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1、(10)申请公布号 CN 104193806 A (43)申请公布日 2014.12.10 CN 104193806 A (21)申请号 201410400425.1 (22)申请日 2014.08.14 C07K 7/08(2006.01) C07K 19/00(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 15/66(2006.01) (71)申请人 天津大学 地址 300072 天津市南开区卫津路 92 号 (72)发明人 孙剑 冯建男 臧孟存 沈倍奋 (74)专利代理机构 天津市北洋有限责任专利代 理事务所 12201 代理。
2、人 陆艺 (54) 发明名称 BLyS 拮抗肽 SS12、 含该拮抗肽的融合蛋白 SS12-Fc 及基因 (57) 摘要 本发明公开了 BLyS 拮抗肽 SS12、 含该拮抗肽 的融合蛋白SS12-Fc及基因， 实验证明SS12-Fc和 3SS12-Fc 融合蛋白可以和 BLyS 结合， 并且抑制 BLyS 与 BCMA、 BLyS 与 TACI 的相互作用。SS12-Fc 和 3SS12-Fc 融合蛋白既保障了 SS12 和 3SS12 空 间结构的稳定性， 又不削弱肽的活性。同时 SS12 和3SS12得到 Fc 标签， 更易于纯化与检测。 因此， SS12-Fc 和 3SS12-Fc 可。
3、以作为治疗 BLyS 拮抗剂 应用于自身免疫疾病和淋巴瘤的潜在药物。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 7 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 序列表7页 附图3页 (10)申请公布号 CN 104193806 A CN 104193806 A 1/1 页 2 1.BLyS 拮抗肽 SS12， 是用 SEQ ID NO.1 所示。 2.BLyS 拮抗肽 3SS12， 是用 SEQ ID NO.2 所示。 3. 含 BLyS 拮抗肽 SS12 的融合蛋白 SS12-Fc， 是用 SEQ ID 。
4、NO.3 所示。 4. 含 BLyS 拮抗肽 3SS12 的融合蛋白 3SS12-Fc， 是用 SEQ ID NO.4 所示。 5.编码BLyS拮抗肽SS12的基因， 其特征是用下述方法构建 ： 以SEQ ID NO.5所示序列 为上游引物， 以SEQ ID NO.6所示序列为下游引物， 上、 下游引物互补， 通过变性、 退火， 配对 形成编码 BLyS 拮抗肽 SS12 的基因， 所述编码 BLyS 拮抗肽 SS12 的基因如 SEQ ID NO.7 所 示。 6. 编码融合蛋白 SS12-Fc 的基因， 其特征是用下述方法构建， 用限制性内切酶 EcoRI 和 Hind III 酶切人 I。
5、gG1Fc DNA 片段， 回收 630bp 的 Fc DNA 片段， 与权利要求 5 获得的编 码 BLyS 拮抗肽 SS12 的基因连接， 得到编码融合蛋白 SS12-Fc 的基因， 所述编码融合蛋白 SS12-Fc 的基因如 SEQ ID NO.8 所示。 7. 含编码融合蛋白 SS12-Fc 基因的质粒， 其特征是用下述方法构建， 用限制性内切酶 NdeI 和 Hind III 酶切载体 pET30a， 回收酶切后 pET30a 片段， 与权利要求 6 获得的编码融 合蛋白 SS12-Fc 的基因加入 T4 连接酶， 进行连接反应制成含编码融合蛋白 SS12-Fc 基因的 质粒 SS1。
6、2-Fc-pET30a。 8. 编码 BLyS 拮抗肽 3SS12 的基因， 其特征是用下述方法构建 ： 含有编码 BLyS 拮抗肽 3SS12 的基因的质粒 3SS12-pUC19( 由鼎国生物技术公司合成 )， 用 NdeI 和 EcoRI 酶切获得 编码 BLyS 拮抗肽 3SS12 的基因， 所述编码 BLyS 拮抗肽 3SS12 的基因如 SEQ ID NO.9 所示。 9. 编码融合蛋白 3SS12-Fc 的基因， 其特征是用下述方法构建， 用限制性内切酶 EcoRI 和 Hind III 酶切人 IgG1FcDNA 片段， 回收 630bp 的 Fc DNA 片段， 与权利要求 。
7、8 获得的编 码 BLyS 拮抗肽 3SS12 的基因连接， 得到编码融合蛋白 3SS12-Fc 的基因， 所述编码融合蛋白 3SS12-Fc 的基因如 SEQ ID NO.10 所示。 10. 含编码融合蛋白 3SS12-Fc 基因的质粒， 其特征是用下述方法构建， 用限制性内切 酶 NdeI 和 Hind III 酶切 pET30a， 回收酶切后 pET30a 片段， 与权利要求 9 获得的编码融合 蛋白 3SS12-Fc 的基因加入 T4 连接酶， 进行连接反应制成含编码融合蛋白 3SS12-Fc 基因的 质粒 3SS12-Fc-pET30a。 权 利 要 求 书 CN 10419380。
8、6 A 2 1/8 页 3 BLyS 拮抗肽 SS12、 含该拮抗肽的融合蛋白 SS12-Fc 及基因 技术领域 0001 本发明属于生物医药领域， 特别是涉及BLyS拮抗肽， 以及含BLyS拮抗肽的融合蛋 白及基因及质粒。 背景技术 0002 B 淋巴细胞刺激因子 (B lymphocyte stimulator,BLyS)， 又称为 B 细胞激活因子 (B cell activating factor belonging to the TNF family,BAFF)， 是 TNF 家族中的一 员。由单核细胞和巨噬细胞持续合成、 分泌。BLyS 能够结合 B 细胞表面的三种受体， B 细 。
9、胞成熟抗原 (B cell mature antigen,BCMA)， 跨膜激活物和 CAML 结合物 (Transmembrane activator and CAML-interactor,TACI) 以及 BLyS 受体 3(BR3)。受体结合 BLyS 后， 偶联 TNF 受体相关因子 (TNF receptor associated factor,TRAF)， 激活 NF-B 途径。最终， 诱 导抗细胞凋亡基因 ： Bcl-2、 Bcl-xL 的表达， 减少成熟 B 细胞的凋亡。如果敲除 BLyS， 小鼠体 内的成熟 B 细胞完全缺失。因此， BLyS 在 B 细胞的发育和成熟过程中。
10、起至关重要的作用。 0003 由于 BLyS 在 B 淋巴细胞活化、 增殖中发挥重要作用， 而 B 淋巴细胞产生的抗体 所介导的体液免疫在众多已发现的自身免疫性疾病当中处于中心地位。因此， 目前认为 BLyS 在体内的过量表达与某些自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮 (SLE)、 类风湿性关节炎 (RA)、 口眼干燥综合征 (Siogren) 等病程的发生、 发展密切相关。过量表达 BLyS 的转基因 小鼠出现系统性红斑狼疮样症状。临床实验也发现， SLE 和 Siogren 综合征病人的血清中， 可溶性 BLyS 明显高于正常人。同时， 作为 B 细胞刺激、 存活因子， BLyS 及其受体参与骨。
11、髓 瘤和淋巴瘤的发生和发展。因此， 以阻断 BLyS 生物学功能为策略， 探讨 BLyS 拮抗剂治疗系 统性红斑狼疮和类风湿性关节炎等自身免疫性疾病和 B 细胞肿瘤疾病的研究正在国外如 火如荼的进行中。目前， 针对 BLyS 的抑制剂的研究主要集中在研制具有中和 BLyS 作用的 BLyS 诱饵受体 (decoy receptor)、 抗 BLyS 抗体和拮抗肽 (1， 2)。2011 年 3 月美国 FDA 批 准由人类基因科学公司 (Human Genome Sciences) 和葛兰士 - 史克 (GlaxoSmithKline) 公 司联合研发的抗 BLyS 抗体 BENLYSTA(B。
12、elimumab) 治疗系统性红斑狼疮。这是 50 年来， FDA 首次批准治疗该类疾病的药物。因此， BLyS 拮抗剂有着广泛的临床应用前景。 0004 众多研究已经详细阐述 BLyS 与受体相互作用的可能模式及关键氨基酸。所以， 针 对 BLyS 与其受体结合核心区域的拮抗肽也成为 BLyS 抑制剂的策略。与抗体和诱饵蛋白等 大分子拮抗剂相比， 多肽具有分子量小、 渗透性强、 人工合成简单、 免疫原性低， 毒性低和副 作用少的优点。然而， 多肽也存在不稳定、 效率低和半衰期短的缺点。我们在前期工作中探 讨了 BLyS 拮抗肽抑制 BLyS 的功能， 初步结果显示 ： 合成的 16 个氨基酸。
13、的肽在体外能够部 分抑制 BLyS 的作用 (3)。进一步通过计算机分子模建、 优化设计 BLyS 拮抗肽， 将有望提高其 抑制 BLyS 生物学功能。为开发治疗 SLE 和 RA 这类自身免疫性疾病和 B 细胞肿瘤的新药奠 定实验研究基础。 0005 1.Sun J( 孙剑 ),Lin Z,Feng J,Li Y and Shen B(2008)BAFF-targeting therapy,a promising strategy for treating autoimmune diseases.Eur J 说 明 书 CN 104193806 A 3 2/8 页 4 Pharmacol59。
14、7:15. 0006 2.Sun J( 孙剑 ),Lin Z,Feng J,Li Y and Shen B(2008)B lymphocyte stimulator,a new target for treating B cell malignancies.Chinese Medical J121(14):1319-1323. 0007 3.Sun J( 孙剑 ),Feng J,Li Y and Shen B(2006)A novel BLyS antagonist peptide designed based on the3-D complex structure of BCMA and B。
15、LyS.Biochem Biophys Res Commun346(4):1158-1162. 发明内容 0008 本发明的目的是克服现有技术的不足， 提供一种 BLyS 拮抗肽 SS12。 0009 本发明的第二个目的是提供一种 BLyS 拮抗肽 3SS12。 0010 本发明的第三个目的是提供一种含 BLyS 拮抗肽 SS12 的融合蛋白 SS12-Fc。 0011 本发明的第四个目的是提供一种含 BLyS 拮抗肽 3SS12 的融合蛋白 3SS12-Fc。 0012 本发明的第五个目的是提供一种编码 BLyS 拮抗肽 SS12 的基因。 0013 本发明的第六个目的是提供一种编码融合蛋白。
16、 SS12-Fc 的基因。 0014 本发明的第七个目的是提供一种含编码融合蛋白 SS12-Fc 基因的质粒。 0015 本发明的第八个目的是提供一种编码 BLyS 拮抗肽 3SS12 的基因。 0016 本发明的第九个目的是提供一种编码融合蛋白 3SS12-Fc 的基因。 0017 本发明的第十个目的是提供一种含编码融合蛋白 3SS12-Fc 基因的质粒。 0018 本发明的技术方案概述如下 ： 0019 BLyS 拮抗肽 SS12， 是用 SEQ ID NO.1 所示。 0020 BLyS 拮抗肽 3SS12， 是用 SEQ ID NO.2 所示。 0021 含 BLyS 拮抗肽 SS12。
17、 的融合蛋白 SS12-Fc， 是用 SEQ ID NO.3 所示。 0022 含 BLyS 拮抗肽 3SS12 的融合蛋白 3SS12-Fc， 是用 SEQ ID NO.4 所示。 0023 编码BLyS拮抗肽SS12的基因， 是用下述方法构建 ： 以SEQ ID NO.5所示序列为上 游引物， 以SEQ ID NO.6所示序列为下游引物， 上、 下游引物互补， 通过变性、 退火， 配对形成 编码 BLyS 拮抗肽 SS12 的基因， 所述编码 BLyS 拮抗肽 SS12 的基因如 SEQ ID NO.7 所示。 0024 编码融合蛋白SS12-Fc的基因， 是用下述方法构建， 用限制性内切。
18、酶EcoRI和Hind III 酶切人 IgG1Fc DNA 片段， 回收 630bp 的 Fc DNA 片段， 与权利要求 5 获得的编码 BLyS 拮 抗肽 SS12 的基因连接， 得到编码融合蛋白 SS12-Fc 的基因， 所述编码融合蛋白 SS12-Fc 的 基因如 SEQ ID NO.8 所示。 0025 含编码融合蛋白 SS12-Fc 基因的质粒， 是用下述方法构建， 用限制性内切酶 NdeI 和 Hind III 酶切载体 pET30a， 回收酶切后 pET30a 片段， 与权利要求 6 获得的编码融合蛋 白 SS12-Fc 的基因加入 T4 连接酶， 进行连接反应制成含编码融合。
19、蛋白 SS12-Fc 基因的质粒 SS12-Fc-pET30a。 0026 编码 BLyS 拮抗肽 3SS12 的基因， 是用下述方法构建 ： 含有编码 BLyS 拮抗肽 3SS12 的基因的质粒 3SS12-pUC19( 由鼎国生物技术公司合成 )， 用 NdeI 和 EcoRI 酶切获得编码 BLyS 拮抗肽 3SS12 的基因， 所述编码 BLyS 拮抗肽 3SS12 的基因如 SEQ ID NO.9 所示。 0027 编码融合蛋白 3SS12-Fc 的基因， 是用下述方法构建， 用限制性内切酶 EcoRI 和 说 明 书 CN 104193806 A 4 3/8 页 5 Hind II。
20、I 酶切人 IgG1FcDNA 片段， 回收 630bp 的 Fc DNA 片段， 与权利要求 8 获得的编码 BLyS 拮抗肽 3SS12 的基因连接， 得到编码融合蛋白 3SS12-Fc 的基因， 所述编码融合蛋白 3SS12-Fc 的基因如 SEQ ID NO.10 所示。 0028 含编码融合蛋白 3SS12-Fc 基因的质粒， 是用下述方法构建， 用限制性内切酶 NdeI 和 Hind III 酶切 pET30a， 回收酶切后 pET30a 片段， 与权利要求 9 获得的编码融合蛋白 3SS12-Fc 的基因加入 T4 连接酶， 进行连接反应制成含编码融合蛋白 3SS12-Fc 基因。
21、的质粒 3SS12-Fc-pET30a 0029 实验证明SS12-Fc和3SS12-Fc融合蛋白可以和BLyS结合， 并且抑制BLyS与BCMA、 BLyS 与 TACI 的相互作用。SS12-Fc 和 3SS12-Fc 融合蛋白既保障了 SS12 和 3SS12 空间结 构的稳定性， 又不削弱肽的活性。同时 SS12 和 3SS12 得到 Fc 标签， 更易于纯化与检测。因 此， SS12-Fc 和 3SS12-Fc 可以作为治疗 BLyS 拮抗剂应用于自身免疫疾病和淋巴瘤的潜在 药物。 附图说明 0030 图 1 为 SS12-Fc-pET30a 和 3SS12-Fc-pET30a 质粒。
22、示意图。 0031 图 2 为 SS12 双链 DNA 梯度电泳 , 其中， 1-4 ： 0.1pmol/L， 0.2pmol/L， 0.4pmol/L， 0.8pmol/L ； M ： marker。 0032 图 3 为 NdeI 和 EcoRI 双酶切 3SS12 载体质粒 3SS12-pUC19， 其中， 1 和 2 是 3SS12 载体质粒 ； M ： marker。 0033 图 4 为人 IgG1Fc 片段和原核表达载体 pET30a， 其中 1 是人 IgG1Fc 片段 ； 2 是 pET30a ； M 是 marker。 0034 图 5 为 SS12-Fc 菌落 PCR 筛。
23、选， 其中， M， Marker ； 2， 3， 4， 5 阳性菌落。 0035 图 6 为 3SS12-Fc 菌落 PCR 筛选， 其中， M， Marker ； 1， 5， 6 阳性菌落。 0036 图 7 为重组质粒的双酶切鉴定 . 其中， M， marker ； 1， EcoRI 和 Hind III 酶切 SS12-Fc-pET30a 质粒 ； 2， EcoRI 和 Hind III 酶切 3SS12-Fc-pET30a 质粒。 0037 图 8 为 SS12-Fc 融合蛋白和 3SS12-Fc 融合蛋白 SDS-PAGE 电泳图。其中， 33SS12， 3SS12-Fc 融合蛋白 。
24、； SS12， SS12-Fc 融合蛋白 ； M， marker。 0038 图 9 为融合蛋白 SS12-Fc 和 3SS12-Fc 与 BLyS 结合的 ELISA 试验。 0039 图 10 为融合蛋白 SS12-Fc 和 3SS12-Fc 显著抑制 BLyS 与 TACI 相互作用的 ELISA 试验。 0040 图 11 为融合蛋白 SS12-Fc 和 3SS12-Fc 显著抑制 BLyS 与 BCMA 相互作用的 ELISA 试验。 具体实施方式 0041 下面的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明， 但并不对本发 明作任何限制。 0042 将 BLyS 拮抗肽命名为。
25、 SS12 和 3SS12 仅是为了方便描述， 但并不对此进行限定。 0043 人 BLyS 蛋白 ： 孙剑 , 黎燕 , 冯建男 , 孙瑛勋 , 胡美茹 , 沈倍奋 . 人可溶性 B 淋巴 细胞刺激因子基因的克隆及在大肠杆菌中的表达 J. 细胞与分子免疫学杂志 ,2006,(2) 说 明 书 CN 104193806 A 5 4/8 页 6 0044 人 TACI-Fc 蛋白 ： 冀丽军 , 白乌仁图雅 , 柴琳 , 孙剑 .TACI-Fc 融合蛋白的基因构 建、 原核表达及生物活性鉴定 J. 生物技术 ,2013,(3). 0045 人 TACI-Fc-myc 蛋白 ： 白乌仁图雅， 赵亚。
26、璁， 朱燕锋， 孙剑 .sTACI-Fc-Myc 融合蛋 白基因的构建， 原核表达及活性鉴定 J. 现代生物医药进展 ,2014,( 印刷中 ). 或白乌仁 图雅 . 新颖 BAFF 拮抗肽体抑制 BAFF 与其受体 TACI 相互作用的功能研究 .D. 天津大 学 ,2014 0046 人 BCMA-Fc 蛋白 ： 孙剑 , 冯建男， 林周， 黎燕 , 沈倍奋 . 计算机辅助设计可溶性 BLyS 受体 ,eBCMA-Fc 融合蛋白及其在大肠杆菌中的表达 . 中国生物化学与分子生物学报 2008,24(2) ： 127 133. 0047 人 BCMA-Fc-myc 蛋白 : 朱燕锋， 柴林，。
27、 臧梦存 .BCMA-Fc-Myc 融合蛋白的构建、 表达 及活性鉴定 J. 生物技术 ,2013,23(5):24-28. 0048 人 Fc 蛋白 ： 吴真 .BCMA-Fc 作为潜在药物的研究 D. 天津大学 ,2012 0049 包被液 ： 称量出33.6g碳酸氢钠和63.6g无水碳酸钠,将其放如烧杯中， 向内加入 600ml 蒸馏水， 搅拌至溶质全部溶解， 再加入蒸馏水中定容到 1 了 L。将其放在 4下保存。 0050 PBST 的配制 ： 在取 250l 吐温 -20 加入 500ml 的 1PBS 中， 混合均匀至完全融 合。在室温下保存 0051 5脱脂奶粉的配制 ： 称取脱。
28、脂奶粉1g， 搅拌下溶解于10ml0.01M PBS中， 加PBS定 容至 20ml， 于 4保存 0052 TMB 显色液 ： 取 4.95ml 底物缓冲液， 0.05ml1 TMB 储液， 临用前加入 5l30过 氧化氢。 0053 1 TMB 储液 ： 称取 1g TMB， 搅拌下充分溶解于 80ml DMSO 中， 加 DMSO 定容至 100ml， 保存于 4。 0054 底物缓冲液 (pH5.0) ： 取 24.3ml0.1M 柠檬酸， 25.7ml0.2M 磷酸氢二钠， 加入约 40ml 水， 调 pH 至 5.0， 再加水定容至 100ml， 保存于室温。TMB 工作液 ( 现。
29、配现用 ) 0055 本发明基于BLyS和其受体的晶体结构， 通过计算机模建， 模拟BLyS与受体的相互 作用模式和条件优化， 辅助设计理论上拮抗 BLyS 与受体相互作用的拮抗肽。为了保障拮抗 肽的空间结构和稳定性， 通过基因工程的方法， 将有抑制活性的拮抗肽基因与人 IgG1Fc 序 列连接， 最终得到性质稳定的 BLyS 拮抗肽 -Fc 融合蛋白， 进一步通过生物实验验证 BLyS 拮 抗肽 -Fc 融合蛋白的功能活性。为开发有临床应用前景的新药先导药物奠定了实验研究基 础。 0056 实施例 1 0057 BLyS 与其受体相互作用的结构信息和新型靶向 BLyS 拮抗肽的设计 0058。
30、 利用计算机辅助分子对接及动力学模拟探讨了 BLyS 与其受体相互作用模式， 借 助计算机图形学、 距离几何学分析了 BLyS 与其受体相互识别的关键氨基酸残基。 0059 通过计算机辅助分子设计以及高通量虚拟筛选技术从头设计能够模拟受体关键 氨基酸构象的短肽， 进而借助从头搭建、 分子对接、 动力学模拟从理论上评价 BLyS 与拮抗 肽的作用 ； 利用计算机图形学技术、 距离几何学以及分子间氢键作用评价拮抗肽潜在的生 物学效应。经过理论筛选得到 BLyS 拮抗肽， 命名为 SS12， 是用 SEQ ID NO.1 所示。 0060 实施例 2 说 明 书 CN 104193806 A 6 5。
31、/8 页 7 0061 分 别 构 建 含 SS12-Fc 和 3SS12-Fc 融 合 蛋 白 基 因 的 质 粒 SS12-Fc-pET30a 和 3SS12-Fc-pET30a( 图 1)。 0062 2.1 编码 BLyS 拮抗肽 SS12 的基因， 是用下述方法构建 ： 依据拮抗肽 SS12 的氨基 酸序列， 我们设计了两条编码短肽的 DNA 引物， 并通过公司订购合成。 0063 SS12 上游引物是以 SEQ ID NO.5 所示， SS12 下游引物是以 SEQ ID NO.6 所示 0064 合成的 SS12 的 DNA 引物加入 200l10mM Tris-Hcl(pH8.。
32、5) 溶解 ( 终浓度为 16pmol/l)。各取 SS12 基因的正链和负链 20l， 混合在 EP 管中， 100水浴煮沸 3min， 逐渐冷却至室温。用 2的琼脂糖凝胶电泳， 观察退火结果。电泳结果显示 65bp 处有明显 条带 ( 图 2)， 证明配对形成编码 BLyS 拮抗肽 SS12 的基因合成成功如 SEQ ID NO.7 所示。 0065 2.2 依据 BLyS 拮抗肽 SS12 氨基酸序列， 我们设计了 3 拷贝 SS12(BLyS 拮抗肽 3SS12)。其氨基酸序列为 ： GSSNPTFGSTSKGGGGSGSSNPTFGSTSKGGGGSGSSNPTFGSTSKGGGGS。
33、(SE Q ID NO.2)。其中， 斜体为 SS12 序列， 下划线标注为连接肽。3SS1 基因序列通过公司订购 合成。编码 BLyS 拮抗肽 3SS12 的基因序列是 SEQ ID NO.9 所示。 0066 合成的 3SS12 的基因序列插入在 pUC19 质粒载体上 ( 得到含有编码 BLyS 拮抗肽 3SS12 的基因的质粒 3SS12-pUC19)， 5 端含有 NdeI 酶切位点， 3 端含有 EcoRI 酶切位点 ； 通过限制性内切酶 NdeI 和 EcoRI 酶切得到 162bp 的编码 BLyS 拮抗肽 3SS12 的基因 ( 见图 3)。 0067 人 IgG1Fc 片段。
34、由 PCR 技术获得 ( 见图 4)， Fc 片段 ( 已知序列 ) 经过限制性内切 酶 EcoRI 和 Hind III 酶切之后， 分别与 SS12 基因和 3SS12 基因连接在被 NdeI 和 Hind III 酶切过的载体 pET30a 上， 得到连接体系， 同时制备空质粒阴性对照组。 0068 将连接体系转化进入 JM109 大肠杆菌中。SS12 组菌落 PCR 结果显示 2 号、 3 号、 4 号、 5 号菌种为阳性 ( 见图 5) ； 3SS12 组菌落 PCR 结果显示 1 号、 5 号、 6 号菌种为阳性 ( 见 图 6)。对 SS12 组的 1 号、 2 号菌种提取质粒酶。
35、切， 结果 750b 处有目的条带 ( 见图 7)。对 3SS12 组的 1 号、 2 号菌种提取质粒酶切， 结果 750b 处有目的条带 ( 见图 7)。菌落 PCR 和 双酶切结果表明了构建的含编码融合蛋白 SS12-Fc 基因的质粒 SS12-Fc-pET30a 和含编码 融合蛋白 3SS12-Fc 基因的质粒 3SS12-Fc-pET30a 的正确性。将 SS12 组 2 号、 3 号 4 号、 5 号菌种送生物公司测序， 测序结果进行序列比对， SS12-Fc 基因序列正确率 100， 表明 SS12-Fc-pET30a 重组质粒构建成功。将 3SS12 组 1 号、 5 号、 6 。
36、号菌种送生物公司测序， 测序 结果进行序列比对， 3SS12-Fc基因序列正确率100， 表明3SS12-Fc-pET30a重组质粒构建 成功。 0069 编码融合蛋白 SS12-Fc 基因序列是 ： 0070 GGTTCTTCTAACCCGACCTTCGGTTCTACCTCTAAAGGTGGAGGTGGATCTCCGTCAGTCTTCCTCTTC CCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGA AGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTG。
37、CATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGC AGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAG TGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACC ACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCT TCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAG。
38、CAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTG CTGGACTCCGACGGCCCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTT 说 明 书 CN 104193806 A 7 6/8 页 8 CTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA(SEQ ID NO.8)。其中斜体字部分 SS12 基因， 下划线标注的部分是连接肽 DNA 序列， 其余部分是 Fc 基因。该序列中 1-51 。
39、人工序列 ； 52-681 生物来源， 动物界脊索动物们脊椎动物亚门哺乳 纲真兽亚纲灵长目类人猿亚目人科 Homo sapiens IgG1Fc。 0071 表达 SS12-Fc。含 BLyS 拮抗肽 SS12 的融合蛋白 SS12-Fc 序列为 ： 0072 GSSNPTFGSTSKGGGGSPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQP。
40、ENNYKTTPPVLDSDGPFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS PGK。 (SEQ ID NO.3) ； 其中斜体部分是SS12氨基酸序列， 下划线标注的是连接肽， 余下的部 分是 Fc 氨基酸序列。该序列中 1-17 人工序列 ； 18-226 生物来源， 动物界脊索动物们脊椎 动物亚门哺乳纲真兽亚纲灵长目类人猿亚目人科 Homo sapiens IgG1Fc。 0073 编码融合蛋白 3SS12-Fc 的基因序列是 ： 0074 GGTTCTTCTAACCCGACCTTCGGTTCTACCTCTAAAGGTGGAGGTGGAGGTTCCG。
41、GTTCTTCTAACCCG ACCTTCGGTTCTACCTCTAAAGGTGGAGGTGGAGGTTCCGGTTCTTCTAACCCGACCTTCGGTTCTACCTCTAAAGG TGGAGGTGGAGGTTCCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTG AGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAG GTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTAC。
42、CGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCT GCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAA CCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAG AACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCA GCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGA。
43、CTCCGACGGCCCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCG TGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACG CAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA。 (SEQ ID NO.10) ； 其中斜体字部分SS12基因， 下划线标 注的是连接肽 DNA 序列， 其余部分是 Fc 基因， 表达 3SS12-Fc 融合蛋白。该序列中 1-162 人 工序列 ； 163-792 生物来源， 动物界脊索动物们脊椎动物亚门哺乳纲真兽亚纲灵长目类人 猿亚目人科 Hom。
44、o sapiens IgG1Fc。 0075 含 BLyS 拮抗肽 3SS12 的融合蛋白 3SS12-Fc 序列为 ： 0076 GSSNPTFGSTSKGGGGSGSSNPTFGSTSKGGGGSGSSNPTFGSTSKGGGGSPSVFLFPPKPKDTLMISR TPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGPFFLYSK LTVDKSRW。
45、QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。(SEQ ID NO.4) 其中斜体部分是 3SS12 氨基 酸序列， 下划线标注的是连接肽， 余下的部分是 Fc 氨基酸序列。该序列中 1-48 人工序列 ； 49-258 生物来源， 动物界脊索动物们脊椎动物亚门哺乳纲真兽亚纲灵长目类人猿亚目人科 Homo sapiens IgG1Fc。 0077 实施例 3 0078 SS12-Fc 和 3SS12-Fc 融合蛋白的诱导和表达 0079 将测序正确的重组质粒 SS12-Fc-pET30a 和 3SS12-Fc-pET30a 分别转化到表达宿 主菌大肠杆菌 E.Coli.BL21。
46、 进行高表达菌株筛选， 发现在 IPTG 浓度 0.5mM， 16慢速振摇 的条件下诱导， 能够诱导出目的蛋白。选取高表达菌株进行大量表达， 经蛋白 A 凝胶亲和层 说 明 书 CN 104193806 A 8 7/8 页 9 析柱纯化， 收集洗脱液， 在1PBS中透析， 用紫外分光光度计测量计算SS12-Fc蛋白浓度为 700ng/l， 3SS12-Fc 蛋白浓度为 1400ng/l。取透析后的目的蛋白进行 SDS-PAGE 电泳， 发现， SS12-Fc和3SS12-Fc蛋白的大小分别为25.4kDa和28.6kDa， 和SS12-Fc和3SS12-Fc 大小一致， 并且具有较高纯度 ( 。
47、见图 8)。 0080 实施例 4 0081 ELISA 实验验证 SS12-Fc 和 3SS12-Fc 融合蛋白的结合活性 0082 用包被液稀释BLyS蛋白至终浓度为10g/ml,取50L于酶标板中， 4， 18h。 用 PBST 洗涤酶标板 3 次， 每次 5min。每孔加 150l5脱脂奶粉， 37， 温育 2h。用 PBST 洗涤 酶标板 3 次， 每次 5min。加 0、 5、 10、 50 和 100g/ml 五个浓度梯度的 SS12-Fc 和 3SS12-Fc 蛋白溶液， 每个浓度 3 个平行， 每孔 50L， 37， 温育 1h。Fc 蛋白作为阴性对照， BCMA-Fc 作为。
48、阳性对照。用 PBST 洗涤酶标板 3 次， 每次 5min。每孔加 1 ： 5000 倍稀释的 HRP 标记羊 抗人抗体 50L， 37， 1h。用 PBST 洗涤 3 次， 每次 5min。每孔加入 50L TMB 显色液， 37 避光显色 10min。每孔加 50L1mol/L H2S04 终止反应， 酶标仪检测 OD450 值。SS12-Fc 和 3SS12-Fc 融合蛋白结合 BLyS 蛋白的活性由下述公式计算 ： 结合率实验组 OD450/ 对照 组 OD450。 0083 ELISA实验结果表明， SS12-Fc浓度在5g/ml时与BLyS结合率为41.7； 10g/ ml时与B。
49、LyS结合率为56.9； 50g/ml时与BLyS结合率为59.46； 100g/ml时与BLyS 结合率为 57.76。结合程度与融合蛋白的浓度呈正相关。3SS12-Fc 浓度在 5g/ml 时与 BLyS 结合率为 45.1； 10g/ml 时与 BLyS 结合率为 58.67； 50g/ml 时与 BLyS 结合率 为 76.02 ； 100g/ml 时与 BLyS 结合率为 76.72。结合程度与融合蛋白的浓度呈正相 关 ( 见图 9)。 0084 阴性对照 Fc 蛋白与 BLyS 没有明显的结合作用、 且没有剂量依赖关系。阳性对照 BCMA-Fc 蛋白与 BLyS 有结合， 且结合程度与融合蛋白浓度呈正相关。因此证明 SS12-Fc 和 3SS12-Fc 的结合作用是特异和有效的。 0085 实施例。