人类BRAF基因V600突变检测试剂盒.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104031992 A (43)申请公布日 2014.09.10 CN 104031992 A (21)申请号 201410226706.X (22)申请日 2014.05.27 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 武汉海吉力生物科技有限公司 地址 432060 湖北省武汉市东湖开发区高新 大道 858 号生物医药园二期 A82-1 栋 (72)发明人 王秀娟 梁惠 喻德华 (74)专利代理机构 武汉帅丞知识产权代理有限 公司 42220 代理人 朱必武 (54) 发明名称 人类 B-raf 基因 V600 突。

2、变检测试剂盒 (57) 摘要 本发明公开了一种人类B-raf基因V600突变 检测试剂盒 （荧光 PCR 法） ， 所述的检测试剂盒包 括用于阻断野生型 B-raf 基因扩增的肽核酸 PNA 探针、 用于特异性扩增 V600 突变型 B-raf 基因序 列的一组引物对及检测探针、 作为试剂盒内部质 控的一组引物对及检测探针。本发明的试剂盒适 用于临床多种样本类型选择， 具有特异性强， 灵敏 度高， 实验周期短， 操作简单， 安全无毒， 成本低等 显著优点。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利。

3、要求书1页 说明书6页 附图2页 (10)申请公布号 CN 104031992 A CN 104031992 A 1/1 页 2 1. 一种人类 B-raf 基因 V600 突变的检测试剂盒， 其特征在于 ： 所述的检测试剂盒包括 用于阻断野生型 B-raf 基因扩增的肽核酸 PNA 探针、 用于特异性扩增 V600 突变型 B-raf 基 因序列的一组引物对及检测探针、 作为试剂盒内部质控的一组引物对及检测探针 ； 所述肽核酸PNA探针的序列选自如下所示序列的任一种 ： SEQ ID NO.1、 SEQ ID NO.2、 SEQ ID NO.3、 SEQ ID NO.4、 SEQ ID NO。

4、.5 ； 所述用于特异性扩增 B-raf 基因靶向序列的一组引物对的上游序列选自如下所示序 列的任一种 ： SEQ ID NO.6、 SEQ ID NO.7、 SEQ ID NO.8 ； 所述用于特异性扩增 B-raf 基因靶向序列的一组引物对的下游序列选自如下所示序 列的任一种 ： SEQ ID NO.9、 SEQ ID NO.10、 SEQ ID NO.11 ； 所述用于特异性扩增 B-raf 基因靶向序列的检测探针 所述用于 V600 突变型 B-raf 基因的检测探针为 MGB 探针， 两端分别标记荧光报告基团 和荧光淬灭基团的寡核苷酸， 检测探针的序列选自如下所示序列的任一种 ： S。

5、EQ ID NO.12、 SEQ ID NO.13、 SEQ ID NO.14、 SEQ ID NO.15 ； 所述的作为试剂盒内部质控的一组引物对， 其序列为 SEQ ID NO.16 和 SEQ ID NO.17 所 示 ； 所述作为试剂盒内部质控的检测探针为 TaqMan 探针， 两端分别标记荧光报告基团和 荧光淬灭基团的寡核苷酸， 检测探针的序列为 SEQ ID NO.18 所示。 2. 根据权利要求 1 所述的人类 B-raf 基因 V600 突变的检测试剂盒， 其特征在于 ： 所述 的检测试剂盒还包括含有 PCR 缓冲液、 dNTPs、 MgCl2、 TaqDNA 聚合酶和模板 D。

6、NA 的 PCR 反应 体系及阳性对照品。 3. 根据权利要求 1 所述的人类 B-raf 基因 V600 突变的检测试剂盒， 其特征在于 ： 所述 的阳性对照品为含有 B-raf 基因第 15 外显子序列和第 18 外显子序列的质粒基因组 DNA 混 合物。 权 利 要 求 书 CN 104031992 A 2 1/6 页 3 人类 B-raf 基因 V600 突变检测试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及生物技术及临床分子诊断技术领域， 特别涉及人类B-raf基因V600突 变检测试剂盒。 技术背景 0002 B-raf 基因属于 RAF 家族一员， 编码 MAPK 通路中的丝氨酸苏氨酸蛋。

7、白激酶， 该酶 将信号从 ras 转导至 MEK1/2， 从而参与调控细胞内多种生物学活动。B-raf 基因突变引起 编码氨基酸的改变导致 B-raf 基因编码的蛋白持续被激活使得 MAPK 信号通路中的磷酸激 酶活性改变， 引起细胞异常增殖和分化， 最终形成肿瘤。 0003 B-raf 基因错义突变在人类实体肿瘤发生率中占 8%。在多种人类恶性肿瘤中， 如 结直肠癌、 黑色素瘤、 甲状腺癌、 肺癌等均存在不同比例的 B-raf 突变。据统计， B-raf 基 因在原发性黑素瘤中突变率为 80%、 在转移性黑色素瘤中突变率为 68% ； 在乳头状甲状腺 癌 （PTC） 中突变率为 56% ； 。

8、在结肠癌患者中突变率为 15% ； 非小细胞癌患者中突变率为 3%。 B-raf 基因突变主要发生在第 11 外显和第 15 外显子上， 第 15 外显子突变发生率占 80%， 其 中第 15 外显子处的 600 位氨基酸密码子 GTG 突变占第 15 外显子突变的 90% 以上。 0004 检测 B-raf 基因突变情况对肿瘤的发生发展和对肿瘤个体化治疗和预后均具有 重要的指导意义。 研究表明， 对EGFR靶向疗法缺乏敏感性的患者中， B-raf突变占10% ； 2011 年版 NCCN 结直肠癌临床实践指南 中明确指出结直肠癌患者应进行 B-raf 基因突变的检 测， 如果患者存在突变不建。

9、议使用抗 EGFR 单抗治疗。B-raf 基因突变检测已经成为 PTC 细 针穿刺细胞学标本诊断和病情预后的一个重要指标。 针对黑色素瘤疗效显著的靶向药物维 罗非尼 /Vemurafenib 已被美国 FDA 批准上市。因此， 通过检测 B-raf 基因突变可以实现肿 瘤患者的个体化治疗， 大大改善或延长患者生存期。 0005 对于晚期肿瘤及肿瘤复发而不能再次手术的患者， 血浆突变检测可作为一种新的 分子诊断方法， 血浆分子检测将成为肿瘤研究的一大热点。原因在于取材方便， 但是血浆 肿瘤 DNA 含量较之肿瘤组织甚少， 因此对于基因的检测方法的灵敏度及特异性提出很大挑 战。 0006 目前， 。

10、针对 B-raf 基因突变检测的方法有多种， 常规检测依然为 DNA 直接测序法， 但是 DNA 直接测序法存在很多缺点， 如 ： 检测周期长， 操作过程繁琐， 结果判读复杂， 尤其是 检测灵敏度低 （20%-25%） ， 易污染等缺点将难以满足临床检测需求。 目前临床急切需要一种 快速、 准确且能有效避免污染的 B-raf 基因突变检测试剂， 来辅助临床诊断及用药。 发明内容 0007 本发明的目的是提供一种快速， 准确， 有效防止污染的人类 B-raf 基因 V600 突变 检测试剂盒， 解决现有技术中针对 B-raf 基因突变检测周期长， 操作过程繁琐， 结果判读复 杂， 灵敏度低， 易。

11、污染等问题， 尤其提供除了肿瘤组织之外的无创伤的血浆或其他体液的检 测。 说 明 书 CN 104031992 A 3 2/6 页 4 0008 本发明的具体原理是 ： 应用肽核酸PNA探针阻断B-raf野生型基因扩增， 设计特异 性引物及 MGB 探针与突变模板稳固结合， 选用热启动 DNA 聚合酶， 以脱氧核苷酸为底物， 进 行 B-raf 突变基因的体外 PCR 扩增。MGB 探针在 PCR 过程中水解释放荧光信号对整个扩增 过程进行实时监测， 从而确定待测样本的 B-raf 基因 V600 突变情况。 0009 为了实现本发明的目的， 发明人通过大量试验研究和不懈探索， 最终获得了如下。

12、 技术方案 ： 一种人类 B-raf 基因 V600 突变检测试剂盒 （荧光 PCR 法） ， 所述的检测试剂盒包括用于 阻断野生型 B-raf 基因扩增的肽核酸 PNA 探针、 用于特异性扩增 V600 突变型 B-raf 基因序 列的一组引物对及检测探针、 作为试剂盒内部质控的一组引物对及检测探针 ； 所述用于阻断野生型基因扩增的肽核酸 PNA 探针序列为下述序列中的任一条 ： SEQ ID NO.01 ： H2N/TCGAGATTTCACTGTAGCTA/CON2H SEQ ID NO.02 ： H2N/GATTTCACTGTAGC/CON2H SEQ ID NO.03 ： H2N/CG。

13、AGATTTCACTGTAGC/CON2H SEQ ID NO.04 ： H2N/TCGAGATTTCACTGTAGCTA/CON2H SEQ ID NO.05 ： H2N/TCGAGATTTCACTGTAGC/CON2H 所述用于特异性扩增靶向序列的一组引物对的上游序列为下述序列中的任一条 ： SEQ ID NO.06 ： 5 GCCTCAATTCTTACCATCCACA 3 SEQ ID NO.07 ： 5 ACTGTTCAAACTGATGGGACC 3 SEQ ID NO.08 ： 5 CAGACAACTGTTCAAACTGAT 3 所述用于特异性扩增靶向序列的一组引物对的下游序列为下述。

14、序列中的任一条 ： SEQ ID NO.09 ： 5 TGAGATCTACTGTTTTCCT 3 SEQ ID NO.10 ： 5 CATAATGCTTGCTCTGATAGG 3 SEQ ID NO.11 ： 5 TAATGCTTGCTCTGATAGGAA 3 所述用于检测 B-raf 基因 V600 突变的探针为 MGB 探针， 探针的两端分别标记荧光报告 基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸， 其序列为述序列中的任一条 ： SEQ ID NO.12 ： FAM/ACTGTGAGGTCTTCATG/MGB SEQ ID NO.13 ： FAM/TCTGAGGTGTAGTAAGT/MGB SEQ ID。

15、 NO.14 ： FAM/ATCTGAGGTGTAGTAAGT/MGB SEQ ID NO.15 ： FAM/TAGCTAGACCAAAATC/MGB 所述作为试剂盒内部质控的一组引物对， 其序列为 SEQ ID NO.16， SEQ ID NO.17。 0010 SEQ ID NO.16 ： 5 TTCACCGCAGTGCATCAGAAC 3 SEQ ID NO.17 ： 5 GGACAGGAAACGCACCATATC 3 所述作为试剂盒内部质控的探针为 TaqMan 探针， 探针的两端分别标记荧光报告基团 和荧光淬灭基团的寡核苷酸， 其序列为 ： SEQ ID NO.18。 0011 SE。

16、Q ID NO.18 ： FAM/GAATCGGGCTGGTTTCCAAACAGA/BHQ1 经各组分优及条件化试剂盒提供的最优引物和探针组合见实施例表 1。 0012 本发明所述的检测试剂盒还包括含有 PCR 缓冲液、 dNTPs、 MgCl2、 TaqDNA 聚合酶和 模板 DNA 的 PCR 反应体系及阳性对照品。 0013 所述的阳性对照品是含有 B-raf 基因第 15 外显子一段碱基序列和 B-raf 基因第 说 明 书 CN 104031992 A 4 3/6 页 5 18 外显子一段碱基序列的质粒基因组 DNA 混合物， 浓度 2ng/ul。 0014 本发明经过大量试验、 研。

17、究和分析成功研究出能够用于快速、 灵敏、 有效的检测 B-raf 基因 V600 突变的试剂盒。利用这个试剂盒可以检测出人类 B-raf 基因 V600 突变情 况。 0015 本发明涉及的人类 B-raf 基因 V600 突变检测试剂盒不包括对待测样品处理和模 板提取的步骤， 但对于来自甲醛固定石蜡包埋的样品和来自血浆的样品所获得的片段 DNA 依然具有与新鲜组织样品 DNA 同样的扩增和检测能力。 0016 与现有技术相比， 本发明在 PNA 探针区分野生型和突变型基因的基础上， 建立了 多重实时 PCR 检测人类 B-raf 基因 V600 处所有突变的试剂盒， 该试剂盒具有如下有益效果。

18、 和显著进步 ： （1） 特异性强 ： 本发明设计肽核酸探针， 可有效抑制野生型基因组扩增， 只富集突变型 基因扩增， 大大提高了检测特异性， 本发明可有效抑制 100ng 野生型基因扩增， 见图 3。 0017 （2） 灵敏度高 ： 本发明设计的 TaqMan-MGB 探针使用非荧光淬灭基团， 使得背景荧 光值很低， 提高了检测灵敏度。 本技术检出B-raf基因突变基因组DNA的敏感度为0.1%， 即 可检测到 1000 个正常细胞中 1 个突变细胞， 适用于手术和其他微量组织中突变检测， 远远 高于测序法， 见图 4。 0018 （3） 适用于多种样本类型 ： 本技术对标本 DNA 获取质。

19、量要求低， 无论是新鲜组织还 是石蜡组织， 血清， 血浆都能获得理想的检测效果。 0019 （4） 检测时间短， 从样本送检到出结果约 3 个小时完成。 0020 （5） 操作简单， 一次加样， 从 PCR 反应开始到结束， 一直在封闭的反应体系中进行， 不但降低了污染几率， 而且降低了结果出现偏差的几率。 0021 （6）结果判读明确直观 ： 可采用两个 PCR 管两个反应体系确定 1 份待测样本中 B-raf 基因 V600 突变情况。不仅仅依靠 ct 值而且还依靠两孔的 ct 差同时判定， 增加了判 读的准确性。 0022 （7） 安全 ： 整个试剂盒不包含有毒有害物质， 对操作人员和环。

20、境无危害。 0023 总之， 本发明涉及的人类B-raf基因V600突变检测试剂盒适用于临床多种样本类 型选择， 具有特异性强， 灵敏度高， 实验周期短， 操作简单， 安全无毒， 成本低等显著优点。 附图说明 0024 图 1 为本发明检测不含 B-raf 基因 V600 突变的阴性样品扩增曲线图。 0025 图 2 为本发明检测含 B-raf 基因 V600 突变的样品扩增曲线图。 0026 图 3 为本发明检测试剂盒耐受野生型基因组 DNA 扩增曲线图。 0027 图 4 为本发明检测 10ng 野生型基因组背景下灵敏度扩增曲线图。 具体实施方式 0028 以下是本发明的具体实施例， 对本。

21、发明的技术方案做进一步作描述， 但是本发明 的保护范围并不限于这些实施例。 凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发 明的保护范围之内。 0029 以下实施例中所使用的技术， 除非特别说明， 均为本领域的技术人员已知的常规 说 明 书 CN 104031992 A 5 4/6 页 6 技术 ； 所使用的仪器设备、 试剂等， 除非是本说明书特别说明， 均为本领域的研究和技术人 员可以通过公共途径获得的。 0030 实施例 1 ： 临床样本 DNA 的提取 本实施例是从乳头状甲状腺癌患者的石蜡包埋组织切片中提取 DNA, 并对其进行定 量， 作为 PCR 检测的模板。采用 Qiagen 公。

22、司的 QIAamp 石蜡包埋组织提取试剂盒， 具体详述 如下。 0031 1、 实验前的准备 (1) 将水浴锅调到 56。 0032 (2) 将 QIAamp 试剂盒中的 Buffer ATL 和 Buffer AL 于 56放置， 直到沉淀溶解。 0033 2、 样本的处理 (1) 将石蜡切片上多余的石蜡切去 , 将切片切成合适的尺寸， 装在石蜡切片机上。 0034 (2) 将卡尺调到 10m， 然后切蜡块， 直到切下的切片上明显的看到均匀的组织。 0035 (3) 去掉最初的 5 片， 从第 6 片开始， 装入 1.5ml 的 EP 管中， 每管 5 片， 然后编号。 0036 3、 DN。

23、A 提取 (1) 在样本中加入 1ml 二甲苯， 盖上盖子， 轻柔的旋转颠倒混匀， 室温下 14000rpm 离心 3min。 0037 (2) 用移液器吸去上清， 加入 1ml 无水乙醇， 盖上盖子， 轻柔的旋转颠倒混匀， 室温 下 14000rpm 离心 3min。 0038 (3) 用移液器吸尽上清， 将盖子打开， 在 56放置 10min。 0039 (4) 加入 180l Buffer ATL 和 20l 蛋白酶 K， 盖上盖子， 旋涡混匀， 于 56水浴 1h。 0040 (5) 从水浴锅中拿出样本， 轻柔的旋转颠倒混匀， 在干式恒温仪上 90放置 1h。 0041 (6) 用迷你。

24、离心机离心 1min， 使管盖上的液滴落下。 0042 (7) 加入 100mg/ml 的 RNase A 2l， 旋涡混匀后室温放置 2min。 0043 (8) 加入 200l Buffer AL 和 200l 无水乙醇， 立即旋涡混匀。 0044 (9) 用迷你离心机离心 1min， 使管盖上的液滴落下。 0045 (10) 将离心管中的液体加入到吸附柱中， 注意不要吸到沉淀。盖上盖子， 12000rpm 离心 2min。弃去流出物， 将吸附柱置于新的干净的 2ml 的收集管上。 0046 (11) 加入 500l Buffer AW 1， 盖上盖子， 12000rpm 离心 2min。。

25、弃去流出物， 将 吸附柱置于新的干净的 2ml 的收集管上。 0047 (12) 加入500l Buffer AW 2， 盖上盖子12000rpm离心2min。 弃去流出物， 将吸 附柱置于新的干净的 2ml 的收集管上。 0048 (13) 再 12000rpm 离心 2min， 彻底去除乙醇。 0049 (14) 将吸附柱套入一个干净的1.5ml的EP管中， 打开盖子， 在膜中央加入50l Buffer ATE。 0050 (15) 盖上盖子， 在 56水浴 10min。然后 12000rpm 离心 2min。流出物即为提取 的 DNA。 0051 4、 定量 将提取的 DNA 用紫外分光。

26、光度计进行定量， 并稀释 DNA 浓度到 2ng/l。 说 明 书 CN 104031992 A 6 5/6 页 7 0052 实施例 2 ： 实时荧光 PCR 法扩增临床样本 DNA 人类 B-raf 基因 V600 突变检测试剂盒含 2 个 PCR 反应体系分别是检测反应体系和定 量反应体系， 8 联 PCR 反应条偶数孔为检测反应体系扩增突变模板， 用来检测待检样本突变 情况 ； 8 联 PCR 反应条奇数孔为定量反应体系， 用来质控待测样本质量。本实施例采用如表 1 所示的引物、 探针扩增实施例 1 所提取的 DNA 样品。 0053 表 1 ： 试剂盒所提供的引物和探针序列 检测方法。

27、如下 ： (1) 取 10l（2ng/l） 待检测样本加入 Taq DNA 聚合酶 1.2l， 盖紧管盖轻微震荡混匀 离心， 置于冰上， 待用。 0054 (2) 取 8 联 PCR 反应条， 确定奇数偶数孔后轻轻打开管盖。将步骤 （1） 混匀的待用 液分别加到偶数孔检测体系与奇数孔定量体系孔中， 5.6l/ 孔， 盖紧管盖， 离心， 确保试剂 全落在 PCR 反应管的管底 （注意避免剧烈振荡引起基因组 DNA 断裂） 。 0055 (3) 把离心好的 8 联 PCR 反应条放置于荧光定量 PCR 仪中， PCR 反应体系为 ： 1PCR 缓冲液 ： dNTP ： 0.20.8mmol MgC。

28、l2： 2.05.0mmol 引物 ： 0.11.0mol 探针 ： 0.11.0mol TaqDNA 聚合酶 ： 12Units 模板 ： 46l 说 明 书 CN 104031992 A 7 6/6 页 8 总体积 ： 2030l。 0056 (4) 设置 PCR 程序 ： 第一阶段 ： 94 1min ； 第二阶段 ： 94 20s， 70 1s， 60 20s， 40 个循环 ； 第二阶段 40 个循环时， 收集 FAM 和 JOE 信号。 0057 本发明利用 PNA 区分野生型和突变型基因序列， 通过反应体系的 FAM 和 JOE 的荧 光强度来判断检测结果 ； JOE 是内控信号。

29、， 用于检测是否漏加样本及初步判定上样的 DNA 量 是否在允许范围内， JOE 信号应达到设定阈值 （CT 值大于 26） ； FAM 是检测信号， 用于检测是 否存在突变位点 ； 在内控信号达到要求后， 以 FAM 信号达到设定阈值所需的循环次数 CT 值 作为判断标准， 首先定量体系CT值应满足12CT值29， 若定量体系FAM信号Ct值12 说明待测样本 DNA 上样浓度过大 ； 若 Ct 值 29 或无 Ct 值说明待测样本 DNA 上样浓度太低 或已经降解建议重新处理待测样本 DNA 再验证。若实验满足以上条件再判定检测样本的突 变清况， 若检测体系 CT 值 29 且 Ct 10 判定检测样本为突变阳性 ； 若检测体系 CT 值 29 或 unde 或 Ct 10 判定检测样本无突变为阴性。 （注 ： Ct= 检测体系 Ct 值 - 定 量体系 Ct 值） 具体判定标准见表 2。 0058 表 2 ： 试剂盒结果判定参考值 。 说 明 书 CN 104031992 A 8 1/2 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104031992 A 9 2/2 页 10 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 104031992 A 10 。