一种冠耳霉TH130914及其应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104059856 A (43)申请公布日 2014.09.24 CN 104059856 A (21)申请号 201410279668.4 (22)申请日 2014.06.20 CGMCC No.9019 2014.04.08 C12N 1/14(2006.01) A01N 63/04(2006.01) A01P 7/04(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人 肖关丽 地址 650201 云南省昆明市盘龙区黑龙潭云 南农业大学植物保护学院 (72)发明人 肖关丽 杜广祖 陈斌 李正跃 桂富荣 和淑琪 严乃胜 (74)专利代理机构 。

2、北京科亿知识产权代理事务 所 ( 普通合伙 ) 11350 代理人 汤东凤 (54) 发明名称 一种冠耳霉 TH130914 及其应用 (57) 摘要 本发明提供了一种冠耳霉 (Conidiobolus coronatus)TH130914 及 其 应 用，该 冠 耳 霉 TH130914 于 2014 年 4 月 8 日保藏于中国微生物 保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为CGMCC No.9019。 本发明是初次从家蝇体上分离得到的菌 株， 培养比较简单， 生长快速， 产孢量大， 孢子萌发 率高。其分生孢子对家蝇成虫致病力强， 环保无 污染、 不易产生抗药性， 可以广泛地用于家蝇的防 。

3、治。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104059856 A CN 104059856 A 1/1 页 2 1.一种冠耳霉(Conidiobolus coronatus)TH130914， 于2014年4月8日保藏于中国微 生物保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为 CGMCC No.9019。 2. 权利要求 1 所述的冠耳霉 TH130914 在家蝇防治方面的应用。 权 利 要 求 书 CN 10405。

4、9856 A 2 1/5 页 3 一种冠耳霉 TH130914 及其应用 技术领域 0001 本发明属于微生物技术领域， 尤其涉及一种冠耳霉 TH130914 及其应用。 背景技术 0002 家蝇 Musca domestica 是重要的卫生害虫， 它不仅能污染食物使食品变质， 而且还 能通过其机体携带病原微生物传播疾病。对家蝇的防治， 杀虫剂的研制也从第一代有机氯 开发到了第四代拟除虫菊酯卫生杀虫剂。 化学杀虫剂虽然具有见效快、 成本低的优点， 但蝇 类的生活周期短 (15 18 天 )， 分布范围广， 繁殖能力强， 无滞育现象。若常年用药防治次 数过多， 不仅会造成严重的环境污染， 而且易。

5、杀死蝇类的天敌， 并使目标害虫产生抗药性。 这些负面影响使人们在防治中更加关注起生物防治。生物防治对人、 畜、 植物安全， 害虫极 少或不产生抗性， 有利于环境保护。因此， 研究蝇类的生物防治， 避免或减少因不合理使用 化学农药所带来的抗药性问题， 已成为蝇类科学治理和可持续控制的重要课题。 0003 冠耳霉 Conidiobolus coronatus(Cost.)Batko 属于接合菌亚门虫霉目新月霉科 耳霉属。据记载， 冠耳霉可侵染扁豆蚜 Aphis craccivora(Koch.)( 同翅目 : 蚜科 )、 桃蚜 Myzus persicae(Sulzer)(同翅目 ： 蚜科)、 大。

6、青叶蝉Tettigella viridis(Linn.)、 蚁、 舞毒 蛾幼虫、 毛蠓 Psychoda sp 等， 而家蝇的侵染还未见报道。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种冠耳霉 TH130914 及其应用， 旨在克服现有冠耳霉未 发现能寄生家蝇的不足， 通过生物技术手段防治蝇类， 避免或减少因不合理使用化学农药 所带来的抗药性问题。 0005 本发明是这样实现的， 一种冠耳霉 (Conidiobolus coronatus)TH130914， 于 2014 年 4 月 8 日保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为 CGMCC No.9019， 保藏地址为北京。

7、市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号。 0006 本发明的进一步的目的在于提供上述冠耳霉 TH130914 在家蝇防治方面的应用。 本发明于2012年9月， 在云南省玉溪市通海县田间调查时发现冠耳霉在家蝇中大量发生流 行， 引起大量家蝇感染死亡。因此， 该菌株是目前国内首次发现的寄生家蝇、 流行性很强的 虫生真菌， 在防治家蝇中具有很大的开发应用前景。 0007 本发明从罹病家蝇成虫上分离获得冠耳霉野生菌株， 将野生菌株回接于家蝇成虫 上复壮得到冠耳霉菌株， 对该菌株采用按常规方法进行单孢分离、 培养得到纯的、 致病力强 的冠耳霉菌。在光学显微镜 (400 倍 ) 可以看到在该菌株的分生孢子球形。

8、， 具乳突。在 SDAY 培养基上培养时， 生长旺盛， 菌落表面白色像一层雪， 少许脑折状。背面褶皱。初生分生孢 子大小为 (39.423.57)m(32.413.04)m(30.40 45.50)(24.76 40.22) m， L/D (1.220.10)(1.01 1.38)， 次生分生孢子与初生分生孢子形状相似， 但 顶部无乳突， 大小差异较大， 大小为 (23.345.24)m(21.665.45)m(15.87 36.38)(13.28 35.56)m ； 产生柔毛孢子和小分生孢子。在 SDAY 培养基上生长较快， 说 明 书 CN 104059856 A 3 2/5 页 4 接种。

9、后 24 小时开始菌落直径日增长 0.45cm。 0008 相比于现有技术的缺点和不足， 本发明具有以下有益效果 ： 本发明是初次从家蝇 体上分离得到的菌株， 培养比较简单， 生长快速， 产孢量大， 孢子萌发率高。 其分生孢子对家 蝇成虫致病力强， 环保无污染、 不易产生抗药性， 可以广泛地用于家蝇的防治。 附图说明 0009 图 1 是冠耳霉感染的家蝇及病原真菌的形态特征图 ； 其中， a 图为被冠耳霉 TH130914感染的家蝇 ； b图为初生分生孢子 ； c.图为次生分生孢子 ； d图为小分生孢子 ； e图 为柔毛孢子 ； f 图为分生孢子梗。 具体实施方式 0010 为了使本发明的目的。

10、、 技术方案及优点更加清楚明白， 以下结合附图及实施例， 对 本发明进行进一步详细说明。 应当理解， 此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明， 并 不用于限定本发明。 0011 实施例一、 病原菌的分离、 鉴定 0012 1.1 材料与方法 0013 1.1.1 材料 0014 在云南省通海县采集到被一种虫生真菌侵染后的罹病家蝇 Boettcherisca peregrine(Diptera ： Sarcophagidae) 成虫。 0015 萨氏培养基 (SDAY) ： 1蛋白胨 +1酵母粉 +4葡萄糖 +1.5 2琼脂粉 +1000ml 水。 0016 无菌操作条件 ： 所有的器皿和用具。

11、均经高温灭菌锅 (121， 30min)， 接种等操作 均在超净工作台内进行。 0017 培养条件 ： 置于 25光照 (12L ： 12D) 恒温箱中培养， 待菌落形成后， 转移到试管 SDAY 斜面， 培养 2 3 天， 转入 4冰箱储存。 0018 1.1.2 病原菌的分离和纯化 0019 分离 ： 从罹病家蝇成虫尸体上分离病原菌。 将家蝇成虫罹病虫体带回实验室， 将处 理好的家蝇成虫尸体用双面胶粘于培养盖上， 再将该培养皿盖盖于含有 SDAY 培养基的培 养皿上。在温度为 25条件下培养， 长出菌丝后按常规方法进行单孢分离、 培养得到纯的、 产孢能力强的菌株冠耳霉C.coronatus。

12、(Cost.)Batko， 转移到SDAY斜面上生长34天， 在 4冰箱储存。 0020 复壮 ： 将分离到的菌株在 SDAY 上培养 2 3 天后， 产生大量分生孢子， 再将该分 生孢子挑入含 1吐温 -80 的无菌水， 用玻璃棒搅拌均匀， 得到适当浓度 (108孢子 /ml) 的 孢子悬浮液， 用小型喷雾器均匀喷于家蝇成虫体表 ( 以虫体表面湿润为度 )， 保持相对湿度 80以上。收集死虫并保湿， 得到的成虫虫尸再按以上方法分离得到致病力更强的菌株。 0021 纯化 ： 挑取培养基上分生孢子粉， 再次接种在新的培养基上。如此培养 2 3 代， 菌株就被纯化。 0022 1.1.3 病原菌的。

13、鉴定 0023 根据病原菌的培养性状、 菌丝和分生孢子的形态进行鉴定。利用 4010 倍显光学 说 明 书 CN 104059856 A 4 3/5 页 5 微镜， 镜检菌丝、 绒毛孢子和分生孢子的形态。 0024 1.2 结果 0025 从被虫生真菌自然侵染的家蝇成虫虫体上分离获得野生菌株， 在萨氏琼脂培养基 (SDAY) 上培养， 并回接于家蝇成虫复壮获得一菌株， 对该菌株进行单菌丝分离获得纯化的 菌株， 即冠耳霉 TH130914。 0026 在光学显微镜 (400 倍 ) 下， 如图 1 所示， 可以看到初生分生孢子大小为 (39.423.57)m(32.413.04)m(30.40 。

14、45.50)(24.76 40.22)m， L/D (1.220.10)(1.01 1.38)， 次生分生孢子与初生分生孢子形状相似， 但顶 部 无 乳 突， 大 小 差 异 较 大， 大 小 为 (23.345.24)m(21.665.45)m(15.87 36.38)(13.28 35.56)m ； 具柔毛孢子和小分生孢子。 0027 根据田间感染症状 采集罹病虫体室内分离观察， 并根据 中国真菌志第十三卷 ： 虫霉目 (李增智， 2000)有关冠耳霉感染症状、 分生孢子及柔毛孢子和小分生孢子的形态特 征进行鉴定， 确定为冠耳霉。 0028 实施例二、 冠耳霉纯化菌株生物学特性 0029 。

15、2.1 材料与方法 0030 2.1.1 供试菌株 0031 选择纯化后生长旺盛、 生长均匀的一皿作为供试菌株。取菌丝再次接种到 SDAY 上， 于 25的恒温光照 (12L:12D) 培养箱中培养。 0032 2.1.2 菌落生长速率和产孢量的测定 0033 将事先培养好的冠耳霉取一皿用 8mm 的打孔器打孔， 接种于另外一个培养基上， 做 3 个重复， 置于 25的恒温光照 (12L:12D) 培养箱中培养， 每天定时测定其直径并记录， 直到菌落长满培养基为止。用直径为 8mm 的打孔器在培养基相同的位置取菌饼， 加 1吐 温 -80 和 15mL SDY( 萨氏培养液 ) 中， 25、 。

16、80r/min 振荡培养 48h， 再转入 40mL SDY( 萨氏 培养液 ) 中， 恒温箱中培养 48h， 所得菌液为初始接种液。初始接种液每 10ml 转到含 40mL 的 SDY( 萨氏培养液 ) 中在 20， 80r/min 振荡培养 72h， 取菌液 15ml 均匀涂布于水琼脂平 板 (90mm) 上， 用滤纸吸去多余水分， 5 点法放置 5 块盖玻片 (1515mm)。产孢盛期将平板 倒置， 使暴露在平板上主动弹落的分生孢子落下， 每隔 4h 时更换盖玻片， 在显微镜下每个 盖玻片上观察 3 个视野， 记数单位面积上孢子数量。同时， 另取 10mL 菌丝液移至事先称重 的滤纸上，。

17、 用蒸馏水清洗 3 次后， 在 50下烘干 3h 后测定菌丝干重。 0034 单位菌丝体产孢量 ( 孢子 /mg)， C 的计算公式为 C Dr2/(VW)， 其中 D 为累计产 孢浓度 ( 孢子， mm2)， r 为水琼脂平板半径， V 为菌液体积， W 为菌丝生物量 (mg/mL)(Feng et al.， 1998)。 0035 2.1.3 孢子萌发率的测定 0036 将菌株培养 2 3 天， 分别用无菌水收集分生孢子， 制成悬浮液， 用带凹槽的载玻 片测定孢子萌发率。 将孢子悬浮液直接滴在无菌载玻片上， 置于底铺滤纸的培养皿内， 滴加 几滴无菌水保持湿度在 100 RH， 培养 24 。

18、小时后镜检， 每个处理 3 次重复。 0037 2.2 结果 0038 在 SDAY 培养上于 25条件下生长良好， 表 1 结果表明， 培养前 3 天时菌落直径 平均生长速度为 0.76cm/d， 其中在培养 24、 32、 36h 时菌落生长速度分别为 3.34， 4.71 和 说 明 书 CN 104059856 A 5 4/5 页 6 6.02cm/d。 表2结果表明， 该菌株产孢快、 产孢量较高， 培养至第2天时产孢量可达6.7105 孢子/mg。 表3结果表明， 24小时孢子的萌发率平均可以达到85左右， 表明该菌株的生长 情况较好， 生物学活性较好。 0039 表 1 菌落直径的生长速度 0040 0041 表 2 产孢量测定结果 0042 0043 表 3 分生孢子萌发率 (24 小时 ) 0044 0045 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精 说 明 书 CN 104059856 A 6 5/5 页 7 神和原则之内所作的任何修改、 等同替换和改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 104059856 A 7 1/1 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 104059856 A 8 。