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1、(10)申请公布号 CN 104152467 A (43)申请公布日 2014.11.19 CN 104152467 A (21)申请号 201410352085.X (22)申请日 2014.07.23 C12N 15/31(2006.01) C07K 14/315(2006.01) C12N 15/66(2006.01) A61K 38/16(2006.01) A61P 31/04(2006.01) (71)申请人 大连医科大学 地址 116044 辽宁省大连市旅顺口区旅顺南 路西段九号 (72)发明人 罗红 殷素岚 邹琴 孙文平 杨光 谢兴凤 周杰 吕明睿 刘科芳 (74)专利代理机构 。
2、大连非凡专利事务所 21220 代理人 闪红霞 (54) 发明名称 肺炎链球菌自溶素小片断基因表达蛋白、 制 备方法及用途 (57) 摘要 本发明公开一种肺炎链球菌自溶素小片断基 因表达蛋白、 制备方法及用途， 小片断基因表达蛋 白如 SEQIDNO ： 5 所示的氨基酸序列 ； 制备方法按 如下步骤进行 ： 提取肺炎链球菌 （ATCC49619） 基 因组 DNA ； 以所得到的 DNA 为模板， 以具有BamHI 和HindIII 两个酶切位点的 PCR 反应引物进行 PCR反应 ； 将切胶回收的PCR反应产物与克隆载体 相接， 构建克隆质粒 ； 分别用BamHI 和HindIII 双 酶。
3、切所构建的克隆质粒， 切胶回收 500bp 小片段， 用连接酶与表达载体连接， 再转化到感受态细胞， 挑取单个克隆培养后， 构建重组表达质粒并进行 IPTG 诱导表达及回收纯化蛋白， 其用途是在制备 抗菌药物中的应用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 3 页 附图 7 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 序列表3页 附图7页 (10)申请公布号 CN 104152467 A CN 104152467 A 1/1 页 2 1.一种肺炎链球菌自溶素小片断基因表达蛋白， 其特征在于如SEQ ID NO ： 5。
4、 所示的氨 基酸序列。 2. 一种如权利要求 1 所述肺炎链球菌自溶素小片断基因表达蛋白的制备方法， 其特征 在于按如下步骤进行 ： a. 提取肺炎链球菌 （ATCC49619） 基因组 DNA ； b. 以所得到的 DNA 为模板， 以具有BamHI 和HindIII 两个酶切位点的 PCR 反应引物进 行 PCR 反应 ； 所述 PCR 反应引物序列如下 ： 上游引物BamHI ： 5-GGGGGATCCATGGAAATTAATGTGAGT-3 下游引物HindIII ： 5-GGGAAGCTTTTTTACTGTAATCAAGCCATC-3， c. 将切胶回收的 PCR 反应产物与克隆载体。
5、相接， 构建克隆质粒 ； d. 分别用BamHI 和HindIII 双酶切所构建的克隆质粒， 切胶回收 500bp 小片段， 用连 接酶与表达载体连接， 再转化到感受态细胞， 挑取单个克隆培养后， 构建重组表达质粒 ； e. 将所构建的重组表达质粒转化到感受态细胞， 提取阳性克隆并将所得阳性克隆进 行 IPTG 诱导表达 ； f. 4离心收集经 IPTG 诱导表达的菌体， 加入裂解液超声破碎， 4离心收集上清， 用 透析袋等电点洗脱法回收纯化蛋白。 3. 一种如权利要求 1 所述肺炎链球菌自溶素小片断基因表达蛋白的用途， 其特征在于 在制备抗菌药物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 1041。
6、52467 A 2 1/4 页 3 肺炎链球菌自溶素小片断基因表达蛋白、 制备方法及用途 技术领域 0001 本发明涉及一种肺炎链球菌自溶素小片断基因表达蛋白、 制备方法及用途， 尤 其是一种制备简单、 成本低、 副作用小的肺炎链球菌 ATCC49619 株自溶素 （N- 乙酰胞壁 酰 -L- 丙氨酸酰胺酶， LytA） 小片段基因的原核表达蛋白、 制备方法及在制备抗菌药物中的 应用。 背景技术 0002 肺炎链球菌自溶素 （N- 乙酰胞壁酰 -L- 丙氨酸酰胺酶， LytA） 是肺炎链球菌细胞壁 降解酶之一， 全段蛋白约为 56 kD。目前， LytA 全蛋白主要应用于肺炎链球菌的疫苗靶点以。
7、 及血清学诊断的抗原， 而要获得 LytA 全蛋白， 通常需要经过如下两个步骤 ： 首先通过原核 表达、 镍柱纯化的方式得到具有组氨酸接头并结合有硫氧还原蛋白的融合蛋白 ； 然后再切 除硫氧还原蛋白及组氨酸接头。制备 LytA 全蛋白不仅操作复杂、 成本高， 而且 LytA 全蛋白 中只有部分功能团发挥作用， 其余部分有可能引起机体的副反应或者增加空间位阻。 发明内容 0003 本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题， 提供一种制备简单、 成本低、 副作用小的肺炎链球菌 ATCC49619 株自溶素 （N- 乙酰胞壁酰 -L- 丙氨酸酰胺酶， LytA） 小片 段基因的原核表达蛋白、 制。
8、备方法及在制备抗菌药物中的应用。 0004 本发明的技术解决方案是 ： 一种肺炎链球菌自溶素小片断基因表达蛋白， 其特征 在于如 SEQ ID NO ： 5 所示的氨基酸序列。 0005 一种上述肺炎链球菌自溶素小片断基因表达蛋白的制备方法， 其特征在于按如下 步骤进行 ： a. 提取肺炎链球菌 （ATCC49619） 基因组 DNA ； b. 以得到的 DNA 为模板， 以具有BamHI 和HindIII 两个酶切位点的 PCR 反应引物进行 PCR 反应 ； 所述 PCR 反应引物序列如下 ： 上游引物BamHI ： 5-GGGGGATCCATGGAAATTAATGTGAGT-3 下游引物。
9、HindIII ： 5-GGGAAGCTTTTTTACTGTAATCAAGCCATC-3， c. 将切胶回收的 PCR 反应产物与克隆载体相接， 构建克隆质粒 ； d. 分别用BamHI 和HindIII 双酶切所构建的克隆质粒， 切胶回收 500bp 小片段， 用连 接酶与表达载体连接， 再转化到感受态细胞， 挑取单个克隆培养后， 构建重组表达质粒 ； e. 将所构建的重组表达质粒转化到感受态细胞， 提取阳性克隆并将所得阳性克隆进 行 IPTG 诱导表达 ； f. 4离心收集经 IPTG 诱导表达的菌体， 加入裂解液超声破碎， 4离心收集上清， 用 透析袋等电点洗脱法回收纯化蛋白。 说 明 。
10、书 CN 104152467 A 3 2/4 页 4 0006 一种上述肺炎链球菌自溶素小片断基因表达蛋白的用途， 其特征在于在制备抗菌 药物中的应用 GeneBank 中没有公布肺炎链球菌菌株 （ATCC49619）自溶素序列， 相比于目前基因 库中公布的其他肺炎链球菌菌株序列， 肺炎链球菌菌株 （ATCC49619） 自溶素序列中新出 现个BamHI 的酶切位点。本发明以 GenBank 中肺炎链球菌 M66 菌株自溶素基因全序列 （FN549899.1） 设计上下游引物， 以肺炎链球菌菌株 （ATCC49619） DNA 为模板进行 PCR 反应， 扩增自溶素序列， 以 PCR 反应产物。
11、构建的克隆载体用常规的两种酶BamHI 和HindIII 双酶 切后， 目的基因出现两个小片度， 以其中的约500bp小片段构建重组表达载体， 经IPTG诱导 后， 采用等电点洗脱法可直接获取了一个新的小片段基因蛋白。PAGE 电泳显示该小片段基 因蛋白分子量约为 20 kD， 结合序列测定及质谱测定结果， 证明该小片段基因蛋白不含有现 有全蛋白表达所带的硫氧还原蛋白， 只需等电点洗脱纯化， 无需进一步切除硫氧还原蛋白 及组氨酸接头， 操作简单、 成本低。如以合成多肽的方式来获得这段蛋白， 则因小片段多肽 氨基酸数量少， 合成费用 （合成多肽是以氨基酸数量计费） 也远低于全片段蛋白。实验表明 。
12、本发明的小片断基因蛋白对肺炎链球菌株发挥了溶菌效应， 可与全蛋白具有相同的抑菌效 果， 避免功能团其余部分有可能引起机体的副反应或者增加空间位阻。 附图说明 0007 图 1 是本发明实施例 PCR 反应产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定图。 0008 图 2、 图 3 是本发明实施例重组克隆质粒 PGM-T/lytA测序结果图。 0009 图 4 是本发明实施例重组克隆质粒 PGM-T/lytA双酶切后经 1% 琼脂糖凝胶电泳鉴 定图。 0010 图 5 是本发明实施例重组表达质粒 pET-32a（+） / lytA 双酶切后经 1% 琼脂糖 凝胶电泳鉴定图。 0011 图 6 本发明实施例重。
13、组表达质粒 pET-32a（+） / lytA 测序结果图。 0012 图 7 是本发明实施例重组克隆质粒 PGM-T/lytA经 IPTG 诱导后经 1% 琼脂糖凝胶 电泳鉴定图。 0013 图 8 是本发明实施例纯化产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定图。 0014 图 9 是本发明实施例纯化产物离子阱质谱图。 具体实施方式 0015 a. 提取肺炎链球菌 （ATCC49619） 基因组 DNA ； b. 以GennBank中肺炎链球菌M66菌株lytA基因全序列 （FN549899.1） ， 设计上下游引 物 ： P1 为 5-GGGGGATCCATGGAAATTAATGTGAGT-3， P。
14、2 为 5-GGGAAGCTTTTTTACTGTAATCAAGCC ATC-3， 斜体部分为引入的BamHI 和HindIII 酶切位点 ； 以得到的 DNA 为模板， 以上述具有BamHI 和HindIII 两个酶切位点的 PCR 反应引物进 行 PCR 反应扩增目的片段， PCR 反应条件 95 4min ； 95 30s、 56 30s、 72 1min、 30 个循 环 ； 72 7min ； 反应产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定 （如图 1 所示） ， 切胶回收 950bp PCR 反应产物 ； 图1中M ： 2000 Marker ； 1 ： 阴性对照 ； 2、 3 ： 目的基因 。
15、； 950bp处可见特异性条带， 与预期 说 明 书 CN 104152467 A 4 3/4 页 5 结果 （956bp） 相符 ； c. 将切胶回收的 PCR 反应产物与克隆载体相接， 构建克隆质粒 PGM-T/lytA， 测序由 TaKaRa 公司完成 ； 重组克隆质粒PGM-T/ lytA测序结果与GenBank中M66菌株的基因序列符合率为98%, 不同之处主要位于444bp466bp， 如图2所示ATCC49619菌株新增了一个BamHI酶切位点 （GGATCC） ； d. 分别用BamHI 和HindIII 双酶切所构建的克隆质粒 PGM-T/ lytA， 之后经 1% 琼脂 糖。
16、凝胶电泳， 结果如图 4 所示， 图 4 中 M:10000 Marker ； 1 ： 重组质粒 ； 2 ： 重组质粒经 BamHI和HindIII双酶切， 酶切成的三个片段中居中的片段即为lytA； 切胶回收三段中居 中的约 500bp 小片段， 用连接酶与表达载体 pET-32a （+） 连接， 再转化到感受态细胞E.coli DH5a， 于 LB/Amp 平板上挑取单个克隆培养后， 构建重组表达质粒 pET-32a （+） / lytA ， 抽 提质粒进行双酶切鉴定 （如图 5） 并再次测序 （如图 6 所示） ， ； 图 5 中 M:10000 Marker ； 1 ： pET-32a。
17、 ； 2 ： pET-32a 经 BamHI 和 HindIII 双酶切 ； 3 ： 重组 表达质粒 pET32a（+） /lytA ； 4 ： pET32a（+） /lytA 经 BamHI 和 HindIII 双酶切 ； 序列测定结果如图 6， 显示该片段基因与肺炎链球菌 ATCC49619 菌株的克隆质粒 PGM-T/lytA相应部分符合率为 100%， 未出现变异 ； e. 将鉴定正确的重组表达质粒转化至感受态细胞E.coli BL21 （DE3） ， 涂布于 LB/Amp 平板， 筛选阳性克隆接种于 LB/Amp 液体培养基， 37培养至对数生长期 （A600值为 0.6 0.8） 。
18、， 加入终浓度为 1mmol/L 的 IPTG， 25诱导 4h ； 诱导产物经1%琼脂糖凝胶电泳如图7所示， 图中M ： 蛋白质标准 ； 1 ： pET32a （+） /lytA 转化菌经 IPTG 诱导后的蛋白质表达产物 ； 2 ： pET32a（+） /lytA 转化菌的蛋白质表达产 物 ； 3 ： pET-32a空载体转化菌经IPTG诱导后的蛋白质表达产物 ； 4 ： pET-32a空载体转化菌 的蛋白质表达产物 ； 5 ： 大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导后的蛋白质表达产物 ； 6 ： 大肠杆菌 BL21(DE3) 的蛋白质表达产物。表明小片段自溶素的重组表达质粒 pET-3。
19、2a（+） / lytA 经 IPTG 诱导后， 在相对分子质量 （Mr） 约 20kD 处有明显的蛋白表达条带 ； f. 4离心收集菌体， 加入裂解液超声破碎， 4离心收集上清， 用透析袋等电点洗脱 法回收纯化蛋白 LytA。 0016 回收纯化蛋白LytA电泳如图8所示， 图中M ： 蛋白质标准 ； 1 ： 不含硫氧还原蛋白 的 LytA； 2 ： 全段蛋白 LytA， 表明为单一蛋白条带。 0017 离子阱质谱图如图 9 所示 ： 分析证实所得蛋白 LytA相对分子量 19.5kD， 非硫氧 还原蛋白。 0018 蛋白 LytA测序结果， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 5 所示。
20、。 0019 体外抗菌效应实验 ： 参照 CLSI 标准， 采用微量肉汤稀释法测定本发明实施例所得 LytA及青霉素 G 的 MIC， 以测得 MIC 的 3 倍浓度进行体外抗菌试验， 35孵育 1h， 3h， 5h 和 7h 后每孔取样 2l 分别做平板菌落计数。 0020 实验结果 ： 自作用于细菌 3h 开始， LytA开始发挥抑菌效应， 细菌数相比于对照组减少， 差异有 统计学意义， 作用持续到 7h 观察点。3h 和 5h 时间点抑菌效果与青霉素相比， 无显著性差 说 明 书 CN 104152467 A 5 4/4 页 6 异， 但是 7h 时抑菌效果强于青霉素 （P 大连医科大学。
21、 肺炎链球菌自溶素小片断基因表达蛋白、 制备方法及用途 5 1 27 DNA 人工序列 引物 1 GGGGGATCCATGGAAATTAATGTGAGT 27 2 30 DNA 人工序列 引物 2 GGGAAGCTTTTTTACTGTAATCAAGCCATC 30 3 1176 DNA 人工序列 重组克隆质粒 PGM-T/lytA 序 列 表 CN 104152467 A 7 2/3 页 8 3 GGCCAGTGATTGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGCCCGACGTC GCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGGAATTCGATGGGATCCATG。
22、G AAATTAATGTGAGTAAATTAAGAACAGATTTGCCTCAAGTCGGCGTGCAA CCATATAGGCAAGTACACGCACACTCAACTGGGAATCCGCATTCAACCGT ACAGAATGAAGCGGATTATCACTGGCGGAAAAACCCAGAATTAGGTTTTT TCTCGCACATTGTTGGGAACGGTTGCATCATGCAGGTAGGACCTGTTGAT AATGGTGCCTGGGACGTTGGGGGCGGTTGGAATGCTGAGACCTATGCAGC GGTTGAACTGATTGAAAGCCATTCAACTAAAGAAGAGTTCATG。
23、ACGGACT ACCGCCTTTATATCGAACTCTTACGCAATCTAGCAGATGAAGCAGGTTTG CCGAAAACGCTTGATACAGGGAGTTTAGCTGGAATTAAAACGCACGAGTA TTGCACGAATAACCAACCAAACAACCACTCAGACCATGT GGATCC ATACCCTTACTTGGCAAAATGGGGCATTAGCCGTGAGCAGTTTAAGTATGATATTGAGAA CGGCTTGACGATTGAAACAGGCTGGCAGAAGAATGACACTGGCTA CTGGTACGTACATTCAGACGGCTCTTATCCAAGAGA。
24、CAAGTTTGAGAAAA TCAATGGCACTTGGTACTACTTTGACAGTTCAGGCTATATGCTTGCAGAC CGCTGGAGGAAGCACACAGACGGCAACTGGTACTGGTTCGACAACTCAGG CGAAATGGCTACAGGCTGGAAGAAAATCGCTGATAAGTGGTACTATTTCA ACGAAGAAGGTGCCATGAAGACAGGCTGGGTCAAGTACAAGGACACTTGG TACTACTTAGACGCTAAAGAAGGCGCCATGGTATCAAATGCCTTTATCCA GTCAGCGGACGGAACAGGCTGGTACTACCT。
25、CAAACCAGACGGAACACTGG CAGACAAGCCAGAATTCACAGTAGAGCCAGATGGCTTGATTACAGTAAAA AAGCTTCCCAATCACTAGTGAATTCGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATAT GGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTATAGTGTC ACCTAAATAGCTTGGCGTAATCATGT 1176 4 699 DNA 人工序列 重组表达质粒 pET32a（+） /lytA 4 GCTTCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGG TGC。
26、TCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTTTTACTGTAATCAAGCCATCTGGCTC TACTGTGAATTCTGGCTTGTCTGCCAGTGTTCCGTCTGGTTTGAGGTAGT ACCAGCCTGTTCCGTCCGCTGACTGGATAAAGGCATTTGATACCATGGCG 序 列 表 CN 104152467 A 8 3/3 页 9 CCTTCTTTAGCGTCTAAGTAGTACCAAGTGTCCTTGTACTTGACCCAGCC TGTCTTCATGGCACCTTCTTCGTTGAAATAGTACCACTTATCAGCGATTT TCTTCCAGCCTGTAGCC。
27、ATTTCGCCTGAGTTGTCGAACCAGTACCAGTTG CCGTCTGTGTGCTTCCTCCAGCGGTCTGCAAGCATATAGCCTGAACTGTC AAAGTAGTACCAAGTGCCATTGATTTTCTCAAACTTGTCTCTTGGATAAG AGCCGTCTGAATGTACGTACCAGTAGCCAGTGTCATTCTTCTGCCAGCCT GTTTCAATCGTCAAGCCGTTCTCAATATCATACTTAAACTGCTCACGGCT AATGCCCCATTTTGCCAAGTAAGGGTATGGATCCGATATCAGCCATGGCC TTGTCGTCGTC。
28、GTCGGTACCCAGATCTGGGCTGTCCATGTGCTGGCGTTC GAATTTAGCAGCAGCGGTTTCTTTCATACCAGAACCGCGTGGCACCAGA 699 5 228 PRT 肺炎链球菌自溶素小片断基因表达蛋白 LytA 5 ASFGLC.QPDLSGGGGGARVRPQAFLL.SSHLALLWILACLPVFRLVWGSTSLFRPLTG.RHLIPWRLL.RLS STKCPCTWPSLSSWHLLRWNSTTYQRFSSSL.PFRLSCRTSTSCRLCASSSGLQAYSLNCQSSTKCHWFSQTCLLDK SRLNVRTSSQCHSSASLFQ。
29、SSSRSQYHT.TAHG.CPILPSKGMDPISAMALSSSSVPRSGLSMCWRSNLAAAVSFIP EPRGTR 228 序 列 表 CN 104152467 A 9 1/7 页 10 图 1 说 明 书 附 图 CN 104152467 A 10 2/7 页 11 图 2 说 明 书 附 图 CN 104152467 A 11 3/7 页 12 图 3 说 明 书 附 图 CN 104152467 A 12 4/7 页 13 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 104152467 A 13 5/7 页 14 图 6 说 明 书 附 图 CN 104152467 A 14 6/7 页 15 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 104152467 A 15 7/7 页 16 图 9 说 明 书 附 图 CN 104152467 A 16 。