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1、(10)申请公布号 CN 104232802 A (43)申请公布日 2014.12.24 CN 104232802 A (21)申请号 201410513791.8 (22)申请日 2014.09.29 C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (71)申请人 四川农业大学 地址 611130 四川省成都市温江区惠民路 211 号 (72)发明人 文心田 曹三杰 黄小波 黄宁 文翼平 伍锐 胡中凯 赵松 尹人杰 邓静 (74)专利代理机构 成都高远知识产权代理事务 所 ( 普通合伙。
2、 ) 51222 代理人 李高峡 张娟 (54) 发明名称 检测鸡传染性喉气管炎病毒、 鸡新城疫病毒 和鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒 (57) 摘要 本发明公开了一种检测鸡传染性喉气管炎病 毒、 鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒的试 剂盒。 本发明检测试剂盒可以准确、 有效的检测鸡 传染性喉气管炎病毒、 鸡新城疫病毒和鸡传染性 支气管炎病毒， 且特异性强、 灵敏度高、 耗时短， 检 测快速， 应用前景良好。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 17 页 序列表 4 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书17页 序列。
3、表4页 附图3页 (10)申请公布号 CN 104232802 A CN 104232802 A 1/1 页 2 1. 一种检测鸡传染性喉气管炎病毒、 鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒的试剂 盒， 其特征在于 ： 它包括鸡传染性喉气管炎病毒、 鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒的 基因扩增试剂以及检测用基因芯片 ； 所述扩增鸡传染性喉气管炎病毒的试剂包括SEQ ID NO ： 78和/或SEQ ID NO ： 9 10所示引物对 ； 扩增鸡新城疫病毒基因的试剂包括SEQ ID NO ： 1112和/或SEQ ID NO ： 13 14 所示引物对 ； 扩增鸡传染性支气管炎病毒基因的试剂包括 。
4、SEQ ID NO ： 15 16 和 / 或 SEQ ID NO ： 17 18 所示引物对 ； 引物对中， 上游引物与下游引物的摩尔比是 1:1 ； 所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体上的探针 ； 其中， 探针包括 SEQ ID NO ： 1 或 2 所示任意一个或者两个基因片段， SEQ ID NO ： 3 或 4 所示任意一个或者两个基因 片段以及 SEQ ID NO ： 5 或 6 所示任意一个或者两个基因片段。 2. 根据权利要求 1 所述的试剂盒， 其特征在于 ： 所述扩增试剂还包括荧光染料标记的 dNTP。 3.根据权利要求2所述的试剂盒， 其特征在于 ： 所述荧光染料。
5、为Cy3荧光染料或者Cy5 荧光染料。 4.根据权利要求1所述的试剂盒， 其特征在于 ： 所述试剂盒还包括SEQ ID NO ： 2021 所示引物对 ； 所述基因芯片还包括定位探针， 定位探针是 SEQ ID NO ： 19 所示的基因片段。 5. 根据权利要求 1 所述的试剂盒， 其特征在于 ： 所述固相载体为氨基化基片。 6.SEQ ID NO ： 7 8 和 / 或 SEQ ID NO ： 9 10 所示引物对、 SEQ ID NO ： 11 12 和 / 或 SEQ ID NO ： 13 14 所示引物对与 SEQ ID NO ： 15 16 和 / 或 SEQ ID NO ： 17。
6、 18 所 示引物对在制备同时扩增鸡新城疫病毒、 鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒 的试剂中的用途。 7.SEQ ID NO ： 7 8 和 / 或 SEQ ID NO ： 9 10 所示引物对、 SEQ ID NO ： 11 12 和 / 或 SEQ ID NO ： 13 14 所示引物对、 SEQ ID NO ： 15 16 和 / 或 SEQ ID NO ： 17 18 所示 引物对与 SEQ ID NO ： 1 或 2 所示任意一个或者两个基因片段、 SEQ ID NO ： 3 或 4 所示任意 一个或者两个基因片段、 SEQ ID NO ： 5 或 6 所示任意一个或者两个。
7、基因片段在制备检测鸡 传染性喉气管炎病毒、 鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒中的用途 ； 其中， 所述引物对为扩增试剂， 上游引物与下游引物的摩尔比是1:1 ； SEQ ID NO ： 16 所示基因片段为检测探针。 8. 根据权利要求 7 所述的用途， 其特征在于 ： 所述扩增试剂还包括荧光染料标记的 dNTP。 9. 根据权利要求 7 所述的用途， 其特征在于 ： 所述检测探针固定在氨基化基片上。 10. 根据权利要求 7 所述的用途， 其特征在于 ： 所述试剂盒还包括 SEQ ID NO ： 20 21 所示引物对以及 SEQ ID NO ： 19 所示的定位探针。 权 利 要。
8、 求 书 CN 104232802 A 2 1/17 页 3 检测鸡传染性喉气管炎病毒、 鸡新城疫病毒和鸡传染性支 气管炎病毒的试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及一种检测鸡传染性喉气管炎病毒、 鸡新城疫病毒、 鸡传染性支气管炎 病毒的试剂盒。 背景技术 0002 随着我国养禽业集约化程度的不断提高， 各类疾病的发生也呈逐年上升的趋势。 我国禽病防治的总体水平不高， 禽病的发生和危害仍然十分严重， 据不完全统计， 目前危害 我国养禽业生产的疾病达 80 余种， 其中传染病约占禽病总数的 75， 危害严重。同时禽病 的发生也出现新的特点， 如新的传染病不断出现 ； 新发生禽病的种类增多 ； 传。
9、染病发病的 非典型化和病原出现新的变化 ； 混合感染和复合症使疾病更为复杂等。 0003 鸡新城疫、 鸡传染性支气管炎和鸡传染性喉气管炎这 3 种病在我国和许多国家地 区广泛流行， 受病毒侵袭的鸡群会引起大批死亡， 耐过的生长发育缓慢， 淘汰率增高， 并干 扰其它疫苗的免疫力， 使鸡易继发感染其它疾病， 而造成严重的经济损失。这 3 种病的共同 特征都能引起呼吸道症状， 而且症状十分相似， 在临床诊断中很难准确判断， 也极易与其它 呼吸道病如禽流感、 慢性呼吸道病等相混淆。现有的禽病检测或监测技术均存在不可克服 的局限， 如对疫病的混合感染、 隐性感染及疫苗毒和野毒的区分等， 在检测时均存在一。
10、定的 困难。同时对于多种疫病的混合感染需要同一种方法或不同方法多次进行检测， 因此有必 要加强对动物疫病检测或监测新型技术的研究。 0004 目前， 对这 3 种病的诊断一般采用病原分离鉴定和常规的血清学方法， 但这些方 法存在操作繁杂、 费时费力、 敏感性较差等不足。特别是当鸡群存在鸡新城疫、 鸡传染性支 气管炎和鸡传染性喉气管炎等多种病毒感染时， 难以应用这些传统方法进行快速检测和鉴 别诊断， 在一定程度上影响了对这些疫病的有效防制。最近国内外均建立了 PCR/RT-PCR 检 测方法， 以及多重 PCR 检测方法， 但是还不能满足更加快速、 准确的检测多种病原混合感染 的要求。因此， 有。
11、必要建立 DNA 微阵列检测技术对鸡新城疫、 鸡传染性支气管炎、 鸡传染性 喉气管炎病毒进行鉴别诊断， 建立快速、 准确的早期诊断和检测方法， 以便尽快采取有效的 针对性防治措施， 减少这些疾病对养禽业造成的损失。用 DNA 微阵列检测技术对鸡新城疫、 鸡传染性支气管炎、 鸡传染性喉气管炎病毒进行鉴别诊断的方法是十分必要的， 具有重要 的现实意义。 0005 分子生物学理论和技术的发展， 特别是基因芯片有高通量、 多样性、 微型化和自动 化的特点， 这些特性使它上面的信息能快速准确地被读出， 对样品的量要求很少， 节约试剂 和成本， 处理速度大大加快， 在对各种病原体的检测中， 病原体基因的检。
12、测和分析是最可信 的， 而基因芯片技术能对各种病原体的 RNA 进行定性和定量的分析， 从而帮助临床医生对 感染的种类和感染的程度进行分析。 0006 公开号为 1616679 和 1616678 的专利申请分别公开了检测包括鸡新城疫病毒、 鸡 传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒等 10 种或 9 种病毒的基因芯片， 但是该文 说 明 书 CN 104232802 A 3 2/17 页 4 件中没有芯片的特异性和灵敏度试验， 不能说明其可以特异且灵敏地同时检出鸡新城疫病 毒、 鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒。 发明内容 0007 为了解决上述问题， 本发明提供了一种特异强、 。
13、灵敏度高可同时检测检测鸡传染 性喉气管炎病毒、 鸡新城疫病毒、 鸡传染性支气管炎病毒的新的基因芯片和试剂盒。 0008 本发明检测鸡传染性喉气管炎病毒、 鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒的试 剂盒， 其特征在于 ： 它包括鸡传染性喉气管炎病毒、 鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒 的基因扩增试剂以及检测用基因芯片 ； 0009 所述扩增鸡传染性喉气管炎病毒的试剂包括SEQ ID NO ： 78和/或SEQ ID NO ： 910所示引物对 ； 扩增鸡新城疫病毒基因的试剂包括SEQ ID NO ： 1112和/或SEQ ID NO ： 13 14 所示引物对 ； 扩增鸡传染性支气管炎病毒基因的。
14、试剂包括 SEQ ID NO ： 15 16 和 / 或 SEQ ID NO ： 17 18 所示引物对 ； 所述引物对中， 上游引物与下游引物的摩尔比是 1:1 ； 0010 所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体上的探针 ； 所述探针包括SEQ ID NO ： 1 或 2 所示任意一个或者两个基因片段， SEQ ID NO ： 3 或 4 所示任意一个或者两个基因 片段以及 SEQ ID NO ： 5 或 6 所示任意一个或者两个基因片段。 0011 优选地， 所述扩增试剂还包括荧光染料标记的dNTP。 进一步优选地， 所述荧光染料 为 Cy3 荧光染料或者 Cy5 荧光染料。 001。
15、2 优选地， 所述试剂盒还包括SEQ ID NO ： 2021所示引物对 ； 所述基因芯片还包括 定位探针， 定位探针是 SEQ ID NO ： 19 所示的基因片段。 0013 优选地， 所述固相载体为氨基化基片。 0014 本发明还提供了SEQ ID NO ： 78和/或SEQ ID NO ： 910所示引物对、 SEQ ID NO ： 11 12 和 / 或 SEQ ID NO ： 13 14 所示引物对与 SEQ ID NO ： 15 16 和 / 或 SEQ ID NO ： 17 18 所示引物对在制备同时扩增鸡新城疫病毒、 鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性 喉气管炎病毒的试剂中的用途。
16、。 0015 本发明还提供了SEQ ID NO ： 78和/或SEQ ID NO ： 910所示引物对、 SEQ ID NO ： 11 12 和 / 或 SEQ ID NO ： 13 14 所示引物对、 SEQ ID NO ： 15 16 和 / 或 SEQ ID NO ： 17 18 所示引物对与 SEQ ID NO ： 1 或 2 所示任意一个或者两个基因片段、 SEQ ID NO ： 3或4所示任意一个或者两个基因片段、 SEQ ID NO ： 5或6所示任意一个或者两个基因片段 在制备检测鸡传染性喉气管炎病毒、 鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒中的 用途 ； 0016 其中，。
17、 所述引物对为扩增试剂， 上游引物与下游引物的摩尔比是 1:1 ； SEQ ID NO ： 1 6 所示基因片段为检测探针。 0017 优选地， 所述扩增试剂还包括荧光染料标记的dNTP。 进一步优选地， 所述荧光染料 为 Cy3 荧光染料或者 Cy5 荧光染料。 0018 优选地， 所述检测探针固定在氨基化基片上。 0019 优选地， 所述试剂盒还包括SEQ ID NO ： 2021所示引物对以及SEQ ID NO ： 19所 示的定位探针。 说 明 书 CN 104232802 A 4 3/17 页 5 0020 本发明试剂盒可以有效检测鸡传染性喉气管炎病毒、 鸡新城疫病毒和鸡传染性支 气。
18、管炎病毒， 特异性强、 敏感性高、 耗时短， 检测快速， 具有良好的应用前景。 0021 以下通过实施例形式的具体实施方式， 对本发明的上述内容作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明权利要 求书记载的内容所实现的技术均属于本发明的范围。 附图说明 0022 图 1DNA 微阵列的矩阵排列情况 ； 0023 图2多重PCR体系1电泳情况。 M ： 100bp Ladder DNA Maeker ； 1 ： NDV-F ； 2 ： IBV-N ； 3 ： ILTV-gB ； 4 ： 多重 PCR ； 0024 图3多重PCR体系2电泳情况。 M 。
19、： 100bp Ladder DNA Maeker ； 1 ： NDV-HN ； 2 ： IBV-M ； 3 ： ILTV-TK ； 4 ： 多重 PCR ； 0025 图 4 特异性实验结果 ； 0026 图 5 灵敏度实验结果 ； 0027 图 6 灵敏度实验结果 ； 0028 图 7 基因芯片重复检测结果。 具体实施方式 0029 一、 实验材料和仪器 0030 材料准备 0031 ILTV 标准株、 NDV LaSota 株、 IBV H120 株均购自中国兽药监察所， 由本实验室保 存。 0032 试剂 0033 氨基基片 ：氨基载玻片， 购自上海百傲生物工程有限公司 ； 醛基基片 。
20、： 醛基载玻片， 购自上海百傲生物工程有限公司 ； 点样缓冲液 1 ：点样缓冲液， 购自上海百傲生物工程有限公司 ； 点样缓冲液 2 ： 晶芯基因芯片点样液， 购自北京博奥生物 公司 ； Cy3-dCTP ： Lot300989， 美国 Amersham 公司 ； 杂交缓冲液 ：杂交缓冲液， 购自上 海百傲生物工程有限公司 ； 洗液 1 ： 1SSC/0.1 SDS ； 洗液 2 ： 0.2SSC/0.1 SDS ； 洗液 3 ： 0.2SSC ； 洗液 4 ： 灭菌超纯水。 0034 仪器 0035 超净工作台， SW-CJ-2FD， 苏州安泰空气技术有限公司 ； 超纯水仪， Milli Q。
21、plus， 法 国产 ； 梯度 PCR 仪， P2， Thermo hybaid， 美国产 ； 高速冷冻离心机 3K18 型， Sigma， 德国产 ； 电泳仪， POWER Pac300， Bio-RAD， 意大利产 ； 分子杂交仪， Thermo hybaid， 美国产 ； 核酸蛋 白检测仪， SmartSpaee TM3010， Bio-RAD， 意大利产 ； 基因芯片杂交盒， 北京博奥生物公司 ； SmartArrayer 48 基因芯片点样仪， Capitalbio Corporation， 北京博奥生物公司 ； LuxScan 10K 基因芯片扫描仪， Capitalbio Cor。
22、poration， 北京博奥生物公司 ； 真空 抽干机， SinBo， 香港产 ； 恒温摇床， Thermo Forma， 美国产。 0036 实施例 1 本发明试剂盒的制备 说 明 书 CN 104232802 A 5 4/17 页 6 0037 1、 材料和仪器 0038 同前述实验材料和仪器。 0039 2、 实验方法 0040 2.1PCR 引物、 检测探针的制备 0041 (1) 设计病原特异性探针 ： 通过对 GenBnak 中收录的鸡新城疫病毒、 鸡传染性支气 管炎病毒、 鸡传染性喉气管炎病毒的核酸序列的比对分析， 选定保守区域序列 ： NDV-F/HN、 IBV-IBM/IBN。
23、、 ILTV-TK/gB。针对保守序列设计检测多对探针， 从中挑选出特异性强的探针 序列。 0042 (2) 设计探针序列的特异性引物 ： 针对上述保守探针序列， 利用生物信息学软件 DNAman、 Primer5.0 等设计特异性引物。特异性引物由上海生物工程公司合成。 0043 (3) 探针制备 ： 用小量病毒 / 液体样品 DNA/RNA 抽提试剂盒提取鸡新城疫病毒、 鸡 传染性支气管炎病毒、 鸡传染性喉气管炎病毒， 利用上述特异性引物对三种病原核酸进行 PCR 扩增， 纯化浓度测定。 0044 反转录体系及条件 ( 参照 PrimeScript RT reagent Kit 的方法 )。
24、 0045 0046 0047 PCR 扩增体系及条件 ： 0048 0049 反应条件如下 ： 0050 说 明 书 CN 104232802 A 6 5/17 页 7 0051 4、 探针的筛选 : 将合成好的探针溶解并适量稀释后用基因芯片点样仪点在氨基 化玻璃基片上制成 DNA 微阵列， 通过杂交试验进行探针筛选， 最终得到用于制备本发明检 测 DNA 微阵列所需的特异性探针 ： NDV-F/HN、 IBV-IBM/IBN、 ILTV-TK/gB。 0052 5、 探针基因库的建立 ： 将胶回收纯化的 NDV-F/HN、 IBV-IBM/IBN、 ILTV-TK/gB 用 pMD19-T。
25、 Simple Vector 进行连接， 连接体系如下 0053 0054 连接反应在16下进行16h ； 将10.0L探针连接产物加入的200L感受态细胞 DH5( 氯化钙法制备 ) 中， 轻轻混匀后冰浴 30min， 42热休克 90s 后立即放入冰浴中冷却 5min， 加入 800L LB 液体培养基， 37轻微振荡培养 3h。取 200L 培养物涂布于含氨苄 的 LB 琼脂平板培养基， 37培养过夜， 挑选阳性克隆进行增菌培养。进行质粒 PCR 鉴定， 并 送上海杰李生物公司测序。 0055 6、 探针基因库的保存 ： 将测序正确的质粒进行扩增培养， 并用 20脱脂牛奶作为 保护剂进行。
26、冻干， 置于 -80保存。 0056 引物和探针的序列如下 ： 0057 SEQ ID NO ： 1(NDV-F) 0058 源基因来源 ： NDV LaSota 株 0059 基因大小及序列 ： 440bp 0060 CAAGAAC CCAGCACCTA TGATGCTGAC TATCCGGGTTGCGCTGGTAC 0061 TGAGTTGCATCTGTCCGGCAAACTCCATTGATGGCAGGCCTCTTGCAGC 0062 TGCAGGAATTGTGGTTACAGGAGACAAAGCCGTCAACATATACACCTCA 0063 TCCCAGACAGGATCAATCATAGTT。
27、AAGCTCCTCCCGAATCTGCCCAAGG 0064 ATAAGGAGGCATGTGCGAAAGCCCCCTTGGATGCATACAACAGGACAT 0065 TGACCACTTTGCTCACCCCCCTTGGTGACTCTATCCGTAGGATACAAGA 0066 GTCTGTGACTACATCTGGAGGGGGGAGACAGGGGCGCCTTATAGGCGC 0067 CATTATTGGCGGTGTGGCTCTTGGGGTTGCAACTGCCGCACAAATAACA 0068 GCGGCCGCAGCTCTGATACAAGCCAAACAAAATGCTGCCAACATCCTC 说 。
28、明 书 CN 104232802 A 7 6/17 页 8 0069 CGAC 0070 SEQ ID NO ： 2(NDV-HN) 0071 源基因来源 ： NDV LaSota 株 0072 基因大小及序列 ： 465bp 0073 CTGGACGGTTTGGTGGGAAACGCATACAGCAGGCTATCTTATCTATCAAGGTGTCAACATCCTTAGGCG AAGACCCGGTACTGACTGTCCGCCCAAC 0074 ACAGTCACACTCATGGGGGCCGAAGGCAGAATTCTCACAGTAGGGACA 0075 TCTCATTTCTTGTATCAACGAGG。
29、GTCATCATACTTCTCTCCCGCGTTATTA 0076 TATCCTATGACAGTCAGCAACAAAACAGCCACTCTTCATAGTCCTTATAC 0077 ATTCAATGCCTTCACTCGGCCAGGTAGTATCCCTTGCCAGGCTTCAGCA 0078 AGATGCCCCAACTCGTGTGTTACTGGAGTCTATACAGATCCATATCCCCT 0079 AATCTTCTATAGAAACCACACCTTGCGAGGGGTATTCGGGACAATGCTT 0080 GATGGTGTACAAGCAAGACTTAACCCTGCGTCTGCAGTATTCGA。
30、TAGCA 0081 CATC CCGCAGTCGC ATTACTC 0082 SEQ ID NO ： 3(IBV-M) 0083 源基因来源 ： IBV H120 株 0084 基因大小及序列 ： 368bp 0085 ACACAGGAGGTCTTGTCGCAGCGATAATACTTACTGTGTTTGCGTGTCTTTCTTTTGTAGGTTATTGGA TCCAGAGTATTAGACTCTTTAAGCGGTGTAGATCTTGGTGGTCATTTAACCCAGAATCTAACGCCGTAGGTTCAATA CTCCTAACTAATGGTCAACAATGTAATTTTGCTATAGAGAG。
31、TGTGCCGATG 0086 GTGCTTTCTCCTATTATAAAGAATGGTGTTCTTTATTGTGAGGGTCAGTG 0087 GCTTGCTAAATGTGAACCAGACCACTTGCCTAAAGACATATTTGTATGC 0088 ACACCAGATAGACGTAATATCTATCGTATGGTGCAGAAATACATTGGTGA 0089 CCAAAGCGGAA ATAAGAAAAGG 0090 SEQ ID NO ： 4(IBV-N) 0091 源基因来源 ： IBV H120 株 0092 基因大小及序列 ： 292bp 0093 CAATACCCGCTACGATT。
32、CTCAGATGGAGGACCTGATGGTAATTTCCGTTGGGACTTCATTCCAATAAAT CGTGGTAGGAGTGGAAGATCAACAGCGGCTTCATCAGCAGCATCTAGTAGAGCACCGTCGCGTGATGGCTCGCGTGG ACGTAGAAGCGGAGCTGAAGATGATCTTATAGCTCGTGCAGCAAAGATCATTCAGGATCAGCAGAAGAAGGGTTCTC GCATTACTAAAGCTAAGGCCGATGAAATGGCTCATCGCCGGTATTGTAAGCGTACTATCCCACCTGGTT 0094 SEQ ID NO ： 5(IL。
33、TV-TK) 0095 克隆基因的源基因来源 ： ILTK 标准株 0096 基因大小及序列 ： 279bp 0097 TCCTCGTAGATAGGCACCCACTCGCGGCATGTTTGTGTTTCCCTGTTGCACAATATCTAAGCGGAGCGC TCGAATTTGGAGATTTAATAACTTTATTGTCAGGAATTCCTGACATTCCAACACACTCCAACATTGTTTTAATGGAT TTGGATATTTGCGAACAGGCACGGCGTATAATACAAAGGGGGCGCCCAGGGGAAACGGTCGACTGGACGTATTTGTG TGCATTACGTAACT。
34、CGTACATCTGCCTCATGAATACTACCACCTACCTCCAACGTA 0098 SEQ ID NO ： 6(ILTV-gB) 说 明 书 CN 104232802 A 8 7/17 页 9 0099 源基因来源 ： ILTV 标准株 0100 基因大小及序列 ： 189bp 0101 TGCTGGAATAATAGACCCTCGTGATACAGCCAGCATGGATGTTGGAAAAATCTCTTTCTCCGAAGCCAT TGGGTCGGGGGCACCGAAAGAACCCCAGATTAGAAACAGAATTTTTGCGTGCTCATCTCCAACTGGCGCCAGTGTTG C。
35、GAGGCTTGCCCAGCCACGACATTGTCACCGACATGCCGATTC 0102 SEQ ID NO ： 7 8(F-primer) 0103 F 5-CAAGAACCCAGCACCTATGATG-3 0104 R 5-GTCGGAGGATGTTGGCAGC-3 0105 SEQ ID NO ： 9 10(HN-primer) 0106 F 5-CTGGACGGTTTGGTGGGAA-3 0107 R 5-GAGTAATGCGACTGCGGGATG-3 0108 SEQ ID NO ： 11 12(IM-primer) 0109 F 5-ACACAGGAGGTCTTGTCGCAG。
36、-3 0110 R 5CCTTTTCTTATTTCCGCTTTGG-3 0111 SEQ ID NO ： 13 14(IN-primer) 0112 F 5-CAATACCCGCTACGATTCTCAG-3 0113 R 5-AACCAGGTGGGATAGTACGCTTA-3 0114 SEQ ID NO ： 15 16(TK-primer) 0115 F 5-TCCTCGTAGATAGGCACCCACTC-3 0116 R 5-TACGTTGGAGGTAGGTGGTAGTATTCA-3 0117 SEQ ID NO ： 17 18(gB-primer) 0118 F 5-TGCTGGAATA。
37、ATAGACCCTCGT-3 0119 R 5-GAATCGGCATGTCGGTGA-3 0120 SEQ ID NO ： 19( 定位基因 ) 0121 aaagcgaggc tttttggcct ctgtcgtttc ctttctctgt ttttgtccgt ggaatgaaca atggaagtca 0122 acaaaaagca gctggctgac attttcggtg cgagtatccg taccattcag aactggcagg aacagggaat 0123 gcccgttctg cgaggcggtg gcaagggtaa tgaggtgctt tatgactctg ccg。
38、ccgtcat aaaatggtat 0124 gccgaaaggg atgctgaaat tgagaacgaa aagctgcgcc gggaggttga agaactgcgg caggccagcg 0125 aggcagatct ccagccagga actattgagt acgaacgcca tcgacttacg cgtgcgcagg ccgacgcaca 0126 ggaactgaag aatgccagag actccgctga agtggtggaa accgcattct gtactttcgt gctgtcgcgg 0127 atcgcaggtg aaattgccag tattctcg。
39、ac gggctccccc tgtcggtgca gcggcgtttt ccggaactgg 0128 aaaaccgaca 说 明 书 CN 104232802 A 9 8/17 页 10 0129 SEQ ID NO ： 20 21( 定位基因互补序列的扩增引物 ) 0130 F ： AAAGCGACGCAATGAGGCACT 0131 R ： GTTCCACGACCGCAACTGC 0132 2.2 标准质粒的构建 0133 2.2.1NDV 和 IBV 基因组的抽提 0134 NDV 和 IBV 的总 RNA 抽提采用天根的总 RNA 提取试剂盒， 参照说明， 具体操作方法 如下 ： 。
40、0135 1)直接取200L病毒尿囊液于1.5mL离心管中， 加入600L裂解液， 充分振荡混 匀 ； 0136 2) 将匀浆样品在 15-30放置 5min ； 0137 3)4， 12000r/min 离心 5min， 把上清液吸到新离心管中 ； 0138 4) 加 200L 氯仿， 剧烈上下振荡 15sec， 室温静置 3min ； 0139 5)4， 12000r/min 离心 10min， 样品会产生分层， 轻轻地将最上层无色的水相转 到新管中 ； 0140 6) 加 0.5 倍体积无水乙醇， 混匀， 转移到吸附柱内， 4， 12000r/min 离心 30sec ； 0141 7)。
41、 加 500L 去蛋白液， 4， 12000r/min 离心 30sec ； 0142 8) 加 600L 漂洗液， 静置 2min， 4， 12000r/min 离心 30sec ； 重复一次 0143 9)4， 12000r/min 离心 2min， 弃掉残余液体 ； 0144 10) 将吸附柱转到 RNase-Free 离心管中， 加 50L RNase-Free 超纯水， 室温静置 2min， 4， 12000r/min 离心 2min。离心液即得到的病毒 RNA， 于 -20下保存备用或直接进 行反转录。 0145 2.2.2ILTV 基因组的抽提 0146 ILTV的DNA抽提采用。
42、天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒， 参照说明， 具 体操作方法如下 ： 0147 1) 取 -20保存的尿囊膜 10mg， 研磨处理为细胞悬液， 然后 12000r/min 离心 1min， 倒尽上清， 加 200L 缓冲液 GA， 振荡至彻底悬浮 ； 0148 2) 加 20L Proteinase K 溶液， 混匀后放置于 56至尿囊膜溶解， 。 0149 3) 加 200L 缓冲液 GB， 充分颠倒混匀， 70放置 10min。 0150 4) 加 200L 无水乙醇， 充分振荡混匀 15sec。 0151 5) 将混合物都加吸附柱中， 12000r/min 离心 30sec。。
43、 0152 6) 向吸附柱中加入 500L 缓冲液 GD， 12000r/min 离心 30sec。 0153 7) 向吸附柱中加入 600L 漂洗液 PW， 12000r/min 离心 30sec， 重复一次。 0154 8)12000r/min 空离 2min， 室温下放置 5 分钟晾干。 0155 9) 将柱子放到干净的离心管上， 加 50L 洗脱液 TE， 放置 2min， 12000r/min 离心 2min。收集的离心液即病毒 DNA， 或直接 PCR 扩增或于 -20下保存备用。 0156 2.2.3 探针基因的 RT-PCR 及 PCR 扩增 0157 以抽提的NDV和IBV的。
44、RNA为模板， 以Random 6primers为引物合成cDNA， 反应体 系如下 ： 0158 说 明 书 CN 104232802 A 10 9/17 页 11 RT Enzyme Mix0.5L Random 6primers0.5L 5PrimeScript RT Buffer2.0L RNA2.0L RNase-Free 超纯水5.0L Total10.0L 0159 将上述体系混匀后按下面程序进行 cDNA 合成 ： 反应程序为 37， 15min ； 85， 5sec ； 4， 保存。 0160 以反转录合成的 NDV、 IBV 的 cDNA 和 ILTV 的 DNA 为模板，。
45、 进行 PCR 反应， 反应体系 如下 ： 0161 2Taq PCR MasterMix12.5L cDNA/DNA2.0L 上游特异性引物 (25.0mol/L)0.5L 下游特异性引物 (25.0mol/L)0.5L 超纯水9.5L Total25.0L 0162 反应条件如下 ： 0163 0164 PCR 完毕后， 分别取 7L 扩增产物用琼脂糖凝胶进行电泳分析。 0165 2.2.4 探针基因的胶回收 0166 探针基因的胶回收， 采用 OMEGA 小量胶回收试剂盒， 参照说明进行回收操作， 步骤 如下 ： 0167 1) 取 20LPCR 产物进行电泳， 6V/cm， 25min。
46、， 紫外灯下切胶， 称重。按照试剂盒说 明进行胶回收 ； 说 明 书 CN 104232802 A 11 10/17 页 12 0168 2) 按 1:1 的比例加入 Binding Buffer(XP2)， 55 -60水浴直到胶全部融化， 期 间每隔 2-3min 上下颠倒离心管 ； 0169 3) 将液体加入吸附柱中， 室温 12000r/min 离心 1min， 倒掉滤液 ； 0170 4) 加入 300Binding Buffer(XP2)， 室温 12000r/min 离心 1min， 倒掉滤液 ； 0171 5) 加入 700mL 漂洗液 SPW， 室温 12000r/min 离。
47、心 1min， 倒掉滤液 ； 0172 6) 室温 12000r/min 空离 2min， 倒掉滤液 ； 0173 7) 将吸附柱放于新离心管中， 加入 30mL 洗脱缓冲液， 室温静置 1min ； 0174 8) 室温 12000r/min 离心 2min， 取 7L 回收产物进行电泳， 验证回收效果， 其余回 收产物于 -20保存备用。 0175 2.2.5 探针基因的连接重组 0176 采用pMD19-T Simple Vector克隆试剂盒， 进行探针基因的连接重组， 具体步骤按 说明进行。连接体系如下 ： 0177 pMD19-T Simple 载体0.5L 胶回收 PCR 产物5。
48、.0L Solution I4.5L Total10.0L 0178 4连接过夜， 连接产物用于转化 DH5 感受态细胞。 0179 2.2.6 感受态细胞的制备及保存 0180 参考 分子克隆实验指南 氯化钙法 56 制备 DH5 感受态细胞， 制备好的感受态 细胞分装为 100L/ 管， 直接用于转化或于 -70保存。 0181 2.2.7 连接产物的转化 0182 将 100L 感受细胞放在冰上， 向其中加 10L 连接产物， 冰浴 30min ； 42水浴热 休克 90s， 快速冰浴冷却 5min ； 立即加入 600L 37预热的 LB 液体培养基 ( 无需冰上操 作 )， 37， 150r/min 振荡培养 1h， 使受体菌恢复正常生长状态 ； 取 150。