎麻纱布， 使底物 1-（5-（氟 2， 3-c 吡啶基） ） 乙酮 添加量为 89 g/L， 玉米浆 ( 以干物质计 ) 含量为 12g/L， 葡萄糖含量为 16g/L， 木糖 18g/L， 吐温80含量为13g/L， 121高压灭菌30分钟 ； 冷却至27时， 加入湿青霉菌细胞使浓度为 44g/L， 通气比为 0.16V/（V 分钟） ， 即每分钟通气量为 0.16 倍反应液体积， 进行生物催化反 应， 反应时间为 69 小时 ； 反应结束后， 分别滤出细胞、 苎麻纱布， 用乙酸乙酯萃取反应液、 萃 取苎麻纱布， 合并乙酸乙酯萃取液， 蒸出乙酸乙酯， 得到产物 (S)-5- （1- 羟乙基） 氟 2,3-c 吡啶， 反应转化率 98， 产品收率 95.7， 对映体过量率 （ee%） 98.5。 说 明 书 CN 104293856 A 6 。