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1、(10)申请公布号 CN 104045691 A (43)申请公布日 2014.09.17 CN 104045691 A (21)申请号 201410287874.X (22)申请日 2014.06.25 C07K 7/08(2006.01) A61K 38/10(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 苏州普罗达生物科技有限公司 地址 215000 江苏省苏州市高新区竹园路 209 号 (72)发明人 罗瑞雪 (54) 发明名称 Npas2 蛋白激动剂多肽及其应用 (57) 摘要 本发明涉及药物领域， 具体涉及具有促进 Npas2 蛋白表达， 治疗治疗乳腺癌。
2、的多肽。Npas2 蛋白激动剂多肽及其应用， 具体来说其序列为 EFTQLMLDDDEALDFIIAV 是全新的序列， 该多肽可 体内促进Npas2蛋白表达， 治疗乳腺癌。 提高在体 内荷瘤小鼠生存率 ； 抑制人乳腺癌细胞 MCF-7 的 增殖， 迁移 ； 具有潜在的新药开发价值。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 序列表 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 序列表1页 (10)申请公布号 CN 104045691 A CN 104045691 A 1/1 页 2 1.Npas2 蛋白激动剂多肽， 其特征在于。
3、其序列为 EFTQLMLDDDEALDFIIAV。 2. 一种药物组合物， 其特征在于其包含如权利要求 1 所述多肽与一种以上药学上可接 受的赋形剂、 填充剂、 粘合剂、 润滑剂、 崩解剂、 或稳定剂。 3. 如权利要求 2 所述的药物组合物， 其特征在于， 所述组合物为注射剂。 4. 如权利要求 1 所述的 Npas2 蛋白激动剂多肽， 其特征在于有效剂量为 10mg/kg。 5. 如权利要求 1 所述的 Npas2 蛋白激动剂多肽在制备治疗乳腺癌药物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 104045691 A 2 1/3 页 3 Npas2 蛋白激动剂多肽及其应用 技术领域 0001 本发。
4、明涉及 Npas2 蛋白激动剂多肽 2 及其应用， 具体涉及具有促进 Npas2 蛋白表 达， 治疗乳腺癌的多肽。 背景技术 0002 昼夜节律是生物体的生理功能、 生化指标和生理行为等多种生命现象以 24 小时 为周期呈节律性振荡的一种生物节律。生物钟系统涉及人体系统的生理、 生化和行为的各 个方面， 在整体水平、 细胞水平影响周围器官、 组织和细胞， 控制和调节代谢、 睡眠和觉醒、 内分泌、 免疫以及细胞周期等， 使生命活动协调一致 ； 在分子水平上， 调控与细胞周期、 细胞 增殖和凋亡、 DNA 损伤修复应答有关的一系列细胞因子， 与恶性肿瘤的发生、 发展和治疗等 关系密切。因此昼夜节律。
5、紊乱可引起生物钟基因及其相关蛋白产物的异常表达， 从而促使 肿瘤发生， 加速肿瘤进展。 0003 乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一， 其死亡率的上升速度在女性恶性肿瘤位居第 一。 流行病学的研究表明， 昼夜节律的破坏与乳腺癌的发生密切相关。 Npas2在乳腺癌中表 达明显下调， 与乳腺癌的发生、 病理和临床分期关系密切。Npas2 基因是在哺乳动物中最大 生物钟基因， 是 Clock 的同源基因， 可以通过调控和干扰癌基因、 抑癌基因、 与细胞周期、 细 胞增殖和凋亡相关基因， 在细胞周期调控、 DNA 损伤修复应答和肿瘤生长抑制的过程等多方 面可能参与了乳腺癌的发生和发展。研究表明， Npas。
6、2 蛋白低表达与肿瘤瘤体大小、 浸润深 度有关， Npas2蛋白高表达对乳腺癌发展具有保护性作用。 在乳腺癌癌前病变中Npas2表达 增强， 可以阻止癌前病变恶变。Npas2 蛋白功能降低是乳腺癌发生的一个重要因素。因此， 促进 Npas2 蛋白表达， 抑制乳腺癌发展， 是治疗乳腺癌的新靶点。但是， 尚未有开发成熟的 Npas2 蛋白激动剂多肽的治疗乳腺癌的药物 本专利中的 Npas2 蛋白激动剂多肽已证明在乳腺癌中有效， 具有在其他肿瘤模型中开 发的前景。 发明内容 0004 发明目的 本发明提供全新的序列， 该序列 Npas2 蛋白激动剂多肽， 对乳腺癌具有很好的疗效。 0005 技术方案。
7、 Npas2 蛋白激动剂多肽， 其特征在于其序列为 EFTQLMLDDDEALDFIIAV。 0006 Npas2 蛋白激动剂多肽在制备治疗乳腺癌药物中的应用。 0007 有益效果 利用固相合成法化学合成 Npas2 蛋白激动剂多肽 2， 该多肽具有全新的序列， 该多肽可 体内促进 Npas2 蛋白表达， 治疗乳腺癌。提高在体内荷瘤小鼠生存率 ； 抑制人乳腺癌细胞 MCF-7 的增殖、 迁移 ； 具有潜在的新药开发价值。 说 明 书 CN 104045691 A 3 2/3 页 4 具体实施方式 0008 本发明涉及的多肽由吉尔生化 （上海） 合成。 0009 实施例 1 Npas2 蛋白激动。
8、剂多肽对人乳腺癌细胞 MCF-7 增殖的作用。 0010 采用MTT 比色法。 将对数生长的人乳腺癌细胞MCF-7， 以 1.0105加入 96 孔培养 板中， 培养 24h， 实验孔、 阳性药物对照孔分别加入不同浓度的实验药物 Npas2 蛋白激动剂 多肽3和阳性对照药物长春新碱 ； 空白组加入相同体积的溶剂。 每孔设五个复孔， 培养 48h， 分别在 0h、 2h、 8h、 14h、 20h、 24h、 36h、 48h 每孔加入 MTT， 作用 4h 后， 加入 DMSO， 孵育 30min， 在酶标仪 620nm 处测定吸光度 A 值， 按公式肿瘤细胞生长抑制率 （1- 实验组吸光值 。
9、/ 对 照组吸光值） 100。对人乳腺癌细胞 MCF-7 的最大增殖抑制率为 92.81%。 0011 表 1. 多肽对人乳腺癌细胞 MCF-73 细胞增殖抑制作用 实施例 2 Npas2 蛋白激动剂多肽对人乳腺癌细胞 MCF-7 增殖的作用。 0012 采用 MTT 比色法。将对数生长的 G519 细胞， 以 1.0105 加入 96 孔培养板中， 培 养 24h， 实验孔、 阳性药物对照孔分别加入不同浓度的实验药物 Npas2 蛋白激动剂多肽 3 和 阳性对照药物长春新碱 ； 空白组加入相同体积的溶剂。每孔设五个复孔， 培养 48h， 分别在 0h、 2h、 8h、 14h、 20h、 2。
10、4h、 36h、 48h 每孔加入 MTT， 作用 4h 后， 加入 DMSO， 孵育 30min， 在酶标 仪 620nm 处测定吸光度 A 值， 按公式肿瘤细胞生长抑制率 （1- 实验组吸光值 / 对照组吸 光值） 100。对 Mino 的最大增殖抑制率为 72.71%。 0013 实施例 3 Npas2 蛋白激动剂多肽 1 对人乳腺癌细胞 MCF-7 裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制试验 取对数生长期的人乳腺癌细胞 MCF-7 细胞株， 在无菌条件下制备成 5107/ml 细胞悬 液， 以 0.1ml 接种于裸鼠右侧腋窝皮下。用游标卡尺测量裸鼠移植瘤直径， 待肿瘤生长至 100-200mm3后。
11、将动物随机分组。 使用测量瘤径的方法， 动态观察被试多肽的抗肿瘤效果。 肿 瘤直径的测量次数为每 2 天测 1 次。给药方式均采用尾静脉注射。阴性对照组注射等量生 理盐水， 每天 1 次 ； 紫杉醇组 10mg/kg， 每周给药 1 次 ； 恩度组 2.5mg/kg， 每天给药 1 次 ； 多 肽高中低组分别以 20mg/kg、 10mg/kg、 5mg/kg， 每天给药 1 次。试验结束后， 小鼠处死， 手术 说 明 书 CN 104045691 A 4 3/3 页 5 剥取瘤块称重。 0014 表 2 多肽对人乳腺癌细胞 MCF-7 裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用 结果 ： 多肽对人乳腺癌。
12、细胞 MCF-7 裸鼠移植瘤生长抑制试验结果表明， 与阴性对照组 相比， 多肽 20mg/kg、 10mg/kg 和 5mg/kg 组对人乳腺癌细胞 MCF-7 移植瘤的生长均具有极显 著性的抑制作用。 与阳性对照组紫杉醇相比， 多肽对实验动物的体重没有明显影响， 未见明 显的毒副反应， 紫杉醇毒性较大， 动物体重下降， 实验过程中动物有死亡。 说 明 书 CN 104045691 A 5 1/1 页 6 SEQUENCE LISTING 苏州普罗达生物科技有限公司 Npas2 蛋白激动剂多肽及其应用 1 PatentIn version 3.3 1 19 PRT 人工序列 1 Glu Phe Thr Gln Leu Met Leu Asp Asp Asp Glu Ala Leu Asp Phe Ile 1 5 10 15 Ile Ala Val 序 列 表 CN 104045691 A 6 。