一种非病毒基因载体的制备方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104263756 A (43)申请公布日 2015.01.07 CN 104263756 A (21)申请号 201410513142.8 (22)申请日 2014.09.29 C12N 15/88(2006.01) C12N 15/10(2006.01) (71)申请人 大连理工大学 地址 124221 辽宁省盘锦市辽东湾新区大工 路 2 号 (72)发明人 马昆 张嘉宁 (74)专利代理机构 大连理工大学专利中心 21200 代理人 梅洪玉 (54) 发明名称 一种非病毒基因载体的制备方法 (57) 摘要 本发明提供一种非病毒基因载体的制备方 法， 该方法是利用。

2、原生细胞模型 protocell 的技 术与方法， 用中性脂质囊泡包裹PCR组分液(pDNA 模板、 聚合酶、 引物、 dNTPs)， 然后进行 PCR 扩增， 得到内部包裹大量DNA片段的protocell液。 本发 明的在脂质囊泡中扩增 DNA 片段， 使载体中包载 的基因拷贝数大大增加， 基因转染效率也显著提 高 ； 制备脂质载体采用中性磷脂， 无正电荷成分， 使其毒性明显降低。 本发明方法设计合理， 制备工 艺简单， 具有广阔的应用前景。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页。

3、 说明书3页 附图5页 (10)申请公布号 CN 104263756 A CN 104263756 A 1/1 页 2 1. 一种非病毒基因载体的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： (1) 用薄膜分散法或逆向蒸发法制备脂质囊泡， 将 PCR 组分液包裹在囊泡内 ； (2) 对脂质囊泡包裹的 DNA 片段进行 PCR 扩增 ： 用 0.02U/L 的 DNase I 消化除去外 水相的 pDNA 模板， 对所得包裹 PCR 组分液的脂质囊泡进行 20 个 PCR 循环， 得到 protocell 模型 ； 在 protocell 液中加入 0.02U/L 的 DNase I 酶， 室温消。

4、化 5 分钟， 去除囊泡未包封 的 DNA 片段。 2. 根据权利要求 1 所述的制备方法， 其特征在于， 所述的薄膜分散法制备脂质囊泡采 用以下步骤实现 ： 将磷脂混合后溶于氯仿， 氮气吹干， 加入PCR组分液， 包括pDNA模板、 聚合 酶、 引物和 dNTPs ； 充分涡旋震荡制备脂质囊泡， 冻融 3 次， 聚碳酸酯膜过滤。 3.根据权利要求1或2所述的制备方法， 其特征在于， 所述的逆向蒸发法制备脂质囊泡 采用以下步骤实现 ： 以含有磷脂的氯仿为油相， PCR 组分液为水相， 按油相与水相的体积比 为 3:1， 将水相加入油相中 ； 充分涡旋震荡成乳状液， 旋转蒸发缓慢除去氯仿， 制备。

5、脂质囊 泡液， 冻融 3 次， 聚碳酸酯膜过滤。 4.根据权利要求1或2所述制备方法制备的非病毒基因载体的应用， 其特征在于， 所述 的载体通过进一步配体修饰， 具有特异靶向性， 进一步提高转染效率。 5. 根据权利要求 3 所述制备方法制备的非病毒基因载体的应用， 其特征在于， 所述的 载体通过进一步配体修饰， 具有特异靶向性， 进一步提高转染效率。 权 利 要 求 书 CN 104263756 A 2 1/3 页 3 一种非病毒基因载体的制备方法 技术领域 0001 本发明属于非病毒基因载体的制备技术领域， 涉及一种以脂质为材料的原生细胞 (protocell)模型作为基因载体的制备方法。。

6、 经配体修饰后， 这种基因载体可用作靶向基因 传递系统。 技术背景 0002 随着分子生物学的发展， 特别是人类基因库的建立和人类疾病相关基因的阐明， 疾病的基因治疗应运而生， 并已发展为当代医学和生物学的一个新的研究领域， 被认为是 治疗遗传性先天疾病、 恶性肿瘤、 传染病等最有希望的治疗方案之一。 0003 转染载体可分为两类 ： 病毒载体与非病毒载体。非病毒基因载体能够克服病毒基 因载体的许多棘手问题， 如无免疫原性、 无遗传毒性、 细胞毒性低、 成本低等等， 是治疗基因 体内给药不可替代的传递系统， 具有重要的临床实用潜力。目前， 非病毒基因载体的研究 主要集中在阳离子聚合物或阳性脂质。

7、体上， 这些正电荷载体能够有效吸附负电性的基因物 质。但是， 正电荷载体进入体内后， 很容易被血液中的吞噬细胞识别、 吸附并迅速清除。同 时， 正电荷会导致血细胞膜去稳定化， 造成严重毒性， 这都限制了非病毒基因载体的发展。 0004 磷脂分子能够在水中自发组装成闭合的圆形囊泡， 双层膜厚度为4-5nm。 磷脂囊泡 已经被广泛用于制备 protocell 模型系统， 其与细胞膜非常相似， 在不同的 pH 值与温度下 都相对稳定， 并且将磷脂制备成细胞大小囊泡的技术很成熟。 0005 Protocell 就是用脂质制备一个闭合囊泡， 在其内部包裹生物反应物质， 在适合的 条件下大量增殖， 得到内。

8、部浓集核酸或蛋白等生物活性物质的 protocell 囊泡。并且原生 细胞模型 (protocell) 使用中性磷脂制备， 其理化性质与细胞接近， 具有良好的生物相容 性， 将其作为纳米工厂， 在内部大量扩增所需的基因物质， 并用于靶向基因传递， 能同时解 决转染效率和毒性问题， 实现非病毒载体的高效基因传递。此外， 如果用配体对 protocell 进行修饰， 使其具有靶向性， 用于基因的靶向传递， 在生物医学中将有更广泛运用。 发明内容 0006 本发明提供了一种非病毒基因载体的制备方法， 具体是指以原生细胞模型 protocell 作为基因载体的制备方法。先用脂质制备囊泡， 将 pDNA。

9、 模板、 聚合酶、 引物、 dNTPs 等 PCR(Polymerase Chain Reaction， 聚合酶链式反应 ) 各组分包裹在囊泡中， 然后 进行 PCR 扩增， 在囊泡内扩增目的 DNA 片段， 使其浓集于脂质囊泡中， 得到原生细胞模型 protocell。 0007 一种以原生细胞模型 protocell 为基因传递载体的制备方法， 通过以下步骤实 现 ： 0008 (1) 用薄膜分散法或逆向蒸发法制备脂质囊泡， 将 PCR 组分液包裹在囊泡内。 0009 (2)对脂质囊泡包裹的DNA片段进行PCR扩增 ： 用0.02U/L的DNase I消化除去 外水相的pDNA模板， 对所。

10、得包裹PCR组分液的脂质囊泡进行20个PCR循环， 得到protocell 说 明 书 CN 104263756 A 3 2/3 页 4 模型 ； 在 protocell 液中加入 0.02U/L 的 DNase I 酶， 室温消化脂质囊泡外的 DNA 片段 5 分钟。 0010 步骤 (1) 中所述的薄膜分散法制备脂质囊泡可以采用以下步骤实现 ： 将磷脂混合 后溶于氯仿， 氮气吹干， 加入 PCR 组分液， 包括 pDNA 模板、 聚合酶、 引物和 dNTPs ； 充分涡旋 震荡制备脂质囊泡， 冻融 3 次， 聚碳酸酯膜过滤。 0011 步骤 (1) 中所述的逆向蒸发法制备脂质囊泡可以采用以。

11、下步骤实现 ： 以含有磷脂 的氯仿为油相， PCR 组分液为水相， 按油相与水相的体积比为 3:1， 将水相加入油相中 ； 充分 涡旋震荡成乳状液， 旋转蒸发缓慢除去氯仿， 制备脂质囊泡液， 冻融 3 次， 聚碳酸酯膜过滤。 0012 上述制备方法制备的非病毒基因载体， 通过进一步配体修饰， 使其具有特异靶向 性， 进一步提高转染效率。 0013 目前的非病毒基因载体多采用阳离子材料， 体内转运效率低， 毒性明显， 而中性电 荷材料包载 DNA 效率低， 不能用于基因传递。本发明借用 protocell 的思路和方法， 在脂质 囊泡中 “生产” DNA 片段， 使载体中包载的基因拷贝数大大增加。

12、， 基因转染效率也显著提高。 所采用的脂质载体为中性磷脂， 无正电荷成分， 体内传递效率高而毒性降低。 本发明的制备 方法设计合理， 制备工艺简单， 具有很好的临床应用前景。 附图说明 0014 图 1 是透射电镜观察 protocell 形态的结果图。 0015 图 2 是在 protocell 中 PCR 扩增 DNA 片段后， DNase 酶消化前、 后的琼脂糖凝胶 电泳对比图。 0016 图3是在中性或阳性protocell中PCR扩增DNA片段后的琼脂糖凝胶电泳对比图。 0017 图 4(A) 为 protocell 载体转染 HEK293 细胞的的荧光蛋白表达效率图。 0018 图。

13、 4(B) 为阳离子 DOTAP 脂质体与质粒结合后转染细胞的荧光蛋白表达效率图。 0019 图 4(C) 为 protocell 中进行 DNA 片段扩增后转染细胞的荧光蛋白表达效率图。 0020 图 5 是 protocell 与阳离子脂质体的细胞毒性对比图。 具体实施方式 0021 实施例 1 ： 0022 图 1 为将 protocell 附着于 TEM 载样铜网上， 经过 2乙酸铀染色 3 分钟后在 TEM 下观察， 结果可见 protecell 为 200nm 左右的类圆形纳米粒。 0023 实施例 2 ： 0024 图 2 中， A 为制备 protocell 后， 进行 PCR。

14、 扩增， 用 TE 饱和酚 ： 氯仿 (1:1) 混合物 抽提、 去除脂质， 水层中的 DNA 产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定， 结果可见， protocell 中的 DNA 条带亮度非常高， 说明 PCR 扩增后， 目标 DNA 片段浓集于其中， 具有较高浓度。图 2 中， B 为 protocell 经 PCR 扩增后， 再加入 0.02U/L 的 DNase 酶， 室温消化 5 分钟， 用 TE 饱和 酚 ： 氯仿 (1:1) 混合物抽提、 去除脂质， 结果可见， 经过酶消化后， protocell 中的 DNA 片段 浓度依然较高， 说明DNase 酶未能消化其中的DNA片段， protoc。

15、ell能够保护内部的基因 物质， 使其免受外界消化酶的影响。 0025 图 3 中， A 为用中性 DOPC 制备的中性 protocell， 进行 PCR 扩增后， 经 TE 饱和酚 ： 说 明 书 CN 104263756 A 4 3/3 页 5 氯仿(1:1)混合物抽提、 去除脂质后， 进行凝胶电泳鉴定表明， 其中的DNA条带浓度较高， 说 明 DOPC 制备的 protocell 能够进行 PCR 扩增， 并用作基因传递载体。图 3 中， B 为 DOTAP 制 备的阳性 protocell， 经 PCR、 提取电泳鉴定表明， 其中没有 DNA 条带， 说明阳性 protocell 中。

16、没有产生 DNA 片段， 不适合用于 PCR 扩增， 不能用作基因载体。 0026 实施例 3 ： protocell 载体的细胞转染效率测定 0027 将 HEK293 细胞 (1105/ 孔 ) 接种于 24 孔培养板， 过夜培养至细胞贴壁， 汇合度 为 60 80。将制备好， 并经 PCR 扩增的 protocell 溶液过滤除菌， 稀释成系列浓度 ( 以 总脂质分别为 10M、 50M、 100M、 150M、 200M、 500M)， 加入细胞中， 再加入含 10 血清的培养基， 使每孔的总体积为500L。 以未包裹的PCR扩增液为阴性对照， 以DOTAP脂 质体为阳性对照。 将DO。

17、TAP脂质体与pEGFP-N1质粒按照不同质量比混合、 孵育30min， 得到 复合物。将配好的复合物加入细胞中， 每孔 DNA 的加入量为 2g。再加入 10血清的培养 基， 使每孔的总体积为 500L。37 CO2培养箱放置 12 小时， 吸去转染液， 每孔加入新鲜配 置的500L含10小牛血清的培养基， 继续培养48h。 吸去培养基， 用4多聚甲醛固定细 胞 20 分钟， 荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。 0028 图 4.A 为对 DNA 片段进行 PCR 扩增后， 直接转染 HEK293 细胞， 结果表明， 其绿色 荧光蛋白 (EGFP) 的表达不明显， 说明 DNA 的 P。

18、CR 扩增液不能直接用于基因传递 ； 图 4.B 为 阳离子 DOTAP 脂质体与质粒结合后转染细胞， 结果显示具有一定的 EGFP 表达 ； 图 4.C 为在 protocell 中进行 DNA 片段扩增后转染细胞， 结果表明 EGFP 表达效率最高， 说明 protocell 能够保护 DNA 片段， 增加 DNA 被细胞的摄取， 提高转基因的表达效率。 0029 实施例 4 ： protocell 与阳离子脂质体的细胞毒性对比图 0030 将 HEK293 细胞 (5103/ 孔 ) 接种于 96 孔培养板， 过夜培养至细胞贴壁， 汇合度 为 60 80。PBS 洗涤后加入不同浓度的 p。

19、rotocell 液， 或阳离子 DOTAP 脂质体， 再加入 无血清培养基至 200L/ 孔， 空白对照组加 200L 无血清培养基。培养箱中培养 12 小时， 然后移去培养基， 加入 180L 无血清培养基和 20L MTT(5mg/mL) 溶液， 继续培养 4h 后， 加入 100L DMSO 每孔， 振摇 10min， 酶标仪上， 于 570nm 测定 A 值。按以下公式计算细胞生 存率。 0031 细胞生存率 ( ) (A样品/A空白)100 0032 图 5 的结果表明随着脂质浓度的增加， protocell 的细胞成活率均高于 DOTAP 脂 质体， 说明 protocell 的。

20、细胞毒性明显小于 DOTAP 脂质体。 0033 上述实施例用来解释说明本发明， 而不是对本发明进行限制， 在本发明的精神和 权利要求的保护范围内， 对本发明做出的任何修改和改变， 都落入本发明的保护范围。 说 明 书 CN 104263756 A 5 1/5 页 6 图 1 说 明 书 附 图 CN 104263756 A 6 2/5 页 7 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 104263756 A 7 3/5 页 8 图 4(A) 说 明 书 附 图 CN 104263756 A 8 4/5 页 9 图 4(B) 说 明 书 附 图 CN 104263756 A 9 5/5 页 10 图 4(C) 图 5 说 明 书 附 图 CN 104263756 A 10 。