NGF基因聚阳离子纳米颗粒复合物及其制备方法和应用.pdf

本发明涉及NGF基因-聚阳离子纳米颗粒复合物及其制备方法和应用。所述纳米颗粒复合物包含NGF基因物质和聚阳离子，所述的聚阳离子是聚精胺咪唑-4,5-二亚胺或聚精胺咪唑-4,5-二酰胺，所述的聚阳离子与NGF基因物质的质量比为5~100。本发明的纳米颗粒复合物毒性小、转染效率高，可以在体内循环过程中兼顾到达靶细胞之前的稳定性和进入靶细胞之后的生物响应性，聚阳离子自身可在体内完成无毒化的代谢，因此可通过颅内局部注射用于帕金森病及其并发症的治疗。

权利要求书
1.  一种NGF基因-聚阳离子纳米颗粒复合物，其特征在于，它包含NGF基因物质和聚阳离子，所述的聚阳离子是聚精胺咪唑-4, 5-二亚胺或聚精胺咪唑-4, 5-二酰胺，所述的聚阳离子与NGF基因物质的质量比为5~100。

2.  根据权利要求1所述的NGF基因-聚阳离子纳米颗粒复合物，其特征在于，所述的聚阳离子与NGF基因物质的质量比为40~50。

3.  根据权利要求1所述的NGF基因-聚阳离子纳米颗粒复合物，其特征在于，它是由以下方法制备得到的：
（1）将聚阳离子溶液快速加入到相同体积的NGF基因溶液中，混合均匀；
（2）将混合溶液于室温下孵育20～30分钟，即得NGF基因-聚阳离子纳米颗粒复合物。

4.  根据权利要求1所述的NGF基因-聚阳离子纳米颗粒复合物，其特征在于，所述的聚精胺咪唑-4, 5-二亚胺结构式为：
，
其中，n为100~500。

5.  根据权利要求1所述的NGF基因-聚阳离子纳米颗粒复合物，其特征在于，所述的聚精胺咪唑-4, 5-二酰胺结构式为：
，
其中，n为100~500。

6.  根据权利要求1所述的NGF基因-聚阳离子纳米颗粒复合物，其特征在于，所述的NGF基因-聚阳离子纳米颗粒复合物的粒径为100～300 纳米。

7.  权利要求1所述的NGF基因-聚阳离子纳米颗粒复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将聚阳离子溶液快速加入到相同体积的NGF基因溶液中，混合均匀；
（2）将混合溶液于室温下孵育20～30分钟，即得NGF基因-聚阳离子纳米颗粒复合物。

8.  根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，
所述的聚精胺咪唑-4, 5-二亚胺结构式为：
，
所述的聚精胺咪唑-4, 5-二酰胺结构式为：
，
其中，n为100~500。

9.  根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的NGF基因-聚阳离子纳米颗粒复合物的粒径为100～300 纳米。

10.  权利要求1所述的NGF基因-聚阳离子纳米颗粒复合物在制备治疗帕金森病或异动症药物中的应用。

说明书NGF基因-聚阳离子纳米颗粒复合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及非病毒基因载体技术领域，具体地说，涉及NGF基因-聚阳离子纳米颗粒复合物及其制备方法和应用。
背景技术
在基因治疗的发展过程中，基因运载系统即基因载体的研究始终是人们关注的焦点，基因载体能否安全有效地运载基因到指定地点是基因治疗是否能在临床上应用的关键所在。基因载体可分为病毒型载体和非病毒型载体两大类。虽然目前使用最多的仍然是病毒型载体，其转染效率可达90％以上，但病毒载体存在自身难以克服的局限性，如能诱导宿主免疫反应及潜在的致癌性，制备复杂，而且所能装载的外源DNA大小有限，使其应用受到很大限制。于是，人们开始着眼于非病毒型载体的研究。目前已有的非病毒型载体介导基因转染的方法有裸DNA注射、磷酸钙介导、电转移法、阳离子脂质体及阳离子聚合物介导等，前三者虽然没有病毒载体的缺点，但转染效率不尽如人意。阳离子脂质体转染效率较高、重复性好，但转染时需除血清，体内不稳定一直是困扰医学界的难题。从目前发展趋势看，阳离子聚合物载体在基因转移方面呈现显著优势。
阳离子聚合物又称聚阳离子，种类很多，目前研究较多的有多肽类：聚赖氨酸、聚谷氨酸及其衍生物；多聚胺类：聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺树状物；聚甲基丙烯酸类：聚酰胺-胺型树状物、聚甲基丙烯酸乙酯2－（二甲胺）；以及一些天然高分子如壳聚糖、明胶等。这些聚合物结构上的一个共同特点是分子内含有许多氨基，在生理pH下会发生质子化，这些质子化的氨基可以中和DNA质粒表面的负电荷，使DNA分子由伸展结构压缩为体积相对较小的DNA粒子，或将目的基因包裹在其中，使DNA免受核酸酶的降解，它们可以作为基因载体。
阳离子聚合物-DNA复合物主要是通过细胞内吞作用将DNA转移进入细胞，形成内含体（endosome），DNA从内含体释放，进入细胞质中，再进一步进入核内转录、表达。
聚精胺咪唑-4, 5-二亚胺（Polyspermine imidazole-4,5-imine，PSI）结构式如下：
，
聚精胺咪唑-4, 5-二酰胺（Polyspermine imidazole-4,5-amide，PSIA）结构式如下：
，
以上两种化合物均为聚阳离子。
    NGF蛋白（由NGF基因编码）对发育的和成熟的运动神经元都有神经营养活性，其对运动神经元的作用是迄今发现的基因当中最强的，可以促进运动神经元的存活、分化及代谢活性，且对胚胎期或出生后损伤的运动神经元都有很强的修复作用。NGF蛋白对神经元特别是多巴氨能神经元和运动神经元所具有的明显修复损伤作用，为帕金森病的治疗提供了可能。
目前关于使用NGF基因与PSI或PSIA聚阳离子形成的纳米颗粒复合物治疗帕金森病还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种NGF基因-聚阳离子纳米颗粒复合物。
本发明的再一的目的是，提供所述的NGF基因-聚阳离子纳米颗粒复合物的制备方法。
本发明的另一的目的是，提供所述的NGF基因-聚阳离子纳米颗粒复合物的用途。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
一种NGF基因-聚阳离子纳米颗粒复合物，它包含NGF基因物质和聚阳离子，所述的聚阳离子是聚精胺咪唑-4, 5-二亚胺或聚精胺咪唑-4, 5-二酰胺，所述的聚阳离子与NGF基因物质的质量比为5~100。
所述的聚阳离子与NGF基因物质的质量比为40~50。
它是由以下方法制备得到的：
（1）将聚阳离子溶液快速加入到相同体积的NGF基因溶液中，混合均匀；
（2）将混合溶液于室温下孵育20～30分钟，即得NGF基因-聚阳离子纳米颗粒复合物。
所述的聚精胺咪唑-4, 5-二亚胺结构式为：
，
其中，n为100~500。
所述的聚精胺咪唑-4, 5-二酰胺结构式为：
，
其中，n为100~500。
所述的NGF基因-聚阳离子纳米颗粒复合物的粒径为100～300 纳米。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
如上所述的NGF基因-聚阳离子纳米颗粒复合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）将聚阳离子溶液快速加入到相同体积的NGF基因溶液中，混合均匀；
（2）将混合溶液于室温下孵育20～30分钟，即得NGF基因-聚阳离子纳米颗粒复合物。
    所述的聚精胺咪唑-4, 5-二亚胺结构式为：
，
所述的聚精胺咪唑-4, 5-二酰胺结构式为：
，
其中，n为100~500。
所述的NGF基因-聚阳离子纳米颗粒复合物的粒径为100～300 纳米。
步骤（1）中混合的速度优选为200～2000rpm，孵育时间优选为20～30分钟。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
如上所述的NGF基因-聚阳离子纳米颗粒复合物在制备治疗帕金森病或异动症药物中的应用。
本发明的NGF基因-聚阳离子纳米颗粒复合物可直接颅内注射于帕金森病患者纹状体内，或静脉注射、鼻腔给药、吸入给药，用于治疗帕金森病或其异动症，注射剂量为0.5 mg到100 mg。
本发明中，用于治疗帕金森病或其异动症的基因序列不仅限于实施例，只要包含NGF基因的功能性序列即可。
本发明优点在于：
与现有技术相比，本发明的聚阳离子聚精胺咪唑-4, 5-二亚胺和聚精胺咪唑-4, 5-二酰胺能够凝聚、输送NGF基因，可以在体内循环过程中兼顾到达靶细胞之前的稳定性和进入靶细胞之后的生物响应性，且聚阳离子自身可在体内完成无毒化的代谢，因此可通过颅内局部注射用于帕金森病及其并发症的治疗。总体来说，具备结合DNA能力强、毒性小、转染效率高的优点。相比于病毒输送载体，无风险、无毒副作用。本发明的制备方法可制备获得粒径分布均匀和基因物质分布均匀的纳米颗粒复合物。
具体实施方式
下面对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
本发明对NGF基因-聚阳离子纳米颗粒复合物的理化性质表征方法包括：琼脂糖凝胶电泳、透射电子显微镜、动态光散射和zeta电位测试。NGF基因-聚阳离子纳米颗粒复合物基因转染和细胞毒性测试选用的细胞是PC-12细胞。NGF基因-聚阳离子纳米颗粒复合物对帕金森病及其异动症的治疗试验选用的PD老鼠模型。
以下实施例中，所述的PSIA和PSI结构式分别为：
，，
其中，n为100~500。
以下实施例中，所用NGF基因的具体序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例1  NGF基因-聚阳离子纳米颗粒复合物的制备
称取一定量PSIA或PSI溶解于水中，使浓度为2.0 mg/ml，经0.45 μm的水膜过滤后备用；吸取一定量NGF基因溶液并用水稀释成20 μg/ml的NGF基因储备液。制备PSIA或PSI与NGF基因纳米颗粒复合物时，按照设定的一系列聚阳离子和NGF基因的质量比，将聚阳离子溶液稀释成相应浓度，再快速加入到相同体积且浓度固定的NGF基因溶液中，使NGF基因的终浓度为20 μg/ml，最后1100rpm均匀混合溶液，室温下孵育25分钟，得到一系列聚阳离子与NGF基因不同质量比的纳米颗粒溶液，聚阳离子与NGF基因的质量比为5，7，10，20，40，50，100。
实施例2  NGF基因-聚阳离子纳米颗粒复合物的琼脂糖凝胶电泳
称取1.0 g 琼脂糖，加入100 ml 1×TAE缓冲液，在微波炉中加热溶解，待温度降至65℃，加入溴化乙啶（EB），配制成1.0 % 琼脂糖溶液（含0.5 μg/ml溴化乙啶），倒入制胶槽中，插入样品梳，室温放置0.5 - 1小时等胶凝固。然后，拔出样品梳，在电泳槽中加入TAE缓冲液没过凝胶，等待上样。接着，参照实施例1的纳米颗粒复合物溶液的制备方法，配制不同质量比的纳米颗粒复合物溶液，纳米颗粒复合物溶液中PSIA或PSI与NGF基因的质量比依次为0，1，2，3，5，7，10，15，20，30，50，70，100。Marker选用DSTM5000（100 – 5000 bp），上样2 μl；6×上样缓冲液（溴酚兰-甘油指示剂，含0.25 %溴酚兰，40 %甘油）1 μl与纳米颗粒复合物溶液5 μl均匀混合，上样6 μl。在110 mV电压下电泳45分钟，最后置于紫外凝胶成像系统观察并记录电泳图。电泳图谱表明：当PSIA或PSI与NGF基因的质量比为1时，NGF基因分子在电场中的泳动受到部分阻滞，随着PSIA或PSI与NGF基因质量比的逐渐增加，当PSIA或PSI与NGF基因的质量比位于5-7之间时，聚阳离子PSIA或PSI几乎完全阻滞了NGF基因分子的迁移，甚至在更大的质量比条件下，聚精胺阳离子能够更加充分的包裹NGF基因分子，电泳图里完全观察不到NGF基因分子的移动。实验证明了PSIA或PSI具有比较理想的凝聚NGF基因形成复合物颗粒的能力，从而发挥保护NGF基因的作用，以避免其在细胞吞噬前被降解。
实施例3  NGF基因-聚阳离子纳米颗粒复合物的透射电镜观察
按照实施例1的纳米颗粒复合物溶液的制备方法来配制PSIA或PSI与NGF基因的质量比为40的纳米颗粒复合物溶液，样品量为100 μl。先吸取10 μl纳米颗粒复合物溶液缓慢滴于400目的铜网上，室温下自然晾干，最后使用透射电子显微镜来观察样品的形态，记录透射电镜图。透射电镜图表明：聚精胺阳离子PSIA或PSI加入到NGF基因分子里，通过静电作用力络合形成复合物，呈现出类球形的纳米颗粒，其形态规则、均匀，显而易见的是NGF基因分子被包裹于聚合物里面，纳米颗粒的粒径尺寸在100 - 300 nm。
实施例4  NGF基因-聚阳离子纳米颗粒复合物的粒径分布和zeta电位测试
按照实施例1的纳米颗粒复合物溶液的制备方法来配制不同质量比的纳米颗粒复合物溶液，所需测定的纳米颗粒复合物溶液的PSIA或PSI与NGF基因的质量比依次为5，10，15，20，30，样品量为2 ml。在室温条件下，首先预热粒度分析仪30分钟，再吸取1 ml纳米颗粒溶液加入微量样品池，然后将微量样品池放入粒度分析仪的测试槽中，设置测试温度为25℃，介质为水，粘度为0.890 cP，折射率为1.330。对于纳米颗粒的粒径分布测试，光散射角度为90℃，检测波长为659.0 nm，每个样品测试3次，每次运行时间为2分钟，记录每个样品粒径的平均值及其多分散性。对于纳米颗粒的zeta电位测试，介电常数为78.54，pH值为7.0，Zeta电位分析模型为Smoluchowski方程（极性溶剂：Henrys方程F(ka)近似于1.5），每个样品测试3次，每次自动运行10次，记录每个样品zeta电位的平均值及其迁移率。结果表明：不同质量比的NGF基因-PSIA纳米颗粒和NGF基因-PSI纳米颗粒纳米颗粒的粒径稳定在100-300 nm；纳米颗粒的zeta电位分布在8-25mV。
实施例5  NGF基因-聚阳离子纳米颗粒复合物的细胞转染
选择PC-12神经细胞作为研究PSIA或PSI与NGF基因纳米颗粒复合物细胞转染的受体。按照(5-10)×104个数/ml细胞液的细胞密度转48孔细胞板。对于细胞转染，将PSIA或PSI与NGF基因纳米颗粒复合物加入细胞培养。首先，每孔加入溶液的体积是50 μl，平行3个复孔，每孔加入NGF基因的质量是500 ng，稀释介质是磷酸盐缓冲溶液，所需考察的纳米颗粒复合物溶液的PSIA或PSI与NGF基因的质量比依次为0，10，20，30，40，50。接着，从培养箱中取出48孔细胞板，吸去培养液，每孔用200 μl 磷酸盐缓冲溶液冲洗一次，再吸去磷酸盐缓冲溶液，每孔加入250 μl DMEM高糖培养基（含酚红），随后将一系列不同质量比的纳米颗粒复合物溶液依次加入到细胞板中，置于37 ℃、5%细胞培养箱里培养4小时。然后，从培养箱中取出48孔细胞板，吸去培养液，每孔用200 μl磷酸盐缓冲溶液冲洗一次，再吸去磷酸盐缓冲溶液，每孔加入500 μl含10 %胎牛血清的DMEM高糖培养基（含酚红），最后再置于37 ℃、5 %细胞培养箱里培养。44小时之后，测定细胞转染的效率。同时，采用PC-12 神经细胞增长率法测定细胞的增长率。每个样品平行测试3次，取平均值作图。接着，从培养箱中取出48孔细胞板，吸去培养液，每孔用200 μl磷酸盐缓冲溶液冲洗一次，再吸去磷酸盐缓冲溶液，每孔加入250 μl DMEM高糖培养基（无酚红），随后将一系列不同质量比的纳米颗粒溶液依次加入到细胞板中，置于37 ℃、5 %细胞培养箱里培养4小时。然后，从培养箱中取出48孔细胞板，吸去培养液，每孔用200 μl磷酸盐缓冲溶液冲洗一次，再吸去磷酸盐缓冲溶液，每孔加入500 μl含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基（含酚红），最后再置于37 ℃、5%细胞培养箱里培养。44小时之后，测定细胞转染的效率。每个样品平行测试3次，取平均值作图。统计学分析采用独立样本T检验。NGF基因-PSIA纳米颗粒复合物（PSIA与NGF基因的质量比为40）和NGF基因-PSI纳米颗粒复合物（PSI与NGF基因的质量比为40）的细胞转染结果如表1所示。可得出以下结论：PSIA或PSI具备理想的输送NGF（基因表达）的能力。
表1  NGF基因-PSIA或PSI纳米颗粒复合物的细胞转染结果

注：*，NGF基因-PSIA载体1、NGF基因-PSIA载体2分别与PSIA载体组相比，P<0.05；#，NGF基因-PSI载体1、NGF基因-PSI载体2分别与PSI载体组相比，P<0.05。
实施例6  PSIA或PSI的细胞毒性测试实验
采用噻唑兰法（MTT）定量考察PSIA或PSI对PC-12细胞毒性。首先，按照(5-10)×104个数/ml细胞液的细胞密度转96孔细胞板，置于37 ℃、5 %细胞培养箱里培养过夜。其次，配制一系列不同浓度（50，100，150，200，400，600，800 μg/ml）的PSIA或PSI聚精胺阳离子溶液，每孔加入聚精胺阳离子溶液的体积是100 μl，平行6个复孔，稀释介质是DMEM高糖培养基（无酚红），所需考察PSIA或PSI聚精胺阳离子的浓度依次为50，100，150，200，400，600，800，单位是μg/ml。接着，从培养箱中取出96孔细胞板，吸去培养液，每孔用100 μl磷酸盐缓冲溶液冲洗一次，再吸去磷酸盐缓冲溶液，将上述一系列不同浓度的聚精胺阳离子溶液依次加入到细胞板中，置于37 ℃、5 %细胞培养箱里培养4小时。然后，从培养箱中取出96孔细胞板，吸去培养液，每孔用100 μl磷酸盐缓冲溶液冲洗一次，再吸去磷酸盐缓冲溶液，每孔加入112.5 μl DMEM高糖培养基（无酚红）和12.5 μl MTT溶液（5 mg/ml），继续置于37 ℃、5 %细胞培养箱里培养。6小时之后，从培养箱中取出96孔细胞板，吸去培养液，每孔加入150 μl二甲基亚砜（分子生物级），轻微摇匀，待蓝紫色结晶物甲赞（formazan）完全溶解，最后，使用多功能酶标仪测定样品在570 nm和630 nm处的吸光度值。每个样品平行测试6次，取平均值作图，统计学分析采用独立样本T检验（PEI 25 KDa作为对照组）。细胞存活率（百分比）是以待测样的吸光度值相比正常细胞的吸光度值（即聚合物溶液的浓度为0）来表示。PSIA和PSI的细胞毒性测试结果如表2所示。可得出以下结论：PSIA或PSI在一系列工作浓度范围内对PC-12细胞毒性很低，细胞存活率为87%～99%。
表2  PSIA和PSI的细胞毒性测试结果

实施例7  NGF基因-聚阳离子纳米颗粒复合物治疗帕金森病模型
1. 异动症（levodopa-induced dyskinesia，LID）模型制备
大鼠腹腔注射3％的戊巴比妥麻醉后，严格平颅位固定于大鼠脑立体定向仪上，剪毛后碘伏消毒头部皮肤，沿正中线切开头皮，15%双氧水烧灼骨膜，暴露颅骨缝及前囟，确定前囟坐标，根据包新民等所著《大鼠脑立体定位图谱》，确定右侧前脑内侧束（medial forebrain bundle，MFB）注射位点：①前囟后3.7mm，矢状缝右侧1.7mm，颅骨下8.0mm，门齿线2.4mm；②前囟后4.4mm，矢状缝右侧1.2mm，颅骨下8.0mm，门齿线2.4mm。按上述确定的注射位点钻孔，用10μl规格的微量注射器抽取6-OHDA 6μl（溶于0.2%维生素C生理盐水，浓度4μg/μl），每点注射3μl，注射速度约1μl/min，留针5min后缓慢退针，退4mm再留针5min，直至完全退出，缝合皮肤切口，置笼喂养。3周后，大鼠腹腔注射阿朴吗啡（0.5mg/kg）诱导旋转，平均旋转频率>7次/min为成功PD大鼠模型。利用6-OHDA制备PD模型大鼠后，腹腔注射左旋多巴甲酯/苄丝肼（50 mg/kg左旋多巴甲酯和25 mg/kg苄丝肼溶于含0.2%维生素C的消毒生理盐水中）4周，制备LID大鼠模型。
2. 模型分组和行为学测定
随机将LID大鼠模型分为：（I）NGF基因-PSIA载体组、（II）NGF基因-PSI载体组、（III）PSIA载体组、（IV）PSI载体组、（V）NGF基因组。LID大鼠颅内注射药物，剂量为50mg/kg，I、II、III、IV组使用的药物中PSIA或PSI浓度均为800μg/ml，I、II组中PSIA或PSI与NGF基因的质量比均为40，IV与V组中NGF基因浓度均为20μg/ml。各组大鼠经腹腔注射阿朴吗啡诱导旋转，记录其30分钟内旋转圈数，计算各组大鼠每分钟的平均旋转圈数和前肢碰触桶壁的次数所占的百分数（%）。NGF基因-PSIA纳米颗粒复合物的体内治疗效果如表3和表4所示，NGF基因-PSI纳米颗粒复合物的体内治疗效果如表5和表6所示。结果表明NGF基因-PSIA或PSI聚阳离子纳米颗粒复合物可以显著降低LID大鼠旋转圈数，前肢碰触桶壁增加。
表3  NGF基因-PSIA纳米颗粒复合物对旋转次数的影响

注：*，与注射后相同时间的NGF基因组相比，P<0.05；#，与注射后相同时间的PSIA组相比，P<0.05。
表4  NGF基因-PSIA纳米颗粒复合物对前肢碰触桶壁次数的影响

注：*，与注射后相同时间的NGF基因组相比，P<0.05；#，与注射后相同时间的PSIA组相比，P<0.05。
表5  NGF基因-PSI纳米颗粒复合物对旋转次数的影响

注：*，与注射后相同时间的NGF基因组相比，P<0.05；#，与注射后相同时间的PSI组相比，P<0.05。
表6  NGF基因-PSI纳米颗粒复合物对前肢碰触桶壁次数的影响

注：*，与注射后相同时间的NGF基因组相比，P<0.05；#，与注射后相同时间的PSI组相比，P<0.05。
综上可知，本发明的PSIA或PSI聚精胺阳离子能够凝聚、输送核酸药物，在体内循环过程中，可兼顾到达靶细胞之前的稳定性和进入靶细胞之后的生物响应性，并且，PSIA或PSI聚精胺阳离子自身可在体内完成无毒化的代谢。
实施例8  考察其他类NGF基因-聚阳离子载体纳米颗粒复合物对帕金森病模型大鼠行为学的影响
将LID大鼠模型分为：①本发明组：参照实施例1的方法制备NGF基因-PSIA纳米颗粒复合物，其中PSIA与NGF基因的质量比为40；②对照组一：参照实施例1的方法制备NGF基因-PSIA纳米颗粒复合物，其中PSIA与NGF基因的质量比为40，且PSIA的n为600-800；③对照组二：参照实施例1的方法制备NGF基因-PSIA纳米颗粒复合物，其中PSIA与NGF基因的质量比为35。以上各组LID大鼠颅内注射剂量均为50mg/kg，药物中PSIA浓度均为800μg/ml。各组大鼠经腹腔注射阿朴吗啡诱导旋转，记录其30分钟内旋转圈数，计算各组大鼠每分钟的平均旋转圈数和前肢碰触桶壁的次数所占的百分数（%）。结果如表7和表8所示。
表7  各组纳米颗粒复合物对旋转次数的影响

注：*，与注射后相同时间的对照组一相比，P<0.05；#，与注射后相同时间的对照组二相比，P<0.05。
表8  各组纳米颗粒复合物对前肢碰触桶壁次数的影响

注：*，与注射后相同时间的对照组一相比，P<0.05；#，与注射后相同时间的对照组二相比，P<0.05。
另外，还设置了实验组：④参照实施例1的方法制备NGF基因-PSI纳米颗粒复合物，其中PSI与NGF基因的质量比为40；⑤参照实施例1的方法制备NGF基因-PSI纳米颗粒复合物，其中PSI与NGF基因的质量比为40，且PSIA的n为600-800；⑥参照实施例1的方法制备NGF基因-PSI纳米颗粒复合物，其中PSI与NGF基因的质量比为35。结果显示实验组④在用药4、8、12、16、20天时，相比于实验组⑤和⑥能显著降低大鼠每分钟的平均旋转圈数（P<0.05）和增加前肢碰触桶壁的次数所占的百分数（P<0.05）。以上结果表明PSIA、PSI为NGF基因的良好载体。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110>  上海交通大学医学院附属新华医院
<120>  NGF基因-聚阳离子纳米颗粒复合物及其制备方法和应用
<130>  /
<160>  1    
<170>  PatentIn version 3.3
<210>  1
<211>  726
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  1
atgtccatgt tgttctacac tctgatcaca gcttttctga tcggcataca ggcggaacca     60
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gcctga                                                               726