《重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法及其应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法及其应用.pdf（22页完整版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 104232710 A (43)申请公布日 2014.12.24 CN 104232710 A (21)申请号 201310253850.8 (22)申请日 2013.06.24 C12P 21/02(2006.01) C07K 1/22(2006.01) C07K 1/14(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (71)申请人 深圳市兰科植物保护研究中心 地址 518000 广东省深圳市罗湖区望桐路 889 号深圳市兰科植物保护研究中心 (72)发明人 刘仲健 李利强 肖新菊 张丽君 罗焕亮 梁楠楠 (74)专利代理机构 深圳中一专利商标事务所 4。
2、4237 代理人 张全文 (54) 发明名称 重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法及其 应用 (57) 摘要 本发明提供了一种重组植原体免疫主导膜蛋 白的纯化方法及其应用。上述重组植原体免疫主 导膜蛋白的纯化方法， 通过使用亲和层析法将重 组菌表达的可溶性植原体免疫主导膜蛋白进行提 纯， 尤其是将包涵体裂解， 结合利用透析法和亲和 层析法对包涵体中的不溶性植原体免疫主导膜蛋 白进行提纯， 并通过对提纯的条件和工艺参数进 行优化， 从而大大提高重组植原体免疫主导膜蛋 白的纯化效果， 提纯度可达 95%， 而传统方法的提 纯度为 60%。该方法工艺简单、 易于操作， 并且产 出量高、 降低了生产成本。
3、。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 14 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书14页 附图5页 (10)申请公布号 CN 104232710 A CN 104232710 A 1/2 页 2 1. 一种重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法， 包括如下步骤 ： 获得表达植原体免疫主导膜蛋白的重组菌， 诱导表达 ； 破碎经诱导表达后的重组菌， 分离得到上清液一和沉淀物一 ； 将所述上清液一加入至树脂悬液与结合缓冲液混合液中， 所述树脂悬液与所述结合缓 冲液的体积比为 1 4 ： 1 5， 在 4 8的温度下振荡 1 。
4、2 小时后静置沉降， 然后依次 经漂洗、 洗脱处理， 得到可溶性重组植原体免疫主导膜蛋白溶液 ； 将所述沉淀物一悬重洗涤后并经孵育处理， 得到所述沉淀物一的溶解液 ； 将所述沉淀 物一的溶解液加入至所述树脂悬液与所述结合缓冲液混合液中， 所述树脂悬液与所述结合 缓冲液的体积比为 1 4 ： 1 5， 在 4 8的温度下振荡 1 2 小时后静置沉降， 然后依 次经漂洗、 洗脱处理， 得到包涵体重组植原体免疫主导膜蛋白的溶液 ； 将所述可溶性重组植原体免疫主导膜蛋白溶液与所述包涵体中重组植原体免疫主导 膜蛋白的溶液进行透析浓缩， 得到所述重组植原体免疫主导膜蛋白。 2. 根据权利要求 1 所述的重。
5、组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法， 其特征在于， 所述 树脂悬液为 50% 的 Ni-NTA-His Bind 树脂悬液 ； 所述结合缓冲液为 Ni-NTA 结合缓冲液， 所 述 Ni-NTA 结合缓冲液中的咪唑浓度为 0 10mM/L， PH 值为 7 8。 3. 根据权利要求 1 所述的重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法， 其特征在于， 所述 漂洗步骤使用 Ni-NTA 漂洗缓冲液， 所述 Ni-NTA 漂洗缓冲液中的咪唑浓度为 20 60mM/L， PH 值为 7 8 ； 所述洗脱步骤使用 Ni-NTA 洗脱缓冲液， 所述 Ni-NTA 洗脱缓冲液中的咪唑浓 度为 200 300mM/L。
6、， PH 值为 7 8。 4. 根据权利要求 1 所述的重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法， 其特征在于， 所述沉淀物一洗涤步骤使用包涵体洗涤缓冲液， 所述洗涤缓冲液包含 50 60mmol/L Tris-HCl， 90 100mmol/L NaCl， 0.5 1mmol/L 乙二胺四乙酸， 7 8mmol/L 聚乙二醇辛 基苯基醚， pH8.0 8.2。 5. 根据权利要求 1 所述的重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法， 其特征在于， 所述 淀物一经洗涤后用包涵体溶解缓冲液重悬， 所述包涵体溶解缓冲液包含 500 600mmol/L 的 3-( 环己胺 )-1- 丙磺酸盐、 10 15mmo。
7、l/L 的 N- 十二烷基肌氨酸钠和 0.8 1mmol/L 的 二硫苏糖醇， PH 值为 10 11。 6. 根据权利要求 1 所述的重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法， 其特征在于， 所述 透析步骤为将所述可溶性重组植原体免疫主导膜蛋白溶液和包涵体中重组植原体免疫主 导膜蛋白的溶液加入至透析液中， 在 4 8的温度下透析 3 4 小时 ； 所述透析缓冲液包 含 0.01 0.02mol/L 的 Tris-HCl、 0.05 0.1mmol/L 的二硫苏糖醇， PH 值为 8.2 8.5。 7. 根据权利要求 1 所述的重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法， 其特征在于， 所述 破碎经诱导表达。
8、后的重组菌的方法为直接破碎或复合破碎 ； 其中， 所述复合破碎的方法为 ： 将所述经诱导表达后的重组菌在-4-20的温度下冻融24次， 加入抽提试剂， 在20 25的温度下重悬， 振荡孵育3060分钟 ； 其中所述抽提试剂体积与所述经诱导表达后的 重组菌的质量比为 5 10ml/g。 8. 根据权利要求 1 所述的重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法， 其特征在于， 所述 获得表达植原体免疫主导膜蛋白的重组菌的方法如下 ： 合成含有 6His Tag 序列的植原体免疫主导膜蛋白基因， 设计引物对， 扩增所述植原 权 利 要 求 书 CN 104232710 A 2 2/2 页 3 体免疫主导膜蛋。
9、白基因 ； 将所述植原体免疫主导膜蛋白基因克隆至表达质粒上， 得到重组质粒 ； 用所述重组质粒转化感受态大肠杆菌， 得到表达植原体免疫主导膜蛋白的重组菌。 9. 根据权利要求 8 所述的重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法， 其特征在 于， 所述引物对为引物对一、 引物对二、 引物对三中的任一种 ； 其中， 所述引物对一包 含 上 游 引 物 F5-ACCATATGGAAGGTAAGCAGCAAATAACGA-3 和 下 游 引 物 R5-CGCTCGA GCTCCATCACCAGTGCGGTCTCAATC-3， 所述引物对二包含上游引物 F5-CGCCATATGGAAGGTA AGCAGCAA。
10、ATAACGA-3 和下游引物 R5-CCCCTCGA GCTCCATCACCAGTGCGGTCTCAATC-3， 所 述引物对三包含上游引物 F5-GGGTTTCATATGGAAGGTAAGCAGCAAATAACGA-3 和下游引物 R5-CCCTCGA GCTCCATCACCAGTGCGGTCTCAATC-3。 10. 如权利要求 1 9 所述的重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法所获得的重组植 原体免疫主导膜蛋白在医学免疫、 克隆抗体、 致病机理研究领域中的应用。 权 利 要 求 书 CN 104232710 A 3 1/14 页 4 重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法及其应用 技术领域 。
11、0001 本发明属于生物技术领域， 具体涉及一种重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法 及其应用。 背景技术 0002 植原体 (phytoplasma) 是一类 GC 含量比较低， 无细胞壁， 仅有 3 层单位膜包被的 原核微生物， 专性寄生于植物和昆虫。 植物染病主要症状包括丛枝、 黄化、 花变叶、 花器退化 等， 由于植原体侵染性强， 危害寄主广泛， 曾造成许多经济作物、 林木的大量死亡， 带来严重 的经济损失。由于植原体为无细胞壁原核微生物 , 尚不能在人工培养基上离体培养 , 给分 类鉴定、 传播机制、 致病机制的研究带来许多困难。 因为蛋白质是最终遗传信息功能的实施 者， 而且植原体缺。
12、乏细胞壁， 其膜蛋白可以直接与植物的细胞质或介体昆虫的细胞接触， 在 寄主和病原的相互作用中起着重要作用。 因此研究植原体膜蛋白对于建立植原体血清学检 测方法， 揭示植原体的进化、 致病性及其与寄主的相互作用具有重要意义。 0003 而免疫主导膜蛋白 （immunodominant membrane proteins， IDPs） 是大多数植原体 总细胞膜蛋白的主要部分。将各组植原体的免疫膜蛋白 IDPs 分成三种类型 ：（1） 免疫主导 膜蛋白 （immunodominant membrane protein， Imp） ， 代表性植原体有 SPWB、 AP、 ESFY、 PD 和 PYLR。
13、 ；（2） 免疫主导膜蛋白 A（immunodominant membrane protein A， IdpA） ， 代表性植原 体是 WX ；（3） 免疫抗原膜蛋白 （antigenic membrane protein， Amp） ， 代表性植原体是 AY 和 CP。 1999年Michael Berg等从苹果丛枝植原体中分离出免疫主导膜蛋白 （immunodominant membrane protein， Imp） ， 并外源表达基因不同片段产物。研究中 Berg 等人分别在长春花 和烟草染病植株中检测到了分子量大约为 19KDa 大小相似的蛋白， 序列分析表明该类蛋白 具有整合膜蛋白。
14、的特征， 其 N 端暴露在细胞质一侧， 一个疏水跨膜片段形成 螺旋锚定在 膜中， 亲水的 C 端暴露在细胞外。2004 年， Kakizawa 等人克隆了植原体 Sec（细胞分泌） 系 统蛋白 A、 E、 Y， 且研究发现 SecA 有较强的免疫原性， 其抗血清能检测多种植原体。但是由 于不同植原体膜蛋白特异性的差异， 有些膜蛋白能够在大肠杆菌体系内完整表达， 有些则 表达困难， 且易形成包涵体， 另一方面即使膜蛋白在大肠杆菌系统进行了表达， 但由于膜蛋 白的疏水性、 溶解度等性质为后续下游分离纯化膜蛋白造成了困难。 发明内容 0004 本发明的目的在于克服现有技术的上述不足， 提供一种有效提。
15、高重组植原体免疫 主导膜蛋白纯化度的方法。 0005 本发明的另一目的在于提供一种重组植原体免疫主导膜蛋白的应用。 0006 为了实现上述发明目的， 本发明实施例的技术方案如下 ： 0007 获得表达植原体免疫主导膜蛋白的重组菌， 诱导表达 ； 0008 破碎经诱导表达后的重组菌， 分离得到上清液一和沉淀物一 ； 0009 将上述上清液一加入至树脂悬液与结合缓冲液混合液中， 所述树脂悬液与所述结 说 明 书 CN 104232710 A 4 2/14 页 5 合缓冲液的体积比为 1 4 ： 1 5， 在 4 8的温度下振荡 1 2 小时后静置沉降， 然后 依次经漂洗、 洗脱处理， 得到可溶性重。
16、组植原体免疫主导膜蛋白溶液 ； 0010 将上述沉淀物一悬重洗涤后并经孵育处理， 得到所述沉淀物一的溶解液 ； 将所述 沉淀物一的溶解液加入至所述树脂悬液与所述结合缓冲液混合液中， 该树脂悬液与结合缓 冲液的体积比为 1 4 ： 1 5， 在 4 8的温度下振荡 1 2 小时后静置沉降， 然后依次 经漂洗、 洗脱处理， 得到包涵体重组植原体免疫主导膜蛋白的溶液 ； 0011 将所述可溶性重组植原体免疫主导膜蛋白溶液与所述包涵体中重组植原体免疫 主导膜蛋白的溶液进行透析浓缩， 得到所述重组植原体免疫主导膜蛋白。 0012 以及， 一种上述重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法所获得的重组植原体免疫 。
17、主导膜蛋白在医学免疫、 克隆抗体、 致病机理研究领域中的应用。 0013 上述重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法， 通过使用亲和层析法将表达植原体 免疫主导膜蛋白的重组菌表达的可溶性蛋白进行提纯， 尤其是将包涵体裂解， 结合利用透 析法和亲和层析法对包涵体中的不溶性蛋白进行提纯， 并通过对提纯的条件和工艺参数进 行优化， 从而大大提高重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化效果， 提纯度可达 95%， 而传统方 法的提纯度为 60%。该方法工艺简单、 易于操作， 并且产出量高、 降低了生产成本。 0014 正是由于上述重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法所获得的重组植原体免疫 主导膜蛋白具有很高的纯度， 。
18、可广泛应用于医学免疫、 克隆抗体、 分类鉴定、 生理生化及其 致病机理的研究等领域。 附图说明 0015 图 1 是本发明实施例重组植原体免疫主导膜蛋白纯化的方法工艺流程示意图 ； 0016 图 2 是本发明实施例中构建重组质粒 pET-28a（+） -lmp 的示意图 ； 0017 图 3 是本发明实施例分别将引物对一、 引物对二、 引物对三进行 PCR 扩增， 将得到 的重组植原体免疫主导膜蛋白 （lmp） 基因后进行琼脂糖凝胶电泳检测， 得到三种引物对扩 增的检测结果， 其中 M 列为 Marker， 即分子量标准， 1 列为引物对一的检测结果， 2 列为引物 对二的检测结果， 3 列为。
19、引物对三的检测结果 ； 0018 图 4 是本发明实施例将诱导表达后的重组菌和含空质粒的大肠杆菌得到的可溶 性蛋白和包涵体进行SDS-PAGE凝胶电泳得到的检测结果， 其中M列为标准蛋白 （marker） 的 分子量， 1 列为包涵体的检测结果， 2 列为可溶性蛋白的检测结果， BSA 列为参照的蛋白分子 量 ； 0019 图 5 是将本发明实施例 1 9 中不同咪唑浓度条件下纯化得到的可溶性重组植 原体免疫主导膜蛋白溶液进行 SDS-PAGE 凝胶电泳得到的检测结果， 其中 M 列为标准蛋白 （marker） 的分子量， 1 9 列分别对应实施例 1 9 的检测结果 ； 0020 图 6 为。
20、本发明实施例获得的不同量的可溶性重组植原体免疫主导膜蛋白与 1ml50%Ni-NTA-His Bind 树脂结合后再进行 SDS-PAGE 凝胶电泳得到的检测结果， 其中 M 列 为标准蛋白 （marker） 的分子量， 1 列为 10mg 的可溶性重组植原体免疫主导膜蛋白的结合检 测结果， 2 列为 8mg 的可溶性重组植原体免疫主导膜蛋白的结合检测结果 ,3 列为 5mg 的可 溶性重组植原体免疫主导膜蛋白的结合检测结果 ； 0021 图 7 为本发明实施例纯化得到的包涵体重组植原体免疫主导膜蛋白溶液进行 说 明 书 CN 104232710 A 5 3/14 页 6 SDS-PAGE 凝。
21、胶电泳得到的检测结果， 其中 M 列为标准蛋白 （marker） 的分子量， 1 列为第一 次洗脱的检测结果、 2 列为第二次洗脱的检测结果、 3 列为第三次洗脱的检测结果、 4 列为第 四次洗脱的检测结果 ； 可见， 随着洗脱次数的增加， 洗脱得到蛋白的浓度越来越少， 但纯度 会增加。 0022 图 8 为本发明实施例获得的包涵体重组植原体免疫主导膜蛋白溶液浓缩后进行 SDS-PAGE 凝胶电泳得到的检测结果， 其中 M 列为标准蛋白 （marker） 的分子量， 1 列为包涵 体重组植原体免疫主导膜蛋白的分子量 ； 0023 图 9 为本发明实施例纯化后获得的重组植原体免疫主导膜蛋白进行 。
22、Western Blotting 检测的结果， 其中 M 列为标准蛋白 （marker） 的分子量， 1 列为重组植原体免疫主 导膜蛋白的检测结果、 2 列为空白对照的检测结果 ； 可见 1 列中所出现的条带为重组植原体 免疫主导膜蛋白 ； 0024 图 10 为将发明实施例获得的重组植原体免疫主导膜蛋白用于制备免疫抗体， 并 用间接 ELISA 法测定的效价图。 具体实施方式 0025 为了使本发明的目的、 技术方案及优点更加清楚明白， 以下结合附图及实施例， 对 本发明作进一步详细说明。 应当理解， 此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明， 并不 用于限定本发明。 0026 本发明实施例。
23、提供了一种有效提高重组植原体免疫主导膜蛋白纯化度的方法。 该 重组植原体免疫主导膜蛋白纯化方法的工艺流程如图 1 所示， 包括如下步骤 ： 0027 S01， 获得表达植原体免疫主导膜蛋白的重组菌， 诱导表达 ； 0028 S02， 破碎步骤 S01 中经诱导表达后的重组菌， 分离得到上清液一和沉淀物一 ； 0029 S03， 将步骤 S02 中得到的上清液一加入至树脂悬液与结合缓冲液混合液中， 所述 树脂悬液与所述结合缓冲液的体积比为 1 4 ： 1 5， 在 4 8的温度下振荡 1 2 小时 后静置沉降， 然后依次经漂洗、 洗脱处理， 得到可溶性重组植原体免疫主导膜蛋白溶液 ； 0030 。
24、S04， 将所述沉淀物一洗涤， 用溶解缓冲液悬重洗涤后的沉淀物一并经孵育处理， 得到所述沉淀物一的溶解液 ； 将所述沉淀物一的溶解液加入至树脂悬液与结合缓冲液混合 液中， 所述树脂悬液与所述结合缓冲液的体积比为 1 4 ： 1 5， 在 4 8的温度下振荡 1 2 小时后静置沉降， 然后依次经漂洗、 洗脱处理， 得到包涵体重组植原体免疫主导膜蛋 白的溶液 ； 0031 S05， 将所述可溶性重组植原体免疫主导膜蛋白溶液与所述包涵体中重组植原体 免疫主导膜蛋白的溶液进行透析浓缩， 得到所述重组植原体免疫主导膜蛋白。 0032 具体地， 上述步骤 S01 中， 获得表达植原体免疫主导膜蛋白重组菌的。
25、方法优选为 ： 0033 (1) 扩增基因片段 ： 首先， 选取植原体免疫主导膜蛋白 （lmp） 的基因， 该基因的 DNA 序列在 Gene bank 已有公布， 其中 AP 株基因序列登录号为 AJ011678 ； 为后续利用 His 标签 亲和层析法来纯化植原体免疫主导膜蛋白， 因此合成含有6His Tag序列的植原体免疫主 导膜蛋白基因， 该优选的 6His Tag 可以位于植原体免疫主导膜蛋白基因的 C 端或 N 端， 其对 NTA 琼脂糖中的镍离子有较强的亲和吸附作用， 可以使被标签的植原体免疫主导膜蛋 白基因在亲和层析的过程中更容易纯化。接着， 根据上述含有 6His Tag 序。
26、列的植原体免 说 明 书 CN 104232710 A 6 4/14 页 7 疫主导膜蛋白基因设计引物对， 利用常规的 PCR 反应进行目的基因扩增。 0034 进一步地， 上述引物对为引物对一、 引物对二、 引物对三中的任一种 ； 其中， 上 述 引 物 对 一 包 含 上 游 引 物 （F1） F5-ACCATATGGAAGGTAAGCAGCAAATAACGA-3 和 下 游 引 物 （R1） R5-CGCTCGA GCTCCATCACCAGTGCGGTCTCAATC-3 ； 上 述 引 物 对 二 包 含 上 游 引 物 （F1） F5-CGCCATATGGAAGGTAAGCAGCAAA。
27、TAACGA-3 和 下 游 引 物 （R1） R5-CCCCTCGA GCTCCATCACCAGTGCGGTCTCAATC-3 ； 上述引物对三包含上游引物 （F1） F5-GGGTTTCATATGGAAGGTAAGCAGCAAATAACGA-3 和下游引物 （R1） R5-CCCTCGA GCTCCATCACCAGTGCGGTCTCAATC-3。如图 2 所示， 上述上游引物 （F1） 引入的酶切位点为 Nde I, 下游引物 （R1） 引入的酶切位点为 Xho I。 0035 更进一步地， 取上述 PCR 反应的体系为 50ul， 其中包含 2ul 的 lmp 基因 DNA 模板、 1u。
28、l 的上游引物 （F1） 、 1ul 的下游引物 （R1） 、 25ul 的 DNA 聚合酶 （优选型号为 Prime MIX） ， 21ul 的重蒸水 （ddH20） 。该 PCR 反应扩增的条件为 ： 在 95下预变性 5min， 在 94下变性 2min， 在 50 60下退火 1min， 在 72下延伸 2min， 共 30 个循环， 然后在 72下延伸 10min， 接着在 4下保温。 0036 将上述三种引物对置于上述 PCR 反应体系中进行扩增， 将得到的重组植原体免疫 主导膜蛋白 （lmp） 基因进行琼脂糖凝胶电泳检测， 得到三种引物对扩增的检测结果， 结果请 参见图 3， 其。
29、中 M 列为 marker， 即 DNA 分子量标准， 1 列为引物对一的检测结果， 2 列为引物 对二的检测结果， 3列为引物对三的检测结果。 通过对比可知引物对一在上述PCR反应体系 下的扩增效果最好， 在该扩增反应中， 退火温度优选为 50。 0037 (2) 构建重组质粒 ： 选用质粒 pET-28a（+） 作为转化的载体， 先用上述内切酶 Nde I 和 Xho I 同时酶切上述扩增好的重组植原体免疫主导膜蛋白 （lmp） 基因， 并用同样的内切 酶 Nde I 和 Xho I 同时酶切上述质粒 pET-28a （+） ， 再用连接酶将同样双酶切过的 lmp 基因 片段和质粒 pET。
30、-32a（+） 进行连接， 连接酶优选为 T7 连接酶， 从而获得重组质粒 pET-28a （+） -lmp， 该重组质粒如图 2 所示。 0038 （3） 构建重组大肠杆菌 ： 将上述重组质粒 pET-28a（+） -lmp 转化入感受态大肠杆 菌， 该感受态大肠杆菌为 BL21(DE3)、 DH5、 JM109 中的任一种， 优选为 BL21(DE3)， 得到表 达重组植原体免疫主导膜蛋白 （lmp） 的重组菌 BL21(DE3)/pET-28a（+） -lmp。 0039 进一步地， 该步骤 S01 中， 在诱导表达之前， 还可以包含筛选阳性植原体免疫主导 膜蛋白 （lmp） 重组菌的步。
31、骤 ： 将上述重组大肠杆菌 BL21(DE3)/pET-28a（+） -lmp 接种在氨 苄青霉素 （AMP） LB 培养基上， 由于质粒 pET-28a（+） 与氨苄青霉素存在细菌抗性， 经筛选获 得阳性菌落。 0040 再进一步地， 该步骤 S01 中， 诱导上述重组菌 BL21(DE3)/pET-28a（+） -lmp 表达 的方法为 ： 先将上述重组菌 BL21(DE3)/pET-28a（+） -lmp 接入 10ml 的 LB 液体培养基中过 夜培养， 其中， 该LB液体培养基中包含浓度为40ug/ml的硫酸卡那霉素 （Kana） ， 培养的温度 为 35 37， 优选为 37， 搅。
32、拌的转速为 200 250rpm， 优选为 200rpm ； 然后按 1% 的接种 量转接至 50ml 的 LB 培养基中继续培养 2 3 小时 ； 培养至 OD600 为 0.5 0.8 时， 优选 OD600为0.6， 再加入诱导剂IPTC诱导植原体免疫主导膜蛋白 （lmp） 重组菌表达蛋白质至浓 度为 0.4mmol/L 0.6mmol/L， 接着在温度为 35 37下培养 4 6 小时， 优选为在 37 下培养 6 小时。 说 明 书 CN 104232710 A 7 5/14 页 8 0041 取含空质粒的大肠杆菌 BL21(DE3)/pET-28a（+） 作为空白对照组， 用上述重。
33、组菌 BL21(DE3)/pET-28a（+） -lmp 的诱导表达方法进行诱导表达。分别取 1ml 的上 lmp 重组 菌菌液和空白对照组菌液， 先离心收集菌体， 用 PBS 缓冲液重悬， 再用抽提试剂溶解菌体得 到上清液和沉淀物， 其中抽提试剂优选为默克公司生产的Bugbuster Master Mix， 500ml规 格， 货号为 70548-4， 该上清液为可溶性蛋白， 该沉淀物为包涵体。将该上清液和包涵体悬 液进行 SDS-PAGE 凝胶电泳检测扫描， 对目的蛋白 lmp 进行可溶性分析。分析结果如图 4， 结果显示构建于 pET-28a(+) 原核表达载体中的植原体免疫主导膜蛋白 。
34、（Imp） 基因， 在宿主 菌 BL21(DE3) 中经诱导表达后， 目的蛋白 lmp 主要以包涵体形式存在。经凝胶扫描后， 以已 知蛋白分子量的 BSA 为参照， 通过 Gene Tools 半定量分析， 得知包涵体的含量占总蛋白的 70% 以上。 0042 具体地， 上述步骤 S02 中， 由于大部分的目的蛋白以包涵体的形式存在于重组菌 中， 因此需要将步骤 S01 中经诱导表达后的重组菌破碎。破碎重组菌的方法包含直接破碎 法或复合破碎法， 优选复合破碎法。其中， 上述直接破碎法为采用裂解液破碎重组菌， 裂解 液优选为默克公司生产的 Bugbuster Master Mix （500ml 。
35、规格， 货号为 70548-4） ， 此法使重 组菌的细胞粘度增大， 并且镜检细胞的破碎率只有80%。 上述复合破碎法为冻融和裂解液裂 解相结合的方法， 裂解液优选为默克公司生产的 Bugbuster Master Mix （500ml 规格， 货号 为 70548-4） ： 先将步骤 S01 中经诱导表达后的重组菌液体离心分离成上清液和沉淀物， 将 沉淀物在 -40 -20的温度下冻融 2 4 次后， 优选为在 -20下冻融 2 次， 加入裂解液， 该裂解液优选为默克公司生产的 Bugbuster Master Mix （500ml 规格， 货号为 70548-4） ； 再 在室温下重悬， 。
36、在 20 25下振荡孵育 30 60 分钟， 优选为在 25下将重悬的细胞液振 荡孵育30分钟， 使重组菌充分裂解 ； 其中， 上述抽提试剂与上述沉淀物的体积质量比为5 10ml/g， 优选为 5ml/g。上述复合破碎法使重组菌的细胞粘度降低， 并且镜检细胞的破碎率 为 100%。 0043 该步骤 S02 中， 将裂解后得到的混合物在 4的温度下， 以 12000rpm 的转速离心 20 分钟， 分离得到上清液一和沉淀物一。 0044 具体地， 上述步骤 S03 中， 采用亲和层析法提纯上清液一中的可溶性重组植原体 免疫主导膜蛋白 （lmp） ， 提纯的方法优选为 ： 首先， 将树脂悬液与结。
37、合缓冲液轻柔吹打混 匀， 待树脂自然地沉降后获得混合液， 所述树脂悬液与所述结合缓冲液的体积比为 1 4 ： 1 5, 优选为 1:4 ； 进一步地， 该树脂悬液优选为 50% 的 Ni-NTA His Bind 树脂悬液， 该结 合缓冲液优选为 1Ni-NTA 结合漂洗缓冲液， 该混合液为将上述 50% 的 Ni-NTA HisBind 树脂悬液加入 1Ni-NTA 结合漂洗缓冲液中 ； 更进一步地， 上述 50% 的 Ni-NTA HisBind 树脂悬液的用量可根据重组植原体免疫主导膜蛋白 （lmp） 的表达量或者待纯化样品的量而 定， 通常 1ml 的 50% 的 Ni-NTA His。
38、 Bind 树脂可结合 5 10mg 的 6His Tag 的 lmp 蛋白， 优选为 1ml 的 50% 的 Ni-NTA HisBind 树脂结合 5mg 的 6His Tag 的 lmp 蛋白。取 1ml 的 50% 的 Ni-NTA His Bind 树脂， 分别加入 5mg、 8mg、 10mg 的 6His Tag 的重组 lmp， 吸附 后收集流出液， 分别进行 SDS-PAGE 凝胶电泳检测， 结果如图 6 所示， 可见当重组 lmp 质量大 于 5mg 时， 流出液中有未被吸附的重组 lmp， 因此最好选择重组 lmp 的量为 5mg/ml。 0045 进一步地， 上述步骤 。
39、S03 中， 上述 1Ni-NTA 结合漂洗缓冲液中含有浓度为 0 10mM/L 的咪唑， PH 值为 7 8。接着， 用枪吸取步骤 S02 中得到的上清液一使加入至上述 说 明 书 CN 104232710 A 8 6/14 页 9 混合液中， 使之与平衡好的 Ni-NTA His Bind 树脂混匀， 在 4 8的温度下振荡 1 2 小 时， 优选为 4下振荡 1 小时。此时上清液中的重组 lmp 已经较好地与 Ni-NTA HisBind 树脂结合， 将该结合好的Ni-NTA His Bind树脂加入层析住中， 静置等待树脂自然沉降。 由 于上述重组菌 BL21(DE3)/pET-28a。
40、（+） -lmp 表达的 Imp 由于带有 6 个 His-Tag（组蛋白标 签） ， 与 Ni-NTA His Bind 树脂中的过渡金属离子 Ni2+有较强的亲和吸附作用， 当上清液一 中的可溶性重组 lmp 蛋白与 Ni-NTA His Bind 树脂混合时， 带有组氨酸标签的重组 lmp 特 异性结合到 Ni-NTA HisBind 树脂里， 使其他的杂蛋白游离。此外， 咪唑也可以与 Ni-NTA HisBind 树脂中的 Ni2+竞争性结合， 当 1Ni-NTA 结合缓冲液含有低浓度咪唑时， 除了帮 助重组植原体免疫主导膜蛋白更好地与树脂结合， 还有助于洗涤掺杂到树脂里的杂蛋白 ； 。
41、而 PH 值为 7 8 的 Ni-NTA 结合缓冲液可以避开等电点， 防止蛋白质沉淀， 尤其在 PH 值为 7.0 时可有效提高纯化的重组植原体免疫主导膜蛋白量。 0046 再进一步地， 该步骤 S03 中， 漂洗步骤使用 Ni-NTA 漂洗缓冲液， 优选为 1Ni-NTA 漂洗缓冲液， 其中 Ni-NTA 漂洗缓冲液中的咪唑浓度为 20 60mM/L， PH 值为 7 8 ； 洗脱步 骤使用 Ni-NTA 洗脱缓冲液， 优选为 1Ni-NTA 洗脱缓冲液， Ni-NTA 洗脱缓冲液中的咪唑浓 度为 200 300mM/L， PH 值为 7 8。如上所述， 咪唑也可以与 Ni-NTA HisB。
42、ind 树脂中 的 Ni2+竞争性结合， 当缓冲液中含有低浓度的咪唑时， 可以洗涤掺杂到树脂里的杂蛋白 ； 当 缓冲液中含有高浓度的咪唑时， 可以将结合到树脂中的重组植原体免疫主导膜蛋白洗脱出 来 ； 而 PH 值为 7 8 的缓冲液可以避开等电点， 防止蛋白质沉淀， 尤其在 PH 值为 7.0 时可 有效提高纯化的重组植原体免疫主导膜蛋白量。因此， 上述上清液一与 Ni-NTA HisBind 树脂混匀、 静置沉降后， 用上述Ni-NTA漂洗缓冲液漂洗两次、 再用Ni-NTA洗脱缓冲液洗脱， 得到纯化的可溶性所述重组植原体免疫主导膜蛋白 （lmp） 。具体 1Ni-NTA 结合缓冲液、 Ni。
43、-NTA 漂洗缓冲液以及 Ni-NTA 洗脱缓冲液中咪唑的浓度优化过程见后续具体实施案例， 优化结果见图 5， 其中 M 列为标准蛋白 （marker） 的分子量， 1 9 列分别对应实施例 1 9 的检测结果。上述得到的可溶性重组植原体免疫主导膜蛋白 （lmp） ， 在 4 8的温度下 , 用不含 DTT 的透析缓冲液透析 3 4 小时， 替换缓冲液并继续透析 2 3 次， 脱去高浓度咪 唑。优选为在 4下透析 4 小时后， 更换透析缓冲液继续透析 2 次， 每次 4 小时， 得到可溶 性 IMP 蛋白溶液 ； 其中上述透析缓冲液包含 0.01 0.02mol/L 的 Tris-HCl， P。
44、H 值为 8.2 8.5。 ， 优选为包含 0.02mol/L 的 Tris-HCl， PH 值为 8.5。 0047 具体地， 上述步骤 S04 中， 首先， 将步骤 S02 得到的沉淀物一进行进行溶解 ： 将沉 淀物一重悬洗涤两次， 洗涤步骤使用洗涤液， 该洗涤剂优选为包涵体洗涤液， 该洗涤液与 沉淀物一的体积质量比为 15 20ml/g。优选地， 上述包涵体洗涤液包含 50 60mmol/L Tris-HCl， 90 100mmol/L NaCl， 0.5 1mmol/L 乙二胺四乙酸， 7 8mmol/L 聚乙二醇辛 基苯基醚， pH8.0 8.2， 优选为包含 50mmol/L 的 。
45、Tris-HCl、 100mmol/L 的 NaCl、 1mmol/L 的 乙二胺四乙酸 （EDTA） 、 0.5% 的聚乙二醇辛基苯基醚， PH 值为 8.0。 0048 接着， 将洗涤后的沉淀物一用溶解缓冲液悬重并经孵育处理， 得到所述沉淀物一 的溶解液。 进一步地， 在用溶解缓冲液悬重的步骤之前还包含离心分离的步骤 ： 将洗涤后的 沉淀物一在 4下以转速为 12000rpm 离心处理 20 分钟， 收集沉淀物， 该沉淀物主要为沉淀 物一中的包涵体。 再进一步地， 上述溶解缓冲液优选为包涵体溶解缓冲液， 该包涵体溶解缓 冲液包含 500 600mmol/L 的 3-( 环己胺 )-1- 丙。
46、磺酸盐 （CAPS） 、 10 15mmol/L 的 N- 十二 说 明 书 CN 104232710 A 9 7/14 页 10 烷基肌氨酸钠和 0.8 1.0mmol/L 的二硫苏糖醇， PH 值为 10 11， 再优选为包含 500mM 的 CAPS、 0.3% 的 N- 十二烷基肌氨酸钠和 1mM 的二硫苏糖醇， PH 值为 11.0 ； 其中， 上述包涵体 溶解缓冲液与沉淀物的体积质量比为 50 100ml/g， 并且发明人通过大量的研究发现， 当 沉淀物的量大于 0.01g 时， 包涵体难以全部溶解， 会有沉淀残留， 因此包涵体溶解缓冲液与 沉淀物的体积质量比优选为 100ml/g。
47、， 可以彻底溶解该包涵体。再进一步地， 上述孵育处理 优选为在室温下孵育 15 分钟。 0049 进一步地， 该步骤 S04 中， 将得到的沉淀物一的溶解液加入至所述树脂悬液与所 述结合缓冲液混合液之前还包含还包含离心分离的步骤 ： 将上述沉淀物一的溶解液在 4 下以转速为 12000rpm 离心处理 20 分钟， 得到上清液， 该上清液主要包含包涵体中的重组 lmp。 0050 进一步地， 该步骤 S04 中， 采用亲和层析法提纯沉淀物一的溶解液中的包涵体重 组植原体免疫主导膜蛋白 （lmp） ： 将上述沉淀物一的溶解液与上述50%的Ni-NTA His Bind 树脂混匀， 在 4下振荡结。
48、合 1 小时， 此时沉淀物一溶解液的重组 lmp 蛋白已经较好地与树 脂结合， 将该结合好的树脂加入层析住中， 静置等待树脂自然沉降， 用上述 1Ni-NTA 漂洗 缓冲液漂洗两次、 用上述 1Ni-NTA 洗脱缓冲液洗脱， 得到蛋白溶液 ； 用上述包涵体溶解缓 冲液稀释该蛋白溶液一， 该包涵体溶解缓冲液稀释与蛋白溶液一的体积比为 50:1， 在 4 8的温度下,透析34小时， 替换缓冲液并继续透析23次， 用不含DTT的透析缓冲液 继续透析23次， 每次透析34h， 重新折叠变性蛋白， 脱咪唑。 优选为在4下透析4小 时后， 更换透析缓冲液继续透析 3 次， 每次 4 小时， 用不含 DTT 的透析缓冲液继续透析 3 次， 每次透析 4h， 得到蛋白溶液二。其中上述透析缓冲液包含 0.01 0.02mol/L 的 Tris-HCl、 0.050.1mmol/L的二硫苏糖醇， PH值为8.28.5。 ， 优选为包含0.02mol/L的Tris-HCl、 0.1mM 的二硫苏糖醇， PH 值为 8.5。如果透析后样品中有可见的不溶物， 在 4的温度下 12000rpm（请核。